一種基於納米纖維的三維大孔徑組織工程支架及其應用的製作方法

2023-05-24 01:24:31 1

專利名稱：一種基於納米纖維的三維大孔徑組織工程支架及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基於納米纖維的三維大孔徑組織工程支架及其應用。
(二)
背景技術：
人體各種組織的損傷極為普遍，特別像骨、軟骨缺損以及肌腱、韌帶
等結締組織損傷越來越多(佔運動損傷的50%),而皮膚損傷更是不計其 數。有數據表明，在2001年，歐洲的骨移植手術有408000例，而單美國 就有605000例。目前，全球65歲以上的人口每年以2 3%的速度增長。 以及由於人們物質生活水平的提高、生活方式的改變以及醫學水平的提高 這些都導致了對骨移植、骨修復手術的更多需求和更廣泛的應用。在我國， 據不完全統計，全國每年因各類交通事故、骨科疾病等因素，造成骨缺損 或骨損傷的患者有300萬人，骨骼不健全的人數有上千萬，據估計全國每 年個體匹配骨骼的市場總額至少在五千萬元以上。
目前臨床運動器官的損傷以及皮膚等組織缺損主要靠自體/異體組織 來修復加強，或者靠不可降解的生物材料來修復。但是這些治療方法都有 其固有的缺陷。如移植自體組織需要犧牲供區的功能，且供應十分有限； 異體組織來源困難且可能存在免疫和病理上的問題。
組織引導再生膜技術是目前臨床應用較成功的組織工程應用性技術。 其基本原理是利用膜技術將組織缺損區與周圍組織隔離，阻擋周邊纖維 細胞/組織的侵入，為缺損內的組織生長創造一定的有利環境。其具有制 作簡單、組織適用性強、臨床4喿作簡便等獨有特點。目前此類膜在骨科學，牙科學、神經、血管再生方面皆有廣泛深入研究。目前已有膠原膜材料(如
BioGide )、透明質酸(如HYAFF 11)用於臨床，但該支架只能運用於
缺損組織的表面修復，無法形成立體結構，使再生組織充分長入支架內，
主要缺點有l)空隙小，無法讓細胞縱深生長；2)阻擋大分子營養物質、
細胞因子的傳遞或交流，影響組織再生；3)在非軸向上力學性能差，容
易塌陷；4)局部降解產物較多，排洩不暢，影響組織生成。但鑑於電紡
製備的納米纖維具有很好的機械性能和細胞生物學特性，有利於細胞生
長、增殖、分化等，如將上述材料形成三維結構支架，克服膜支架的上述
缺點，就能使目標細胞在支架內生長、增殖、分化並最終長成所需組織。
發明內容
本發明目的是提供一種同時具備有良好組織再生性能和足夠相通的 細胞組織容納空間的三維微米孔徑組織工程支架。 本發明採用的技術方案是
一種基於納米纖維的三維微米孔徑組織工程支架，由如下方法製備得 到將通過靜電紡絲製得的納米纖維膜切割製成直徑10pm lmm的纖維 束，將所述纖維束疊置、使纖維之間的孔隙間距在10(im lmm範圍內， 組裝成三維結構，粘合固定，得到由納米絲組成的三維大孔徑組織工程支 架。
靜電紡絲是在高壓靜電場下使高分子溶液帶電，並在向低電場噴射過 程中成絲的方法。理論上任何高分子材料只要能找到合適的溶液體系，都 有可能靜電紡絲成納米纖維，且具有批量生產的可能。目前靜電紡絲已經 成為納米纖維較為常用的方法之一。通常靜電紡絲製得的納米纖維成品為 納米纖維膜，由數根納米纖維交錯排列而成，為類似於紙張的平面結構，不利於細胞生長，本發明通過將納米纖維組成的納米纖維膜切割得到微米 纖維，再將微米纖維疊加、組裝成三維結構支架，可使目標細胞更容易在 支架內生長、增殖、分化並最終長成所需組織。
為充分促進組織再生，所述納米纖維中還可複合有活性因子或其他顆
粒生物材料，所述活性因子或其他顆粒生物材料為下列之一①TGF-P、 ②PRP、③BMP、④VEGF、⑤PDGF、⑥HA、⑦TCP。所述活性因子或 其他顆粒生物材料添加量可不受限制，優選的，其添加量為 1 jig/cm3 10mg/cm3，即每1 cm3支架中添加1 (ig ~1 Omg活性因子或其他顆 粒生物材料。
架的生物材料，本發明中優選為下列之一①PLLA，②PGA,③PCL， PLGA, PCL/PLLA (指PCL和PLLA的混合物)，⑥膠原，⑦絲素 蛋白、⑧殼聚糖、⑨透明質酸。
最為優選的，製備所述納米纖維膜的生物材料為PLLA,所述納米纖 維膜按如下方法製備得到配製40 120g/L的PLLA溶液，溶劑為氯仿、 乙醇體積比1 3: 1的混合溶劑，將所述PLLA溶液置於靜電紡絲裝置中， 於流量0.5 ml/h~2ml/h、電壓14KV 18.7KV條件下成絲，納米絲累積疊 加成納米纖維膜。
優選的，所述樣史米纖維直徑為30 500jum。優選的，所述納米纖維 直徑為200 900nm。
本發明所述的基於納米纖維的三維微米孔徑組織工程支架，由如下方 法製備得到取低熔點生物材料加熱融熔，將所述微米纖維層層疊置、使 纖維之間的孔隙間距在10lam lmm之內，組裝成三維結構，得到所述三維微米孔徑組織工程支架，所述低熔點生物材料為PCL。
本發明所述的基於納米纖維的三維微米孔徑組織工程支架，還可以由
如下方法製備得到取粘合劑溶於與所述的納米纖維不相溶的有機溶劑制 成粘合劑溶液，將所述微米纖維層層疊置、使纖維之間的孔隙間距在 10(xm lmm之內，組裝成三維結構，將粘合劑溶液澆築三維結構，揮發 去除有機溶劑，固定得到所述三維微米孔徑組織工程支架，所述的粘合劑 為下列之一①PLLA，②PGA,③PCL, PLGA,⑤PCL/PLLA,⑥膠 原，⑦絲素蛋白、⑧殼聚糖、⑨透明質酸。
所述的三維微米孔徑組織工程支架在生物體外組織構建中的應用。
所述組織工程支架製備方法如下
先配製低濃度的PLLA、 PGA等的溶液(40 120g/L)，溶劑為氯仿/ 乙醇(體積比3: 1)。通過電紡技術，製備納米纖維支架。用切片機將所 得的纖維支架沿一定的軸向進行切割，切割距離為10~1000|im皆可，收 集大纖維後按所需形狀進行組裝，加低熔點生物材料如PCL加熱固定或 不同溶劑的生物材料如膠原浸泡後乾燥製成複合材料。最終得到由納米纖 維集合成的大孔徑組織工程支架。
優選的，製備所述納米纖維膜的生物材料為PLLA,所述納米纖維膜 按如下方法製備得到配製40~120g/L的PLLA溶液，溶劑為氯仿、乙醇 體積比3: l的混合溶劑，將所述PLLA溶液置於靜電紡絲裝置中，於流 量0.5 ml/h 2ml/h、電壓14KV 18.7KV條件下製備得到納米纖維膜。
所述的大孔徑組織工程支架可應用於生物體內組織^務補或加強。如體 內植入進行骨、軟骨、肌腱、皮膚等各種組織修補或加強。所述的大孔徑 組織工程支架也可應用於生物體外組織構建。如體外接種各種間充質幹細
7胞、纖維細胞或纖維母細胞，構建組織工程骨，軟骨、肌腱及皮膚等組織 補片。
本發明是在以前研究的基礎上進一步提高，利用能良好地模擬胞外 基質膠原的功能、提供良好的組織生長微環境、促進細胞生物學表達的生 物材料納米纖維作為細胞直接生活層，利用能讓足夠多的細胞黏附到支架 內、並有利於營養成分交換和細胞信號傳導的微米纖維作為組織再生支撐 層和加強層，可促進組織工程技術走向臨床化和產業化。
本發明的有益效果主要體現在(1 )本發明使納米級纖維組裝成三 維大孔支架用於組織再生修復，支架的納米纖維二級結構大孔層可促進目 標細胞生長、增殖、分化等，並形成一定的組織；支架的微米纖維一級結 構大孔層可提供一個缺損內部細胞組織充分長入的空間；(2)本發明支 架具有良好力學性能，大大減少高分子生物材料的需要量及降解產物;(3 ) 本發明支架適合於骨、肌腱、軟骨、皮膚等組織的大塊缺損修復和組織工 程。
(四)


圖1為納米纖維的電鏡照片；
圖2為基於納米纖維的三維微米孔徑支架的電鏡照片；
圖3為三維微米孔徑支架截面電鏡照片；
圖4為骨髓間質幹細胞生長於三維微米孔徑支架的電鏡照片。
(五)
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護範圍 並不僅限於此實施例1:
先配製濃度(10mg/ml)的PLLA溶液，溶劑為氯仿/乙醇(v/v=3: 1 )。 通過電紡(控制流量為0.5ml/h~1.0ml/h，電壓為14KV 16KV)技術，制 備納米纖維膜(電鏡照片見圖1 ),將製得的納米纖維膜切割成寬度50 200 ym、厚度50 200ym的細條，得到微米纖維，將微米纖維交錯疊加組 成三維構型，加入PCL納米絲，65度以上加熱熔融1分鐘，冷卻後可得 到納米纖維集合成的三維大孔徑組織工程複合支架(所得納米纖維層孔徑 為100 500nm,微米纖維層孔徑為50 200pm)。將骨髓間質幹細胞種植 於纖維支架上，培養7天後電鏡觀察，見細胞能在支架良好生長。
實施例2:
先配製濃度(15mg/mL)的PGA溶液，溶劑為氯仿/乙醇(v/v=3: 1 )。 通過電紡(控制流量為1.5ml/h 2.0ml/h，電壓為16KV 18.7KV )技術製備 納米纖維膜，膜厚為200 500ym。將所得的納米纖維膜沿一定的軸向進 行切割，切割距離為200 500^im皆可，製作出一級結構的微米大纖維。而 後按所需塊狀進行組裝，浸泡入3mg/ml的膠原溶液後，提起濾幹l分鐘後 於-7(TC冷凍，將其凍幹，可得到納米纖維為基層，由微米纖維集合成的 三維微米孔徑組織工程複合支架。(見圖2、圖3)(所得納米纖維直徑為 100~1000nm,支架孔徑為100 500(im )。
實施例3:
先配製PLLA ( 10mg/mL )和TCP ( 5mg/ml)的混合溶液，溶劑為氯仿/ 乙醇(v/v=3 : 1 )。通過電紡(控制流量為0.5ml/h l .Oml/h,電壓為14KV-16KV)技術，製備納米纖維膜，將製得的納米纖維膜切割成寬度 50~200jum、厚度50 200jum的細條，得到^t米纖維，將微米纖維交錯疊 加組成三維構型，(加入PCL納米絲，65度以上加熱熔融3分4f,冷卻後可 得到納米纖維集合成的三維大孔徑組織工程複合支架(支架孔徑為 50 200,)。
實施例4:
將實施例2所得的支架種植上骨髓間質幹細胞，培養7天後電鏡觀察， 見細胞在支架上良好生長(見圖4)。
實施例5:
將實施例3所得的支架植入白兔體內用於修復脛骨缺損。6周後可發 現組織均勻長入缺損部位，形成了功能性骨組織。
實施例6:
將實施例1所得的支架植入白兔用於修復脛骨缺損，3周後組織長入 良好，沒有明顯的炎性反應。
權利要求
1. 一種基於納米纖維的三維大孔徑組織工程支架，由如下方法製備得到將通過靜電紡絲製得的納米纖維膜切割製成直徑10μm～1mm的纖維束，將所述纖維束疊置、使纖維之間的孔隙間距在10μm～1mm範圍內，組裝成三維結構，粘合固定，得到由納米纖維組成的三維大孔徑組織工程支架。
2. 如權利要求1所述的組織工程支架，其特徵在於所述納米纖維中還復 合有活性因子或顆粒生物材料，所述活性因子或顆粒生物材料為下列 之一①TGF-(3、②PRP、③BMP、④VEGF、⑤PDGF、 HA、⑦TCP。
3. 如權利要求2所述的組織工程支架，其特徵在於所述活性因子或顆粒 生物才才津牛添力口量為l(ig/cm3~10mg/cm3。
4. 如權利要求1 3之一所述的組織工程支架，其特徵在於製備所述納米 纖維膜的生物材料為下列之一①PLLA,②PGA，③PCL， PLGA, ⑤PCL/PLLA， 膠原，⑦絲素蛋白、⑧殼聚糖、⑨透明質酸。
5. 如權利要求4所述的組織工程支架，其特徵在於製備所述納米纖維膜 的生物材料為PLLA，所述納米纖維膜按如下方法製備得到配製 40~120g/L的PLLA溶液，溶劑為氯仿、乙醇體積比1 3: 1的混合溶 劑，將所述PLLA溶液置於靜電紡絲裝置中，於流量0.5ml/h 2ml/h、 電壓14KV 18.7KV條件下成絲，納米絲累積成納米纖維膜。
6. 如權利要求1所述的基於納米纖維的三維;徵米孔徑組織工程支架，由 如下方法製備得到取低熔點生物材料加熱融熔，將所述微米纖維層 層疊置、使纖維之間的孔隙間距在10(am lmm之內，組裝成三維結構，得到所述三維微米孔徑組織工程支架，所述低熔點生物材料為PCL。
7. 如權利要求1所述的基於納米纖維的三維微米孔徑組織工程支架，由 如下方法製備得到取粘合劑溶於與所述的納米纖維不相溶的有機溶 劑製成粘合劑溶液，將所述微米纖維層層疊置、使纖維之間的孔隙間 距在1(^m lmm之內，組裝成三維結構，用粘合劑溶液澆築三維結構， 揮發去除有機溶劑，固定得到所述三維微米孔徑組織工程支架，所述 的粘合劑為下列之 一 ①PLLA ，②PGA ，③PCL ，④PLGA , ◎PCL/PLLA,⑥膠原，⑦絲素蛋白、⑧殼聚糖、⑨透明質酸。
8. 如權利要求1 3之一所述的組織工程支架，其特徵在於所述微米纖維 直徑為30 500jum。
9. 如權利要求1 3之一所述的組織工程支架，其特徵在於所述納米纖維 直徑為200 900nm。
10. 如權利要求1所述的三維微米孔徑組織工程支架在製備生物體修復和 構建組織工程材料的應用。
全文摘要
本發明提供了一種基於納米纖維的三維大孔徑組織工程支架，由如下方法製備得到將通過靜電紡絲製得的納米纖維膜切割製成直徑10μm～1mm的纖維束，將所述纖維束疊置、使纖維之間的孔隙間距在10μm～1mm範圍內，組裝成三維結構，粘合固定，得到由納米纖維組成的三維大孔徑組織工程支架。本發明的有益效果主要體現在(1)本發明支架的納米纖維二級結構大孔層可促進目標細胞生長、增殖、分化等，並形成一定的組織；支架的微米纖維一級結構大孔層可提供一個缺損內部細胞組織充分長入的空間；(2)本發明支架具有良好力學性能，大大減少高分子生物材料的需要量及降解產物；(3)本發明支架適合於骨、肌腱、軟骨、皮膚等組織的大塊缺損修復和組織工程。
文檔編號A61L27/24GK101444641SQ20081016369
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月24日 優先權日2008年12月24日
發明者張國榮, 歐陽宏偉, 蔡友志 申請人:浙江大學