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一種豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙的製作方法

2023-05-23 20:23:56

一種豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種家畜疫病感染與免疫的鑑別檢測器具,特別是涉及一種豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙,由支撐板,樣品墊,金標墊,檢測膜和吸水墊構成,檢測膜上含有強毒檢測線T1「│」,疫苗毒檢測線T2「│」和質控線C「│」印跡。鑑別檢測時,在檢測膜顯現三條紅色條帶「│││」為豬偽狂犬強毒感染;兩條紅色條帶「││」為豬偽狂犬疫苗毒疫苗免疫;只顯現一條紅色條帶「│」為豬偽狂犬病毒陰性。本鑑別檢測試紙特異性強,敏感性高,反應譜廣,可檢測現有疫苗毒株和和多數流行強毒株,且操作簡便、快速,可廣泛用於豬偽狂犬病毒感染與免疫的鑑別檢測,易於在生產實踐中推廣應用。
【專利說明】一種豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種家畜疫病感染與免疫的鑑別檢測器具,特別是涉及一種豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙。

【背景技術】
[0002]偽狂犬病((Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的多種動物共患傳染病,可感染牛、豬、犬、羊、狐狸和貓等。豬是偽狂犬病的傳染源和自然貯存宿主,豬感染PRV後表現為發熱,仔豬神經症狀、高死亡率,大中豬呼吸道症狀,母豬流產等臨床特點。在2010年,偽狂犬病是我國規模化豬場進行疫病控制最為理想的疾病之一,許多豬場已經達到免疫無感染狀態。然而在2011年,一些Bartha-K61疫苗免疫的豬場出現了變異的豬偽狂犬病病毒,表明傳統的gE基因缺失疫苗不能提供足夠的免疫保護。河南省豬群偽狂犬病的感染率自2005年以來呈現整體下降趨勢,臨床上以散發或非典型病例為主。但是,從2011年底開始,我省部分豬場突發偽狂犬疫情,很快在省內各地爆發,廣泛流行;而且,部分豬場附近的羊、犬、貓、狐狸等動物也出現感染死亡狀況。因此,現階段我國豬偽狂犬病的防控變得更為棘手和複雜。
[0003]PRV 屬於抱疫病毒科(Herpesviridae), a_ 抱疫病毒亞科(Alphaherpesvirinae)的成員,基因組為線性雙鏈DNA,大小約150 kb。整個PRV基因組至少含有70個基因,編碼70-100餘種蛋白。目前研究發現PRV可編碼11個糖蛋白:gB、gC、gD、gE、gG、gH、g1、gK、gL、gM和gN。gB、gH、gL和gM皰疹病毒科中保守,而且gB、gH和gL對所有皰疹病毒在細胞培養物中進行複製都是必需的。gB蛋白能夠誘導中和抗體的產生,與免疫保護相關。PRV gE蛋白最早被稱為gl蛋白。1960年代篩選製備的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE缺失。在二十世紀80年代中期,通過DNA重組技術構建了 gE缺失的PRV突變株;在此基礎上,將TK進行缺失使PRV病毒得到進一步致弱。許多gE缺失疫苗均能夠預防攻毒感染或減輕攻毒感染造成的臨床症狀。雖然當前也存在gC和gG缺失的PRV疫苗,但在許多國家僅允許豬群使用gE缺失疫苗。從1990年代到2011年底,我國80%以上豬群均使用了gE基因缺失疫苗Bartha進行免疫接種。gE疫苗和gE抗體診斷配套使用用於PRV淨化的前提是所有流行毒株均表達gE蛋白,而且流行株感染的動物均產生gE蛋白的抗體。目前幾乎所用PRV野毒株均表達gE蛋白。通過gE基因缺失疫苗與gE抗體診斷方法的聯合使用,一些歐洲國家如德國、奧地利、瑞典、丹麥和英國及美國已成功在家養豬群中淨化了豬偽狂犬病。我國政府在2011年制訂了《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》,提出到2015年,原種豬場豬偽狂犬病達到淨化標準;到2020年,全國所有種豬場豬偽狂犬病達到淨化標準的目標。然而病原體的淨化是一項長期而且艱巨的任務。如果要實現完全淨化或接近淨化狀態可能需要100年時間甚至更長;例如美國的豬偽狂犬病首次出現在1909年,其淨化計劃始自1989年,到2005年絕大多數淨化項目得以完成。即便如此,野豬群中PRV病毒的存在對家豬再次感染PRV造成了很大的威脅。因此,建立簡便、快速、特異、敏感的鑑別診斷方法區分疫苗免疫動物及病毒感染動物十分必要。
[0004]偽狂犬病的鑑別診斷方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)等,其中ELISA試劑盒是市場上最為常用的鑑別診斷商品。商品化的ELISA試劑盒分別使用間接或阻斷ELISA,由於臨床血清較為複雜,間接ELISA的特異性相對於阻斷ELISA稍差。阻斷ELISA使用臨床豬血清阻斷gE蛋白特異性單抗的結合,特異性與敏感性較高;然而,阻斷ELISA也存在先天的缺點。阻斷ELISA使用的單抗針對的是在豬體內具有免疫優勢的表位,一旦PRV病毒在gE基因發生變異就有可能使得單抗識別無效。雖然阻斷ELISA仍然能夠特異檢測出我國新出現的變異的PRV病毒抗體,但單抗識別無效的可能性依舊存在。所以,依據現階段的PRV變異毒株開發新的鑑別診斷方法勢在必行。免疫層析試紙是在單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的一種新型體外檢測技術,是理想的即時檢測(point-of-care test,P0CT)和現場檢測技術,其具有更加靈敏、特異、簡便、快速等優點,尤其是可實現「傻瓜式」操作,即不需要任何附加儀器設備即可進行現場檢測,並在1-5分鐘內判定結果,廣泛應用於各種分析物的定性和半定量快速檢測,包括抗原、半抗原、抗體和核酸等,已成為當今最快速敏感的免疫學檢測技術之一。河南省動物免疫學重點實驗室從1995年開始系統開展免疫試紙快速檢測技術研究,率先在國際上研製成功動物疫病病原和抗體檢測膠體試紙產品一一雞傳染性法氏囊病快速診斷試紙和豬旋毛蟲抗體檢測紙,建立了動物疫病快速檢測試紙研發技術平臺,截至目前已成功開發出動物疫病抗原、抗體以及藥物殘留檢測等系列快速檢測試紙產品,大大推動了該技術的應用和發展。本發明針對PRV野毒感染與疫苗免疫鑑別診斷的關鍵技術問題,篩選鑑定可區分PRV強、疫苗毒株的高親和力配對單克隆抗體,建立基於免疫層析試紙的蛋白晶片技術平臺,研製豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙,建立適用於養殖基層和臨床檢測的快捷、簡便的豬偽狂犬野毒感染和疫苗免疫聯檢技術,實現對豬偽狂犬病毒野毒感染的實時監測,為我國豬偽狂犬防控與淨化提供技術支撐,對豬偽狂犬疫情監測和防控有重要意義。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是:研製適用於豬偽狂犬感染與免疫鑑別檢測的豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙,本試紙特異、敏感、快捷、簡便,易在生產實踐中推廣應用。
[0006]本發明的技術方案是:一種豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙,由支撐板,樣品墊,金標墊,檢測膜和吸水墊構成,金標墊為吸附膠體金標記抗豬偽狂犬病毒gB蛋白單克隆抗體mAbl的玻璃纖維,檢測膜為印跡強毒檢測線Tl、疫苗毒檢測線T2和質控線C的硝酸纖維素膜,由樣品端至手柄端的排列為強毒檢測線Tl/疫苗毒檢測線T2/質控線C:「I I I 」,強毒檢測線Tl為抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體gE蛋白mAb2印跡「 I 」,疫苗毒檢測線T2為抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl或抗豬偽狂犬病毒gB蛋白單克隆抗體mAb3印跡「 I 」,質控線C為抗小鼠IgG抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA印跡「 I 」。鑑別檢測時,豬偽狂犬強毒感染在檢測膜顯現強毒檢測線Tl,疫苗毒檢測線T2和質控線C三條紅色條帶「I I I 」,豬偽狂犬疫苗毒疫苗免疫在檢測膜顯現疫苗毒檢測線T2和質控線C兩條紅色條帶「 I I 」,無豬偽狂犬病毒則只顯現質控線C 一條紅色條帶「丨」。
[0007]以豬偽狂犬病毒gB和gE重組蛋白為免疫抗原,通過雜交瘤細胞技術生產鑑定抗豬偽狂犬病毒gB和gE蛋白單克隆抗體,利用免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)篩選區分豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒的單克隆抗體,以疊加酶聯免疫吸附試驗(ELISA)篩選識別不同抗原表位的單克隆抗體。用於膠體金標記的單克隆抗體mAbl和疫苗毒檢測線T2的單克隆抗體mAb3均特異識別豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒疫苗株,分別識別豬偽狂犬病毒gB蛋白的不同抗原表位,用於強毒檢測線T2的單克隆抗體mAb2特異識別豬偽狂犬病毒強毒株gE蛋白,但不與疫苗毒株反應。同時,以IPMA篩選與豬偽狂犬病毒反應譜廣的單克隆抗體,膠體金標記單克隆抗體mAbl和疫苗毒檢測線T2單克隆抗體mAb3可識別豬偽狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒疫苗以及多數流行強毒株,強毒檢測線Tl單克隆抗體mAb2可識別多數豬偽狂犬病毒流行強毒株。以豬偽狂犬病毒疫苗毒Bartha株為免疫抗原製備抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl,可用於疫苗毒檢測線T2印跡。以小鼠IgG為免疫抗原製備羊抗小鼠IgG多克隆抗體pAb2,pAb2和金黃色葡萄球菌SPA均可用於質控線C印跡。
[0008]本發明有益的積極效果:豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙實現了豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒的同步聯檢,可有效鑑別豬群豬偽狂犬強毒感染與疫苗免疫,並且操作簡單,人人都可操作,能較好滿足不同層次人員的需要,如疫病監測、海關檢疫、衛生防疫、集約化養殖到個體養殖等,易於大範圍推廣應用,具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。檢測試紙條具有下列各項優點:
(I)強毒和疫苗毒聯檢。豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙在檢測膜上含有識別豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒的疫苗毒檢測線和識別強毒但不識別疫苗毒的強毒檢測線,可同步進行豬偽狂犬病毒的強毒株和疫苗毒株聯檢,實現豬偽狂犬的強毒和疫苗毒鑑別檢測。
[0009](2)特異性強,敏感性高。豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙以可區分豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒的高親和力配對單克隆抗體為基礎製備而成,單克隆抗體的特異性強和敏感性高,金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成,二者通過異性電荷間的範德華力相結合,膠體金對標記抗體的反應性影響很小,且具有較高的標記率。因此,鑑別檢測試紙具有較高的特異性和敏感性。
[0010](2)操作簡便快速。使用鑑別檢測試紙時無需任何其它試劑,只要將其插入待檢樣品10秒左右,在2分鐘內即可判定檢測結果。
[0011](3)顯示檢測結果形象、直觀準確。鑑別檢測試紙以顯示紅棕色「 I 」、「 I I 」和「I I I 」印跡作為檢測的陰性、疫苗毒和強毒陽性標記,即在檢測膜上顯示一條棕紅色條帶「 I 」為豬偽狂犬病毒陰性,表示被檢測樣品無疫苗毒疫苗或強毒感染,兩條棕紅色條帶「 I I 」為豬偽狂犬病毒疫苗毒陽性,表示被檢樣品為疫苗毒疫苗免疫,三條棕紅色條帶「I I I 」為豬偽狂犬病毒強毒陽性,表示被檢樣品為強毒感染,結果判定形象、直觀、準確,簡單明了,不易出現假陰性和假陽性誤判。
[0012](4)成本低,投資少。使用鑑別檢測試紙,不需另配儀器設備及其它試劑,使現場檢測一步到位,成本低廉,投資少,見效快。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0014]圖1是豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙側視結構示意圖。
[0015]圖2是豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙俯視結構示意圖。
[0016]圖中,1.支撐板,2.樣品墊,3.金標墊,4.檢測膜,5.吸水墊,6.強毒檢測線Tl印跡,7.疫苗毒檢測線T2印跡,8.質控線C印跡,9-1.樣品端保護膜,9-2.手柄端保護膜,10.標記線。
[0017]【具體實施方式】豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙可廣泛應用於豬群豬偽狂犬病毒強毒感染和疫苗免疫的鑑別檢測。製備豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙,首先需製備豬偽狂犬病毒免疫抗原,進而製備抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體和單克隆抗體,並篩選區分豬偽狂犬強毒和疫苗毒的單克隆抗體,識別豬偽狂犬強毒和疫苗毒的單克隆抗體mAbl用於製備膠體金標記物,識別豬偽狂犬強毒而不識別疫苗毒的單克隆抗體mAb2用於印製強毒檢測線印跡「 I 」,識別豬偽狂犬強毒和疫苗毒的多克隆抗體pAbl或單克隆抗體mAb3用於印製疫苗毒檢測線印跡「 I 」,其次需製備羊抗小鼠IgG抗體或金黃色葡萄球菌SPA,用於印製質控線印跡「 I 」。
[0018](I)豬偽狂犬病毒免疫抗原的製備。
[0019](1.1)豬偽狂犬病毒gB重組蛋白的製備
以PCR擴增PRVgB蛋白的中和表位富集區,將目的基因克隆入原核表達載體pET-28a,構建gB基因重組表達質粒pET-gB,經I mol/L IPTG誘導,在大腸桿菌中高效表達gB重組蛋白,Western blot檢測表明gB表達蛋白均能被PRV陽性血清特異識別,具有良好的反應性。採用Ni柱親和層析純化及稀釋復性技術獲得純度約90%的gB重組蛋白15mg/L。
[0020](1.2)豬偽狂犬病毒gE重組蛋白的製備
以PCR擴增PRVgE蛋白的表位富集區,將目的基因克隆入原核表達載體pET-28a,構建gB基因重組表達質粒pET-gE,經0.4 mol/L IPTG誘導,在大腸桿菌中高效表達gE重組蛋白,Western blot檢測表明gE表達蛋白均能被PRV強毒陽性血清特異識別,具有良好的反應性。採用Ni柱親和層析純化技術獲得純度約90%的gE重組蛋白12mg/L。
[0021](2)抗豬偽狂犬病毒單克隆抗體的製備。
[0022](2.1)雜交瘤細胞株的建立。
[0023]分別將豬偽狂犬病毒gB和gE重組蛋白與弗氏免疫佐劑等量混合,充分乳化,以50mg-100 mg/只免疫BALB/c系小鼠3次,每次間隔15-30天;第3次加強免疫後3_4天,將免疫小鼠眼球放血,拉頸致死,於75%酒精浸泡5-10 min,無菌取其脾臟;剪碎並經100目尼龍網過濾,1000 r/min離心10 min,收集脾細胞;將I X 18的脾細胞與2-5 X 10 7的SP2/0骨髓瘤細胞混合,1000 r/min離心10 min,棄上清,在37°C的水浴中將0.7-1 ml的40%_50%PEG 4000 (pH8.5-9.0)緩緩加入細胞,溫育I min後,緩慢加入無血清1640培養基15 ml,以終止PEG的作用,37°C水浴5-10 min, 1000 r/min離心10 min,棄上清,將細胞重懸於HAT選擇培養基中,並加入96孔培養板(100 ml-200 ml/孔),置37°C 5% CO2培養箱中培養。培養7-10天後,取雜交瘤細胞培養上清以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)篩選陽性雜交瘤細胞。以豬偽狂犬病毒標準強毒感染倉鼠腎細胞(BHK-21),經甲醇固定後,5%脫脂奶37°C封閉I h ;加待檢細胞培養上清50mL/孔,設HAT培養基和小鼠免疫血清為陰性和陽性對照;加1:500稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體(50 mL/孔),37°C作用30 min ;每步反應後均用含0.05% Tween-20的PBS充分洗滌;以底物AEC室溫顯色10-20 min,用水衝洗中止顯色後,在顯微鏡下觀察顯色結果。選取強陽性、細胞生長旺盛的克隆孔進行連續3次有限稀釋克隆化,擴大培養後凍存細胞,分別建立抗豬偽狂犬病毒gB蛋白和gE蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株8株和12株。
[0024](2.2)單克隆抗體的製備:以體內誘生腹水製備單抗。取經降殖烷或液體石蠟致敏的經產Balb/c小鼠,腹腔注射對數生長期的雜交瘤細胞17個/只,7 d?10 d後抽取腹水,離心後取上清,分裝,凍存。
[0025](2.3)單克隆抗體的鑑定 (2.3.1)單克隆抗體的抗體效價
以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定雜交瘤細胞培養上清和腹水的單抗效價,單抗上清和腹水的ELISA效價分別在1:640和1: 5 X 15以上,IPMA效價分別在1:16和1:8000以上。
[0026](2.3.2)單克隆抗體的特異性
用PRV標準毒株、流行毒株和疫苗毒株感染倉鼠腎細胞(BHK-21),以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定單抗與PRV流行毒株的反應性,篩選獲得同時特異識別PRV標準毒株、流行毒株和疫苗毒株的gB蛋白單克隆抗體6株,而特異識別PRV標準毒株和流行毒株但不識別疫苗毒株的單克隆抗體8株。以免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)檢測上述14株單克隆抗體與疫苗株和流行毒株的反應譜,證明用於膠體金標記和疫苗毒檢測線T2的gB蛋白單克隆抗體可識別豬偽狂犬病毒疫苗毒株以及多數流行強毒株,用於強毒檢測線的gE蛋白單克隆抗體可識別多數豬偽狂犬病毒流行強毒株,均具有較廣的PRV反應譜。
[0027](2.3.3)單克隆抗體識別抗原表位分析
以阻斷ELISA或疊加ELISA對PRV單克隆抗體識別的抗原表位進行分析,篩選獲得分別識別豬偽狂犬病毒gB蛋白不同抗原表位的單克隆抗體mAbl和mAb3,其分別用於膠體金標記和疫苗毒檢測線T2印跡;獲得特異識別豬偽狂犬病毒標準毒株和流行毒株,而不與疫苗毒疫苗株反應的gE蛋白單克隆抗體mAb2,用於強毒檢測線Tl印跡。
[0028](2.3.3.1)阻斷ELISA:以HRP分別標記單克隆抗體,ELISA阻斷試驗鑑定單克隆抗體識別抗原表位的特異性,首先在gB或gE重組蛋白包被的酶標板中逐行加入未標記的單抗,設PRV陽性血清、陰性血清和PBS對照,37°C作用I h ;然後逐列加入HRP標記的單抗,37°C作用I h ;以底物TMB進行顯色,讀取各檢測孔的OD45tl值。顯著抑制酶標單抗結合的未標記單抗識別相同或相近的抗原表位,而對酶標單抗結合無明顯影響的未標記單抗則識別不同的抗原表位。
[0029](2.3.3.2)疊加ELISA:首先利用包被抗原的酶標板以間接ELISA測定各單抗的工作濃度,繪製抗原飽和曲線。在疊加ELISA試驗中,根據抗原飽和曲線適當稀釋單抗,並配對加入酶標板各孔,37°C孵育I h?2 h ;分別加入酶標二抗和TMB進行顯色,讀取各孔OD45tl值,按下列公式計算疊加係數(AI):AI=[2'0D1+2/ (OD^OD2)-1] '100%,其中0D1+2為配對單抗孔的OD45tl值,OD OD 2為兩個獨立單抗孔的OD 45(|值。兩個單抗的Al值小於40%判為識別相同或相近抗原表位;AI值大於40%判為識別不同抗原表位。
[0030](2.4)單克隆抗體的純化:以辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化單抗IgG。取I mL小鼠腹水,加入2 mL 0.06 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH 5.0),以0.1 mol/L HCl調至pH 4.5 ;於室溫攪拌下,逐滴加入33 mL辛酸,4°C靜置2 h,15000 r/min離心30 min,棄沉澱;在離心上清中加入 1/10 體積 0.01 mol/L PBS (ρΗ7.4),以 0.1 mol/L NaOH 調至 pH 7.4 ;於冰浴條件下加入飽和硫酸銨至終濃度45%,4°C靜置2 h, 10000 r/min離心30 min,棄上清;以適量PBS重懸沉澱,對PBS透析過夜,換液3次。以分光光度計法或考馬斯亮藍染色法(Bradford法)測定純化單克隆抗體IgG的蛋白含量在lmg/ml以上,以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)測定小鼠腹水和純化IgG的抗體效價在1:5X 15和1:4000以上,分裝,凍存。
[0031](3)抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體的製備。
[0032]以50 mg~100 mg/kg體重的豬偽狂犬疫苗經肌肉注射免疫健康仔豬3~4次,末次免疫10天後,前腔靜脈採血,以IPMA測定其血清抗體效價在1:1000以上時,心臟採血或頸動脈放血,收集高免血清,以無水硫酸鈉(Na2SO4)提取免疫豬血清IgG,取I份免疫血清加
2份 0.01 mol/L PBS (ρΗ7.2)混合,加入無水 Na2SO4至終濃度 18%, 37°C水浴 30min, 4000r/min離心20min,棄上清,以適量PBS (pH7.2)重懸沉澱,加終濃度16%的Na2SO4, 37。。沉澱30min,4000r/min離心20min,棄上清,再以適量PBS (pH7.2)重懸沉澱,以終濃度14%的Na2SOjX澱,4000r/min離心20min,棄上清,以適量PBS(pH7.2)重懸沉澱,對PBS (ρΗ7.2)過夜透析,換液2~3次,測定抗體效價和蛋白濃度(10-20 mg/ml ),所製備抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體PAbl可用於檢測試紙疫苗毒檢測線T2印跡的印製。
[0033](4)兔抗小鼠IgG多克隆抗體的製備
以純化的小鼠IgG免疫2.0 kg左右健康紐西蘭兔,首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原,皮下多點注射50 mg/只,每次加強免疫間隔3 W,以弗氏不完全佐劑乳化抗原肌肉注射,最後一次加強免疫2 w後,以瓊脂擴散試驗(AGP)測定免疫血清抗體效價高於1:40時,採集高免兔全血,分離血清,以辛酸-硫酸銨法純化兔抗小鼠IgG,方法同(2.4)單抗純化,辛酸用量為45 mL/mL血清,測定抗體效價和蛋白濃度(10-20 mg/ml ),所製備兔抗小鼠IgG多克隆抗體pAb2可用於檢測試紙質控線C印跡的印製。
[0034](5)單克隆抗體的膠體金標記
(5.1)膠體金的製備:取100 mL超純水置於500 mL潔淨的錐形瓶,加入I mL 1% (w/V)氯金酸煮沸;在攪拌狀態下迅速加入新鮮配製的I mL 1% (w/v)檸檬酸鈉溶液,煮沸約3min至溶液顏色由黃色變為紫紅色,繼續煮沸2 min;待溶液涼至室溫,補超純水至100 mL,以0.2 mol/L K2C03iI pH至9.0,4°C避光可保存數月。
[0035](5.2)最適標記蛋白濃度測定:取待標記抗PRV單抗IgG對20 mmol/L硼酸鈉溶液(pH 8.0) 4°C過夜透析。在微孔板中以25 mL超純水以1:2.1:4.1:8……倍比稀釋待標記PRV單抗;各孔加入125 mL膠體金溶液,RT靜置5 min ;加入125 mL I mol/L NaCl溶液;各孔顏色隨蛋白濃度的降低而由紅色變為藍色。以顏色未變藍的單抗最高稀釋度的蛋白濃度為膠體金最適標記濃度,膠體金標記時,蛋白濃度增加20%。
[0036](5.3)單克隆抗體的膠體金標記:取2 mL最適蛋白濃度的待標記單抗IgG,加入10mL膠體金溶液(pH 9.0),迅速混勻,室溫作用10 min?15 min ;加入1/10體積含10% (w/V)牛血清白蛋白(BSA)的20 mmol/L硼酸鈉溶液,迅速混勻,RT作用10 min?15 min ;4°C15000 g離心30min,小心移去上清;以含1% (w/v)BSA的20 mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金,同上離心,棄上清;重複洗滌I次,以I mL含1% (w/v) BSA的20mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金,4°C保存備用。
[0037](6)檢測膜的製備
將硝酸纖維素檢測膜切成2.5X30 cm2的長條,置於XYZ 3000噴點儀平臺上,並以壓條固定;用PBS (pH 7.2)將特異識別豬偽狂犬病毒強毒株但不與疫苗毒株反應的gE蛋白單抗、特異識別豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒疫苗株的gB蛋白單抗或多抗IgG和兔抗鼠IgG稀釋至1.0 mg/mL,並分別放於忙存池;利用B1jet Quanti 3000以1.0 mL/cm分別將抗PRV gE蛋白單抗、gB蛋白單抗或PRV多抗IgG溶液和兔抗鼠IgG溶液噴點於檢測膜中央,形成強毒檢測線Tl、疫苗毒檢測線T2和質控線C印跡,檢測線與質控線相距0.5 cm ;置42°C乾燥箱30 min或室溫自然乾燥;將檢測膜置塑膠袋,加乾燥劑4°C密閉保存備用。
[0038](7)結合墊的製備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長條,置於XYZ 3000噴點儀平臺上,並以壓條固定;取ImL 膠體金標記物加入 2 mL 含 2% (w/v) BSA>3% (w/v)鹿糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween20 (v/v)和 0.1% (w/v)疊氮鈉的 20 mmol/L 硼酸鈉溶液(pH 8.0);利用 Airjet Quanti3000以15 mL/cm將抗膠體金標記物溶液噴點於玻璃棉;置50°C乾燥箱30 min乾燥;將膠金墊置塑膠袋,加乾燥劑4°C密閉保存備用。
[0039](8)樣品墊的製備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長條,以將含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20 (v/v)和0.1% (w/v)疊氮鈉的PBS (pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉條;置50°C乾燥箱30 min乾燥;將樣品墊置塑膠袋,加乾燥劑RT密閉保存備用。
[0040](9)吸水墊的製備
將玻璃棉切成2.5X30 cm2的長條,將吸水墊置塑膠袋,加乾燥劑RT密閉保存備用。
[0041](10)支撐板的製備
將雙面膠貼於PVC支撐板,切成7.5X30 Cm2的長板,製備支撐板。
[0042](11)試紙的組裝
利用LM5000試紙裝配儀或手工將上述材料裝配成試紙板。先將檢測膜粘貼於支撐板中央,然後將膠金墊和樣品墊依次粘貼於檢測膜的樣品端,各層間重疊I mm?2 mm,再將吸水墊粘貼於檢測膜的另一端,與檢測膜重疊I mm?2 mm,在樣品端以白色塑膠膜包裹樣品墊和膠金墊,塑膠膜上印有檢測方向及檢測溶液上限標記,在手柄端以藍色塑膠膜包裹吸水墊。
[0043](12)切割與包裝
利用CM4000切割儀將裝配好的試紙板切成寬度為0.3 cm的試紙條,將試紙條分裝入塑膠袋,加乾燥劑4°C密閉保存。
[0044]( 13)豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙的實施結構
參見圖1,圖2,圖中,I為支撐板用不吸水薄片條,實施中可採用塑膠薄片條或採用不吸水的硬質紙片材,反應試劑載體吸附層由2,3,4,5,組合而成,從樣品端2開始,到手柄端5依次粘貼在支撐層I上面;其中2為樣品端樣品墊,實施中可使用玻璃纖維棉簡稱玻璃棉,3為吸附膠體金標記識別豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒株gB蛋白單克隆抗體mAbl的金標玻璃纖維棉,可採用精製玻璃纖維棉,簡稱為金標墊,4為檢測膜,實施中可採用硝酸纖維素膜,5為手柄端吸水墊,採用吸水紙,如濾紙或其它吸水紙均可,試紙條總長8 cm,寬度0.4cm,6為用特異識別豬偽狂犬病毒強毒株但不與疫苗毒株反應的gE蛋白單克隆抗體mAb2在硝酸纖維素膜上印製的強毒檢測線印跡「 I 」,7為特異識別豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒疫苗株的gB蛋白單克隆抗體mAb3或抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl在硝酸纖維素膜上印製的疫苗毒檢測線印跡「 I 」,8為兔抗小鼠IgG多克隆抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA在硝酸纖維素膜上印製的質控線印跡「 I 」,在檢測膜上的強毒檢測線印跡、疫苗毒檢測線印跡和質控線印跡組合排列為「 III」。9為保護膜,覆蓋在玻璃棉及金標玻璃棉的保護膜為9-1,覆蓋在吸水層濾紙上的保護膜為9-2。在玻璃棉和金標玻璃棉交界處對應位置的白色保護膜上偏向玻璃棉一方0.5 cm處的保護膜上印有一條標記線10,在標記線10右邊印有箭頭和Max字樣,手柄端保護膜可用黃色或其它顏色,2,3,4,5各層彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。
[0045]( 14)豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙實施檢測反應原理
當豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙樣品端插入待檢測樣品溶液後,待檢溶液通過虹吸作用帶動待檢PRV抗原及金標抗體mAbl —起向硝酸纖維素膜擴散,並最終滲透到濾紙層中,在擴散過程中金標抗體mAbl與待檢PRV強毒株或疫苗毒株抗原相結合,形成金標抗體-抗原複合物,PRV強毒株的金標複合物可同時與檢測膜上的強毒檢測印跡mAb2和疫苗毒檢測印跡mAb3結合,生成紅棕色「 I I 」標記,部分未與抗原結合的金標抗體不能與檢測印跡結合而繼續擴散,在檢測膜上與質控印跡中的PAb2或SPA結合,生成紅棕色標記「 I 」,兩種標記組合疊加,形成三條紅棕色陽性標記「 I I I」,表示樣品中含有豬偽狂犬強毒;而?1^疫苗毒株的金標複合物不能與檢測膜上的強毒檢測印跡mAb2結合,只能與疫苗毒檢測印跡mAb3結合,生成紅棕色「 I 」標記,部分未與抗原結合的金標抗體不能與檢測印跡結合而繼續擴散,在檢測膜上與質控印跡中的pAb2或SPA結合,生成紅棕色標記「 I 」,兩種標記組合疊加,形成兩條紅棕色陽性標記「 I I 」,表示樣品中只含有豬偽狂犬疫苗毒;當樣品中不含豬偽狂犬病毒抗原時,沒有金標抗體-抗原複合物形成,不能與強毒檢測印跡和疫苗毒檢測印跡結合,則生成陰性標記「 I 」。如果檢測膜上沒有紅棕色標記顯示,則表明試紙條已失效。
[0046](15)豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙檢測實例操作方法
(15.1)檢測樣品溶液的製備:採集待檢豬拭子(咽拭和肛拭)、病(死)豬組織、糞便和疫苗等不同檢測樣本,加適量PBS或水進行簡單混懸或研磨
(15.2)試紙檢測:將豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙樣品端浸入待檢溶液10 S?20 S ;取出試紙水平放置5 min?10 min觀察結果。
[0047](15.3)檢測結果判定:試紙顯現三條紅棕色條帶(強毒檢測線、疫苗毒檢測線和質控線)「III 」為PRV強毒陽性,表示待檢樣品中含有PRV強毒抗原;兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測線和質控線)「 I I 」為PRV疫苗毒陽性,表示待檢樣品中含有PRV疫苗毒抗原;僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為PRV陰性,表示待檢樣品未檢出PRV抗原;試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效,需以另取檢測試紙重新檢測。
[0048]實施例一,豬偽狂犬強毒感染快速診斷,採集病(死)豬的病變組織,包括腦、肺、肝、脾、腎、氣管、小腸、大腸和淋巴結、流產胎兒等,以1:5或1:10加適量PBS或水進行簡單研磨,製備待檢溶液,以豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙按(15)操作方法進行檢測和結果判定,鑑別診斷病(死)豬強毒感染或疫苗免疫。試紙顯現三條紅棕色條帶(強毒檢測線、疫苗毒檢測線和質控線)「 I I I」為PRV強毒陽性,表示待檢豬為PRV強毒感染;兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測線和質控線)「 I I 」為PRV疫苗毒陽性,表示待檢豬為PRV疫苗免疫;僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為PRV陰性,表示待檢豬無強毒感染或疫苗免疫;試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效,需以另取檢測試紙重新檢測。
[0049]實施例二,生豬的豬偽狂犬病毒檢驗檢疫,採集生豬拭子(咽拭和肛拭)或糞便,以1:5或1:10加適量PBS或水進行簡單混懸,製備待檢溶液,以豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙按(15)操作方法進行檢測和結果判定,鑑別檢測生豬的強毒感染或疫苗免疫情況。試紙顯現三條紅棕色條帶(強毒檢測線、疫苗毒檢測線和質控線)「 I I I 」為PRV強毒陽性,表示待檢生豬或環境為PRV強毒汙染;兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測線和質控線)「 I I 」為PRV疫苗毒陽性,表示待檢生豬或環境無PRV強毒汙染,為PRV疫苗免疫;僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為PRV陰性,表示待檢生豬無強毒感染或疫苗免疫;試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效,需以另取檢測試紙重新檢測。
[0050]實施例三,豬偽狂犬疫苗毒疫苗的質量檢測,以1:5或1:10加適量PBS或水溶解豬偽狂犬疫苗毒活疫苗等,製備待檢疫苗溶液,以豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒株鑑別檢測試紙按(15)操作方法進行檢測和結果判定,檢測豬偽狂犬疫苗毒疫苗的病毒含量和鑑別檢測疫苗的強毒汙染情況。試紙顯現三條紅棕色條帶(強毒檢測線、疫苗毒檢測線和質控線)「 I I I 」為PRV強毒陽性,表示待檢疫苗為PRV強毒汙染;兩條紅棕色條帶(疫苗毒檢測線和質控線)「 I I 」為PRV疫苗毒陽性,表示待檢疫苗無PRV強毒汙染,疫苗毒檢測線的顯色強度與PRV疫苗含量成正比;僅顯現一條紅棕色條帶(質控線)「 I 」為PRV陰性,表示待檢疫苗無PRV強毒汙染,同時也不含疫苗毒;試紙未顯現任何條帶表明檢測操作不當或試紙失效,需以另取檢測試紙重新檢測。
【權利要求】
1.一種豬偽狂犬病毒強毒和疫苗毒鑑別檢測試紙,由支撐板,樣品墊,金標墊,檢測膜和吸水墊構成,其特徵是:金標墊吸附膠體金標記抗豬偽狂犬病毒gB蛋白單克隆抗體mAbl,檢測膜的強毒檢測線Tl為抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體mAb2印跡「 | 」,疫苗毒檢測線T2為抗豬偽狂犬病毒多克隆抗體pAbl或gB蛋白單克隆抗體mAb3印跡「 | 」,質控線C為抗小鼠IgG抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA印跡「 I 」。
2.根據權利要求1所述的鑑別檢測試紙,其特徵是:豬偽狂犬強毒感染時在檢測膜顯現強毒檢測線Tl,疫苗毒檢測線T2和質控線C三條紅色條帶「 I I |」,豬偽狂犬疫苗毒免疫時在檢測膜顯現疫苗毒檢測線T2和質控線C兩條紅色條帶「 I I 」,無豬偽狂犬病毒則只顯現質控線C 一條紅色條帶「丨」。
3.根據權利要求1所述的鑑別檢測試紙,其特徵是:單克隆抗體mAbl和mAb3均特異識別豬偽狂犬病毒強毒株和疫苗毒疫苗株,分別識別豬偽狂犬病毒gB蛋白的不同抗原表位,單克隆抗體mAb2特異識別豬偽狂犬病毒強毒株gE蛋白,但不與疫苗毒株反應。
4.根據要求I或3所述的鑑別檢測試紙,其特徵是:鑑別檢測試紙的豬偽狂犬病毒反應譜廣,疫苗毒檢測線T2可檢測豬偽狂犬疫苗株以及多數流行強毒株,強毒檢測線Tl可檢測多數豬偽狂犬病毒流行強毒株,可實現對豬偽狂犬病毒主要流行毒株與疫苗株的鑑別檢測。
【文檔編號】G01N33/558GK104459144SQ201410763138
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月12日 優先權日:2014年12月12日
【發明者】喬松林, 楊繼飛, 李青梅, 郭軍慶, 邢廣旭, 柴書軍, 萬博, 解偉濤, 王寅彪, 劉肖, 鄧瑞廣, 張改平 申請人:河南省農業科學院

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