一種致內皮細胞損傷的抗高血壓藥物篩選模型的構建及應用的製作方法

2023-05-24 02:19:46 3

一種致內皮細胞損傷的抗高血壓藥物篩選模型的構建及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種同型半胱氨酸聯合去甲腎上腺素致人靜脈內皮細胞損傷的抗高血壓藥物篩選模型，通過加入一定濃度的同型半胱氨酸和去甲腎上腺素到體外培養的內皮細胞中，造成細胞損傷，以此建立細胞損傷模型。利用該模型，加入不同降血壓天然藥物，通過丙二醛(MDA)釋放水平檢測細胞活力，觀察NO生成量，體外篩選以修復內皮細胞損傷為機制的抗高血壓天然藥物。本發明開創性地構建了一種接近高血壓病理條件下的損傷模型，藥物作用機制明確，適合大規模降血壓天然藥物的篩選。
【專利說明】一種致內皮細胞損傷的抗高血壓藥物篩選模型的構建及應
用
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞生物學【技術領域】，有關一種內皮細胞損傷模型建立，特別是同型半胱氨酸聯合去甲腎上腺素致內皮細胞損傷的抗高血壓天然藥物的篩選方法。
【背景技術】
[0002]同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是一種含巰基的胺基酸,是甲硫氨酸和半胱氨酸代謝過程中的一個重要中間產物，其本身不參加蛋白質的合成。同型半胱氨酸在正常人血眾中的濃度通常為5.0 μ mol.L-1~16 μ mol.L—1。高同型半胱氨酸血症是一種以血漿中HCY濃度升高為主的疾病，輕度、中度和重度高同型半胱氨酸血症的血漿濃度分別為16 μ mol.L1 ~30 μ mol.L 1 > 31 μ mo I.L1 ~100 μ mol.L1 和大於 100 μ mol.L1,少數病人血漿中的HCY濃度可達到500 μ mol -1以上，發展成為高同型半胱氨酸尿症。大量流行病學調查和臨床病例研究已證實，血液中同型半胱氨酸的濃度升高是獨立於其它已知危險因素的致動脈粥樣硬化危險因子。
[0003]有研究發現血液中HCY濃度升高可損傷血管內皮細胞，並能誘導或抑制內皮細胞中多種基因的表達。高同型半胱氨酸血症誘發心血管疾病的主要作用機制為氧化應激機制，HCY在自身氧化過程中，可產生超氧化物陰離子、過氧化氫及羥基等活性氧物質(reactive oxygen species, R0S),其可與NO反應加速NO失活，降低NO生物利用度；HCY本身也能與NO反應，為降解HCY的重要途徑之一，直接導致NO濃度降低，使內皮細胞明顯受損傷；HCY還能使低密度脂蛋白自身氧化，生成氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipo-protein, 0X-LDL),而後者可被巨噬細胞攝取並轉變為泡沫細胞導致血管內皮細胞功能的進一步損傷，同時可影響一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, N0S)的表達進一步使NO合成減少。
[0004]去甲腎上腺素(Nor印in印hrine，NA)是腎上腺素去掉N-甲基後形成的物質，在化學結構上也屬於兒茶酚胺。它既是一種神經遞質，主要由交感節後神經元和腦內腎上腺素能神經末梢合成和分泌，是後者釋放的主要遞質；也是一種激素，由腎上腺髓質合成和分泌，但含量較少。循環血液中的去甲腎上腺素主要來自腎上腺髓質。血管內皮細胞所處的環境中，NA濃度較高，血管內皮細胞受到NA調節的同時，也能夠滅活NA。血管內皮細胞攝入NA後，在兒茶酹氧位甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)和單胺氧化酶(monoamine oxidase,ΜΑ0)的作用下分別形成間甲去甲腎上腺素(normetanephrine)和3-甲氧-4-輕扁桃醒(3, 4-dihydroxyphenylglycoaldehyde, D0PGAL),後者再經醒脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ADH)和醒還原酶(aldehyde reductase, ADR)催化形成 3_ 甲氧-4-輕扁桃酸(3-methoxy-4-hydroxymandelic acid, VMA)和 3_ 甲氧-4-輕苯乙二醇(3-methoxy-4-hydroxyphenyIethylene glycol, M0PEG)。
[0005]COMT是血管內皮細胞滅活去甲腎上腺素等兒茶酚胺類物質的主要途徑，當NA等兒茶酚胺類物質在細胞中過度積累濃度過高時，兒茶酚胺類物質中含有的鄰苯酚基團能夠發生自養化或催化氧化過程，生成醌及半醌類物質，同時產生氧自由基，細胞內的氧自由基能夠對細胞膜產生損害。在COMT的存在下，以S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-Adenosy 1-L-methionine, SAM)為甲基供體,可將兒茶酹胺中的鄰苯酹基團甲基化，這是血管內皮細胞滅活兒茶酚胺類物質的始動反應，同時SAM轉化為S-腺苷-L-同型半胱氨酸(S-Adenosy 1-L-homocysteine, SAH),其在水解酶的作用下水解為HCY。在高同型半胱氨酸血症等情況下，細胞內的HCY濃度較高，是水解反應向逆反應方向進行，SAH濃度升高，SAH是COMT的非競爭性抑制劑，抑制COMT對兒茶酚胺類物質的甲基化反應，從而使含鄰苯酚基團的兒茶酚胺類物質積累，產生氧自由基損傷血管內皮細胞。
[0006]MDA是細胞氧化損傷時的副產物，當細胞遭受氧自由基攻擊時，生成微量的MDA，由於MDA在特定的可見光波長下有較強的吸收，所以將微量的MDA作為細胞損傷的指標。NO具有強大的血管保護作用:第一、NO與鄰近的平滑肌細胞裡的鳥苷酸環化酶作用，使肌肉鬆弛，血管擴張，增加血流量，與交感神經系統和腎素-血管緊張素系統的縮血管作用相拮抗，共同維持血管舒縮平衡;第二、NO能抑制血小板聚集和粘附，防止血栓形成。當血管受損時，血液中的血小板會凝結形成塞子凝結在血管壁，阻止過多的血流，進一步的凝結，就會使血液凝成血塊，阻止血液流動，而NO能抑制血小板進一步凝結和粘結的作用；第三、NO能減少細胞間粘附因子-1、血管細胞粘附因子-1等的表達，阻止白細胞粘附到內皮或遷移到血管壁內；第四、NO能夠抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移；第五、NO降低血管內皮通透性，抑制低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)氧化，並逆轉異常的內皮氧化還原狀態，因此被稱為「內源性抗動脈粥樣硬化因子」。
[0007]在已進行的HCY致血管內皮細胞損傷的實驗研究中，採用的HCY濃度大多數在IOmmol.L-1以上，該濃度遠遠高於高同型半胱氨酸血症的病理濃度；同時還發現當低於IOmmol.L-1的HCY單獨作用於血管內皮細胞時，則無明顯的毒性損傷效應。據此推測上述IOmmol -L-1以上的高濃度HCY致血管內皮細胞的損傷作用可能為其本身的藥理毒效應。因此，進一步研究較低濃度(≤IOmmol ^LlHCY致血管內皮細胞損傷作用，對於深入闡明HCY致AS的確切機制具有重要意義。
[0008]以體外培養的人臍靜脈內皮細胞為研究對象，觀察在生理濃度(10_9mol.Ι^)ΝΑ存在的情況下，較低濃度(IOymol -T1~10000 μ mol -L-1)的HCY對血管內皮細胞的損傷效應，目前並未有報導。也沒有該損傷模型應用於天然降壓藥物篩選的先例。

【發明內容】

[0009]本發明第一個目的是構建了一種致人臍靜脈內皮細胞ECV-304損傷的細胞模型，將同型半胱氨酸聯合去甲腎上腺素加入細胞培養液中，兩者共同作用引起細胞MDA釋放增加，NO生成量減少，得到ECV-304細胞損傷模型。
[0010]本發明第二個目的是應用上述方法構建的細胞損傷模型進行降血壓天然藥物的篩選。根據損傷形成依賴NO信號轉導途徑，可以將其作為篩選降壓藥物的靶點。具體方法是將候選降血壓藥物加入構建好的細胞損傷模型中，通過檢測MDA釋放量，NO生成量篩選出對內皮細胞起保護作用的藥物。
[0011]本發明提供了同型半胱氨酸聯合去甲腎上腺素構建ECV304細胞損傷模型的降血壓藥物篩選方法，根據損傷機制將NO作為靶點，提高了降血壓天然藥物保護內皮細胞ECV-304的針對性，適合高通量的降血壓天然藥物篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1不同濃度HCY與生理濃度NA對MDA的影響。
[0013]圖2不同濃度HCY與生理濃度NA對NO的影響。
[0014]圖3不同藥物對HCY與NA聯合損傷的ECV-304細胞中MDA的影響。
[0015]圖4不同藥物對HCY與NA聯合損傷的ECV-304細胞中NO的影響。
【具體實施方式】
[0016]藥品與試劑
[0017]
【權利要求】
1.一種同型半胱氨酸聯合去甲腎上腺素致人靜脈內皮細胞損傷的抗高血壓藥物篩選方法，通過以下方法實現:將同型半胱氨酸和去甲腎上腺素混合後加入細胞培養基中，內皮細胞在生理環境中，NA濃度較高，如果NA在細胞中過度積累到一定濃度會產生氧自由基對細胞膜產生損害，HCY通過氧化應激機制產生活性氧(ROS)，ROS可以與NO反應，降低NO利用度，兩者共同作用加劇損傷，得到細胞損傷模型，以丙二醛(MDA)釋放量，NO生成量作為衡量模型損傷程度的標準。
2.根據權利要求1所述的同型半胱氨酸，其濃度範圍在10μ mol.L—1~1000Oymol.L1致血管內皮細胞損傷作用。
3.根據權利要求1所述的去甲腎上腺素，其濃度範圍在生理條件下10_9mol.L'
4.根據權利要求1所述的人靜脈內皮細胞，其特徵在於:所述人靜脈內皮細胞為ECV-304 細胞。
5.根據權利要求1所述的一種同型半胱氨酸聯合去甲腎上腺素致人臍靜脈內皮細胞損傷的抗高血壓藥物篩選方法應用於選擇具有保護內皮細胞作用，修復內皮細胞功能的抗高血壓天然藥物。
【文檔編號】C12N5/071GK103555650SQ201310393735
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】許激揚, 卞筱泓, 許娟, 沃龍飛, 趙剛剛 申請人:中國藥科大學