牛樟芝的培養方法
2023-05-23 08:46:46
牛樟芝的培養方法
【專利摘要】本發明所述牛樟芝的培養方法，主要是通過光照波長改變，而使所培養出的牛樟芝的內活性成份含與種類量增加，並再通過調整如培養基含水量、培養基的組成成份及其比例、培養溫度等環境因子，更得有助於提高牛樟芝內活性成份的含量與種類。
【專利說明】牛樟芝的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明是有關於真菌培養方法，特別是指一種牛樟芝的培養方法。
【背景技術】
[0002]牛樟芝(Antrodia cinnamomea)又被稱為樟芝,其為臺灣所特有種的真菌,主要生長於臺灣山區海拔約450?1500公尺間的牛樟樹的腐朽心材內。近期研究指出牛樟芝營養價值極高，並具有許多生理活性，因此，牛樟芝乃成為目前十分珍貴的真菌，市場上的需求量也日漸增加。更進一步而言,牛樟芝主要活性成份包含有多糖體、多酚類化合物及指標性產物三職類(triterpene),其中，經研究發現多糖體可用以提升免疫力以及具有抗腫瘤的效用；多酚類化合物被認為可作為生物體的還原劑，具有清除自由基抗氧化及抑制壞膽固醇氧化等能力，並且可阻斷癌細胞生長所需的酵素，達到抑制癌症的效果；三萜類被證明可促進癌細胞死亡、抑制肝癌細胞增值、修復肝臟、提升肝臟機能、抗發炎、降血脂、降血壓、防止中風以及調節免疫等功能。然而，基於牛樟芝寄生的牛樟樹為保育類樹種，並且牛樟芝生長速度緩慢，因此自然環境中是無法取得大量的牛樟芝，因而如何獲得牛樟芝，及有效地提高牛樟的內活性成份含量成為目前生醫產業的研究重點。
[0003]隨著培養牛樟芝的方法及其使用的培養條件不同，所能夠獲得的活性成份也隨之改變。目前主要生產牛樟芝培育方法有液態培養法、固態培養法及鍛木培養法，其中，液態培養法是將牛樟芝養於已調配好比例的碳源及氮源的液態培養基中，優點在於成本低，培養時間短，僅須約7?14天即可培育出牛樟芝，但是，所培養出的牛樟芝三萜含量低，且所含有的三萜是非野生牛樟芝所特有的三萜類；固態培養法是以天然穀物及水組成的固態培養基培育牛樟芝，並且藉由人工方式控制溫度、溼度，而使所培育出的牛樟芝具有較高含量的三萜類，只是，需要較長的培養時間，約3?6個月，且依據所使用的培養基不同，所培養出的牛樟芝所含有活性成份也不相同，造成量產上品質不一，此外，也無法涵蓋野生牛樟芝所特有的有效三萜類成份；椴木培養法是利用牛樟木作為培養基，具有可培養出與野生牛樟芝子實體相同成份的優點，輔以人工方式控制培養環境，能增加牛樟芝子實體品質的穩定性，但，椴木培養法需要I?3年的培養時間，並由於牛樟樹為保護樹種而取得不易，使得培養成本增加且量產困難。
[0004]而為兼顧牛樟芝內含活性成份的產量及生產成本，目前大多選擇以固態培養法養育牛樟芝，但目前技術仍有若干缺陷，舉例來說，培養完成的牛樟芝與顆粒狀的固態培養基分離不易，後續應用則須連帶著培養基而使產品受到局限；再者，所培養出的牛樟芝子實體較薄，內含的活性成份產量也亦隨之減少。另也有藉由改變牛樟芝液態培養時的光照波長以影響牛樟芝活性成份的含量，但，藍光是僅能增加胞外多糖的含量，無法增加三萜含量，而紅光則對三萜含量有助益，卻無法影響胞外多糖含量。據此，目前仍無法提供一種培養牛樟芝的方法，能夠提高其活性成份的含量，並有效控制生產成本。
【發明內容】
[0005]本發明的主要目的是在於提供一種牛樟芝的培養方法，用以提升牛樟芝內活性成份的含量與種類。
[0006]本發明採用以下技術方案:
[0007]—種牛樟芝的培養方法,該培養方法是將種菌接種於培養基中，在至少一培養條件進行培養，所述培養條件包含有光照環境，所述光照環境是選自由綠光及藍光所組成的群。
[0008]其中:
[0009]所述光照環境的照光強度是介於I μ mol/s.m2至20 μ mol/s.m2，當光照環境為藍光時，該光照環境的照光強度以2 μ mol/s *m2至16 μ mol/s *m2為較佳；當光照環境為綠光時，該光照環境的照光強度以11 μ mol/s.m2至20 μ mol/s.m2為較佳。
[0010]所述培養條件包含有25°C?35°C的培養溫度。
[0011]所述培養基是包含有粉末狀基質及水，所述粉末狀基質是具有至少一五穀雜糧，如為苦蕎麥粉、糙米粉、紅薏仁粉或至少二上述粉末以一定比例混合而成者。
[0012]所述粉末狀基質是以糙米粉、苦蕎麥粉及紅薏仁粉混合而得，其中，紅薏仁粉的含量是為最低，苦蕎麥粉的含量次之，糙米粉的含量最高；或紅薏仁粉的含量是為最低，糙米粉的含量次之，苦蕎麥粉的含量最高；具體來說，所述粉末狀基質的組成比例是以紅薏仁粉為I，糙米粉為紅薏仁粉的10?2倍，苦蕎麥粉為紅薏仁粉的2?10倍者為較佳，例如糙米粉、苦蕎麥粉及紅薏仁粉的組成比例為9:2:1。
[0013]所述培養基的水含量是介於35?55%之間，又以水含量為35?50%者為較佳。
[0014]所述種菌是由打碎的牛樟芝菌塊所培養製備而成的，用以使菌球在可視狀態下均勻分配，有利於接種，可避免汙染。
[0015]更進一步而言，本發明所述方法是包含有二培養條件，其中一培養條件是在無光照環境下進行培養15天，另一培養條件是在該光照環境下進行培養至少15天。
[0016]其中，所述一培養條件的培養溫度是低於另一培養條件的培養溫度，具體來說，所述一培養條件的培養溫度是為25°C,另一培養條件的培養溫度是為25?35°C。
[0017]本發明的有益效果在於:
[0018]通過本發明所述牛樟芝的培養方法，其可提升牛樟芝內活性成份的含量與種類，降低栽培牛樟芝所需耗費的成本，而得大量的產量及作為各種產品的原料，用以增加牛樟芝的經濟價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是以不同強度的綠光進行牛樟芝培養，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
[0020]圖2是以不同強度的藍光進行牛樟芝培養，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
[0021]圖3是以不同含水量的糙米粉末固態培養基進行培養，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
[0022]圖4是以不同含水量的苦蕎麥粉末固態培養基進行培養，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
[0023]圖5是以不同含水量的紅薏仁粉末固態培養基進行培養，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
[0024]圖6是以不同溫度變化培養牛樟芝，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
[0025]圖7是以不同組成比例的固態培養基進行培養，測定各牛樟芝內的各活性成份含量的結果。
【具體實施方式】
[0026]本發明所述牛樟芝的培養方法，主要是通過光照波長改變，而使所培養出的牛樟的內活性成份含量與種類增加，並再通過調整如培養基含水量、培養基的組成成份及其比例、培養溫度等環境因子，更有助於提高牛樟芝內活性成份的含量與種類。
[0027]須先說明於本發明說明書與申請專利保護範圍中所提及的名詞，然其僅為例示性的說明，並非用以局限本發明說明書及申請專利保護的範圍。
[0028]所謂培養基，是包含用以培養真菌類的液態培養基及固態培養基。
[0029]所謂五穀雜糧，是指稻、黍、稷、麥、菽及堅果類，例如糙米、稻米、黃米、玉米、小麥、小米、大米、高粱、燕麥、大麥、蕎麥、大豆、綠豆、黃豆、紅豆、黑豆、核桃、薏仁、南瓜子等。
[0030]以下，將通過若干實例並搭配圖式作更進一步說明本發明。
[0031]實施例1:製備種菌
[0032]本實施例中所使用的牛樟芝菌株(BCRC35396)是由臺灣新竹食品工業發展研究的生物資料保存及研究中心所提供，於25°C下培養於斜面培養基中，直至牛樟芝菌絲長滿，其中，斜面培養基的組成是為2 %葡萄糖、2 %麥精、0.1 %蛋白分解物(Peptone )及2 %膠體。
[0033]取適量已長有牛樟芝菌絲體的斜面菌種移接至牛樟芝平面培養皿培養基進行培養，至牛樟芝菌絲於平面培養皿中成長至半徑約3.5公分的圓形即為完成，其中，牛樟芝平面培養皿培養基的組成是如同斜面培養基。將製備完成的培養基分為8等分，
[0034]將上述培養完成的平面培養皿培養基分為8等分，分別加入已調配好的8瓶液態培養基中，其中，液態培養基的組成為2%葡萄糖、2%麥精、0.1%蛋白分解物。再將各該液態培養基的菌塊完全打碎，而後置於25°C、10rpm的培養箱中培養5天，以供下列實施例之用。
[0035]實施例2胞內多糖測定法
[0036]將一待測樣品100毫克粉末與10毫升蒸餾水置於離心管中，進行滅菌，而後以8000rpm離心5分鐘，收集一上清液。將該上清液與95%酒精以體積比1:4的比例混合，於4°C冰箱靜置約24小時，用以使其內多糖體沉澱，再以SOOOrpm進行離心5分鐘，除去其上清液而獲得沉澱物。將該沉澱物以氫氧化鈉回溶並稀釋，以酹-硫酸法(Phenol-sulfuricacid assay)測定胞內多糖濃度,將完成稀釋後的溶液與5%酹溶液混合,加入5毫升濃硫酸，混合10分鐘，再以25°C恆溫水浴槽反應15分鐘，以分光光度計測定於490nm波長下的吸光值，對照葡萄糖標準品濃度與其吸光值標準曲線即可得知該待測樣品的多糖濃度。
[0037]實施例3總多酚含量測定
[0038]取待測樣品的菌絲體以固定倍數(I:20)的甲醇於50°C、130rpm的水槽內進行萃取反應約12小時,之後以8000rpm進行離心5分鐘,得到上清液。將該上清液加入6毫升2%的碳酸鈉溶液均勻混合,再加入酹試劑(Folin-Clocalteu』 s phenol reagent)進行反應約30分鐘，而後以波長730nm測定其吸光值，比對已知濃度的標準沒食子酸(Gallicacid)檢量線，用以計算出該待測樣品的總多酚含量。
[0039]實施例4三萜類含量測定
[0040]取待測樣品100毫克與50%乙醇3毫升於離心管中混合，以超聲波震蕩萃取30分鐘，再以8000rpm離心5分鐘。自離心管中取出上清液3毫升放入一樣品瓶中，再於離心管重複上述加入乙醇、萃取及離心等步驟，而後取出上清液3毫升加入該樣品瓶中。烘乾該樣品瓶中的上清液而成為幹糙物，加入3暈升水回溶和3暈升氯仿，以超聲波震蕩萃取30分鐘，而取出其下層液體，並加入3毫升5%碳酸氫鈉，再以超聲波震蕩萃取30分鐘，進行酸鹼值調整至約2?3，取其下層液進行烘乾，加入2毫升飽和乙醇，以波長245nm測定吸光值，則可得該待測樣品的三萜類含量。
[0041 ] 實施例5培養光照波長及強度分析
[0042]先將糙米以磨粉機磨成粉末狀，取25千克糙米粉置於一玻璃平板上而與15千克水均勻混合，經滅菌後作為用以培養牛樟芝的固態粉末培養基。將實例I中所培養完成的牛樟芝種菌，以5%接菌量均勻接至該固態粉末培養基中，封口後於25°C恆溫培養箱進行培養15天後，再進行照射光線。本實施例中是依據照射光線波長不同而分為兩組實驗設計組，其中，第一實驗設計組是照射綠光，第二實驗設計組是照射藍光；各實驗設計組又分別依具光線強度不同而分為四組，其中，第一組是為空白組，第二組的照光強度為I?2ymol/s.m2,第三組的照光強度為15?16ymol/s.m2,第四組的照光強度為19?20 μ mol/s.m2。各組經照光培養15天後，分別收集各組所生長的牛樟芝，經過24小時烘乾，磨粉並且以實施例2至4所述方法測定各組牛樟芝中三萜類、總多酚以及胞內多糖的含量。各組重複上述流程三次，將各組牛樟芝各活性成份的含量經統計後的結果乃如圖1和圖2所示，其中，圖1和圖2依序分別為第一實驗設計組和第二實驗設計組所測得的結果。
[0043]由圖1的結果可知在第一實驗設計組中第二組至第四組的胞內多糖的含量分另Ij 為 66.38mg/g、96.55mg/g 及 60.19mg/g,總多酹含量分別為 38.86mg/g、43.71mg/g 及25.46mg/g,粗三職含量分另Ij為22.28mg/g、39.64mg/g及17.81mg/g ;而由圖2的結果可知第二實驗設計組中第二組至第四組的胞內多糖的含量分別79.78mg/g、73.83mg/g及41.61mg/g,總多酚含量分別為27.46mg/g、41.90mg/g及29.09mg/g,粗三萜含量分別為
22.59mg/g22.39mg/g、13.15mg/g。更進一步來說，當以綠光強度為 15 ?16 μ mol/s.m2 進行照射培養後，所得的總多酚含量是為未照光組的2.69倍，且粗三萜含量是為未照光組的2.92倍；當以藍光強度為15?16 μ mol/s.m2進行照射培養後，所得的總多酚含量是為未照光組的2.53倍，且粗三萜含量是為未照光組的2.70倍。
[0044]因此，整體來說，由圖1和圖2的結果顯示不論照射綠光或藍光，皆能提升牛樟芝內活性成份的含量或種類，而照射藍光時，是以強度為2?16 μ mol/s.πι2，所得的各活性成份含量最高；照射綠光時，是以強度為11?20ymol/S.m2，所得的各活性成份含量最高
[0045]實施例6固態培養基含水量分析
[0046]將分別以適量糙米粉末與比較例的水在培養容器中進行混合，製備而成含水量為55%的糙米粉末固態培養基和含水量為45%糙米粉末固態培養基，分別用以作為第一組及第二組。再分別於各組的固態培養基上接種5%種菌，進行培養3個月，並於培養至第3個月時將所生長的牛樟芝與其固態培養基分離，通過實施例2至4所述方法測定於各組所培養出牛樟芝內活性成份的含量，結果如圖3所示。
[0047]如同上述步驟分別製備不同含水量的苦蕎麥粉末固態培養基和不同含水量的紅薏仁粉末固態培養基的牛樟芝培養，並且分別如同上述糙米粉末固態培養基依據其含水量分為第一組和第二組，而後進行於各組固態培養基進行牛樟芝培養，並測定各組於培養3個月所得牛樟芝的內活性成份含量，結果如圖4和圖5所示，其中，圖4為以不同含水量的苦蕎麥粉末固態培養基進行培養的結果，圖5為以不同含水量的紅薏仁粉末固態培養基進行培養的結果。
[0048]由圖3的結果可知，以含水量55%的糙米粉末固態培養基所培養出牛樟芝，其胞內多糖含量為2.42mg/g，總多酚含量為46.38mg/g，粗三萜含量為51.84mg/g ;而相較於此，以含水量45%的糙米粉末固態培養基所培養出牛樟芝，其內活性成份含量皆增加，胞內多糖、總多酹及粗三職的含量分別為33.55mg/g、41.60mg/g及51.84mg/g。
[0049]由圖4的結果可知，以含水量55%的苦蕎麥粉末固態培養基所培養出牛樟芝，其胞內多糖含量為5.01mg/g，總多酚含量為33.90mg/g，粗三萜含量為23.95mg/g，而以含水量45%的苦蕎麥粉末固態培養基所培養而得的胞內多糖是為43.02mg/g,總多酹為36.27mg/g,粗三萜的含量為44.82mg/g,也就是說，以含水量45%的苦蕎麥粉末固態培養基培養而得的各活性成份含量都高於以含水量55%的苦蕎麥粉末固態培養基所培養而得者。
[0050]由圖5的結果可知，以含水量55%的紅薏仁粉末固態培養基所培養出牛樟芝,其胞內多糖含量為2.84mg/g,總多酚含量為26.53mg/g,粗三萜含量為8.41mg/g,而相較於此，以含水量45%的紅薏仁粉末固態培養基所培養出牛樟芝內活性成份含量皆增加，胞內多糖、總多酚及粗三萜的含量分別為18.70mg/g、28.20mg/g及20.06mg/g。
[0051]由圖3至圖5的結果顯示含水量為45%的固態培養基進行牛樟芝培養所得的各活性成份含量是高於含水量為55%的固態培養基進行牛樟芝培養所得的。
[0052]實施例7培養溫度分析
[0053]本實施例中共有三組實驗組，各組是先分別將糙米以磨粉機磨成粉末狀，取25公克糙米粉置於玻璃平板上，並以水調整其含水量為45%而形成一固態培養基，經滅菌後，再將實施例1的種菌以5%接菌量接至各組固態培養基，而後設置依據不同培養溫度進行牛樟芝培養，其中，第一組是為以25°C恆溫培養室固態培養牛樟芝30天,第二組是先以25°C恆溫培養室固態培養牛樟芝15天，再以培養溫度30°C培養15天，第三組是先以25°C恆溫培養室固態培養牛樟芝15天,再以培養溫度35°C培養15天。收集完成培養的各組牛樟芝，以實施例2至4所述方法測定各組牛樟芝內活性成份的含量，結果如圖6所示。
[0054]由圖6的結果可知，第一組所得的各活性成份含量，第二組和第三組所得的各活性成份含量均增加。更進一步而言，第二組所得獲得的總多酚和粗三萜含量分別為23.27mg/g和23.51mg/g,大幅高於第一組；而第三組的胞內多糖含量(121.26mg/g)比第一組所得的胞內多糖增加。因此，由圖6的結果顯示牛樟芝培養15天後將溫度升高至30?35°C得有助於提高其內活性成份的含量，如果要提升總多酚及粗三萜的含量是將溫度調整為30°C進行培養較佳；如果欲使胞內多糖的含量大幅增加則將溫度調整為35°C進行培養較佳。
[0055]實施例8固態培養基組成分析
[0056]首先，分別將糙米、苦蕎麥及紅薏仁予以磨製成粉末狀，而依據不同比例混合製備成為含水量為45%的固態培養基，設置4組，其中，各組培養基所使用的各成份比例如下，第一組是僅使用糙米粉，第二組為糙米粉、苦蕎麥粉和紅薏仁粉組成比例為5:2:1，第三組為糙米粉、苦蕎麥粉和紅薏仁粉組成比例為7:2:1，第四組為糙米粉、苦蕎麥粉和紅薏仁粉組成比例為9:2:1。將各組固態培養基滅菌後，將實例一的種菌以5%接菌量接至各組固態培養基中，進行牛樟芝培養3個月，以實施例2至4所述方法測定各組牛樟芝內活性成份的含量，結果如圖7所示。
[0057]由圖7的結果可知第四組所測得的各活性成份含量皆高於其他三組，顯示第四組所使用的固態培養基的組成比例(糙米粉:苦蕎麥粉:紅薏仁粉=9:2:1)是有助提升於牛樟芝內活性成份的含量。更進一步而言，由圖7的結果可知以糙米粉、苦蕎麥粉和紅薏仁粉混合製成的固態培養基中，紅薏仁粉所佔比例越低時，是越有助於提升牛樟芝內粗三萜的含量。
[0058]由上述各該實施例與實例的說明可知本發明所述牛樟芝的培養方法可通過光照來源和強度來控制，提升所培養的牛樟芝內活性成份含量，而輔以其他培養條件的控制，如以兩階段培養溫度的控制、培養基組成的調配、培養基的含水量等，可增加牛樟芝內活性成份的含量。因此，通過本發明所述牛樟芝的培養方法是可使牛樟芝子實體厚度增加，有效提高其內活性成份的產量，且所培養完成的牛樟芝可與培養基完全分離，增加未來商業利用的價值與變化性。
[0059]以上僅是通過各該實施例詳細說明本發明，熟知該【技術領域】者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中的實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案專利保護範圍所包含。
【權利要求】
1.一種牛樟芝的培養方法,該培養方法是將種菌接種於培養基中，在至少一培養條件下進行培養，所述培養條件包含有光照環境，所述光照環境是選自由綠光及藍光所組成的群。
2.如權利要求1所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述光照環境的照光強度為I μ mol/s.m2 至 20 μ mol/s.m2。
3.如權利要求2所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述光照環境為藍光時，該照光強度為 2 μ mol/s.m2 至 16 μ mol/s.m2。
4.如權利要求2所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述光照環境為綠光時，該照光強度為 Ilu mol/s.m2 至 20 μ mol/s.m2。
5.如權利要求1所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述培養條件還包含有25°C?35°C的培養溫度。
6.如權利要求1所述牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述培養基包含粉末狀基質及水。
7.如權利要求6所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述粉末狀基質具有至少一五穀雜糧。
8.如權利要求7所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述粉末狀基質是選自於由苦蕎麥粉、糙米粉和紅薏仁粉所組成的群。
9.如權利要求8所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述粉末狀基質由苦蕎麥粉、糙米粉和紅薏仁粉以一預定比例所組成。
10.如權利要求9所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述粉末狀基質中紅薏仁粉的含量是為最低，苦蕎麥粉的含量次之，糙米粉的含量最高。
11.如權利要求9所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述粉末狀基質中紅薏仁粉的含量是為最低，糙米粉的含量次之，苦蕎麥粉的含量最高。
12.如權利要求9所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述粉末狀基質的組成比例是以紅薏仁粉為1，糙米粉為紅薏仁粉的10?2倍，苦蕎麥粉為紅薏仁粉的2?10倍。
13.如權利要求12所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述糙米粉、苦蕎麥粉及紅薏仁粉的組成比例為9:2:1。
14.如權利要求6所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述培養基的水含量為35?55%。
15.如權利要求14所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述培養基的水含量為35 ?50%ο
16.如權利要求1所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述種菌是由打碎的牛樟芝菌塊所培養而得。
17.如權利要求1到16項中任一項所述的牛樟芝的培養方法,其特徵在於,所述方法包含二培養條件，其中一培養條件是在無光照環境下進行培養15天，另一培養條件是在所述光照環境下進行培養至少15天。
18.如權利要求17所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述一培養條件的培養溫度是低於另一培養條件的培養溫度。
19.如權利要求17所述的牛樟芝的培養方法，其特徵在於，所述一培養條件的培養溫 度是為25°C，另一培養條件的培養溫度是為25?35°C。
【文檔編號】A01G1/04GK104412830SQ201310432728
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】楊芳鏘, 吳嘉利, 紀亞辰 申請人:東海大學, 綠茵生技股份有限公司