具有簡單糖型的重組蛋白的產生的製作方法

2023-05-23 09:18:21

具有簡單糖型的重組蛋白的產生的製作方法
【專利摘要】本發明提供缺乏甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶I(Mgat1)的細胞系。本發明還提供用於產生所述Mga1缺乏的細胞系的方法以及用於使用所述Mgat1缺乏的細胞系來產生具有簡單糖型的重組蛋白的方法。
【專利說明】具有簡單糖型的重組蛋白的產生 發明領域
[0001] 本發明涉及具有簡單糖型的重組蛋白。具體來說，本發明涉及用於產生具有一個 或多個末端甘露糖殘基的重組糖蛋白的組合物和方法。
[0002] 發明背景
[0003] N-連接的糖基化是見於許多分泌以及膜結合糖蛋白上的一種常見蛋白質修飾。合 成複雜糖型需要一系列以逐步方式在真核細胞的內質網和高爾基體中進行的酶促反應。盡 管大多數重組治療性蛋白質需要存在複雜聚糖以避免免疫原性以及改進蛋白質半衰期，但 也存在應用具有簡單N-聚糖結構的糖蛋白。舉例來說，具有簡單糖型的重組蛋白有利於X 射線結晶學研究。另外，僅具有末端甘露糖殘基的簡單糖型可通過促進甘露糖受體介導的 對這些蛋白質的攝取而導致一些治療劑的功效增加。
[0004] 然而，用於產生治療性糖蛋白的大多數細胞系產生具有異質或複雜N-連接的糖 型的蛋白質。因此，對被工程改造來產生具有簡單糖型的重組糖蛋白的細胞系存在需要。此 夕卜，合乎需要的是這些工程改造細胞系穩定產生具有末端甘露糖殘基的蛋白質，同時保留 在化學成分確定的培養基中的高蛋白質產率和強健生長。
[0005] 概述
[0006] 在本公開的各個方面之中，提供一種缺乏甘露糖基（α-1，3-)_糖蛋白 β -1，2-Ν-乙醯氨基葡萄糖轉移酶I (Mgatl)的細胞系。在一個實施方案中，缺乏Mgatl的 細胞系不產生Mgatl蛋白。在另一實施方案中，相對於不缺乏Mgatl的親本細胞系，缺乏 Mgatl的細胞系產生的Mgatl蛋白的量降低。在一個實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系包 含編碼Mgatl的失活染色體序列。可用靶向性核酸內切酶使編碼Mgatl的染色體序列失 活。在某些實施方案中，靶向性核酸內切酶選自鋅指核酸酶、轉錄活化子樣效應物核酸酶 (TALEN)、大範圍核酸酶（meganuclease)和位點特異性核酸內切酶。在一個實施方案中，靶 向性核酸內切酶是鋅指核酸酶。在一些實施方案中，編碼Mgatl的染色體序列是由於缺失 至少一個鹼基對、插入至少一個鹼基對、取代至少一個鹼基對或其組合而失活。在某些實施 方案中，編碼Mgatl的染色體序列是由於缺失2-55個鹼基對而失活。在一個實施方案中， 缺乏Mgatl的細胞系也缺乏穀氨醯胺合成酶（GS)、二氫葉酸還原酶（DHFR)、次黃嘌呤-鳥 嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT)或其組合。在另一實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系是CH0細 胞系。在一個實施方案中，缺乏Mgatl的細胞系是通過缺失使編碼Mgatl的染色體序列的 單拷貝失活的CH0細胞系且所述細胞系不產生Mgatl。在另一實施方案中，缺乏Mgatl的細 胞系是通過缺失使編碼Mgatl的染色體序列的單拷貝失活的CHO GS-/-細胞系且所述細胞 系不產生Mgatl。在一個實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系表達至少一種具有簡單糖型的糖 蛋白，其中所述簡單糖型包含一個或多個末端甘露糖殘基。在一個實施方案中，Mgatl缺乏 的細胞系與不缺乏Mgatl的細胞系具有類似生長速率。在一個實施方案中，缺乏Mgatl的 細胞系與不缺乏Mgatl的細胞系產生類似蛋白質水平。
[0007] 本公開的另一方面涵蓋一種用於產生缺乏Mgatl的細胞的方法。所述方法包括用 靶向編碼Mgatl的染色體序列中的特定序列的靶向性核酸內切酶轉染宿主細胞。靶向性核 酸內切酶可為鋅指核酸酶、轉錄活化子樣效應物核酸酶（TALEN)、大範圍核酸酶或位點特異 性核酸內切酶。在一個實施方案中，革巴向性核酸內切酶是鋅指核酸酶。在一個實施方案中， 宿主細胞是哺乳動物細胞。在另一實施方案中，宿主細胞也缺乏穀氨醯胺合成酶（GS)、二氫 葉酸還原酶（DHFR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT)或其組合。在一個實施方案 中，宿主細胞是CHO細胞。在另一實施方案中，宿主細胞是GS-/-CHO細胞。在一個實施方 案中，使轉染的宿主細胞與菌麻凝集素-I(Ricinus communis agglutinin-I，RCA-Ι) -起 孵育。
[0008] 本公開的另一方面是一種用於產生具有一個或多個末端甘露糖殘基的重組蛋白 的方法。所述方法包括將編碼重組蛋白的核酸引入編碼Mgatl的所有染色體序列都被失活 以使細胞系不廣生Mgatl的所述細胞系中，以及表達所述重組蛋白。在個實施方案中，編 碼Mgatl的染色體序列是由選自鋅指核酸酶、轉錄活化子樣效應物核酸酶（TALEN)、大範圍 核酸酶和位點特異性核酸內切酶的靶向性核酸內切酶失活。在一個實施方案中，靶向性核 酸內切酶是鋅指核酸酶。在一個實施方案中，編碼Mgatl的失活染色體序列包含缺失2-55 個鹼基對。在一個實施方案中，不產生Mgatl的細胞系是CH0細胞系。在另一實施方案中， 不產生Mgatl的細胞系是GS-/-CH0細胞系。在一個實施方案中，表達的重組蛋白具有包含 一個或多個末端甘露糖殘基的簡單糖型。
[0009] 下文更詳細描述本公開的其它方面和迭代。
[0010] 附圖簡述
[0011] 圖1是顯示Mgatl在N-聚糖合成中的作用的示意圖。Mgatl催化GlcNAc殘基向 Man5GlcNAc2(Man5)糖型的轉移。
[0012] 圖2說明祀向Mgatl的鋅指核酸酶（ZFN)的設計和驗證。⑷呈現ZFN被設計來 結合且在Mgatl編碼區域中切割的位置的圖解說明。（B)顯示通過Cell核酸酶測定對ZFN 活性的驗證。顯示的是在轉染後第3天和第10天的來自模擬轉染的細胞、用DNA轉染的細 胞和用RNA轉染的細胞的基因組DNA消化物。兩個DNA片段220bp和197bp存在於轉染後 第3天和第10天的消化物中。
[0013] 圖3呈現在RCA-Ι富集之前和之後的Cell分析。顯示的是用DNA或RNA轉染的 細胞在RCA-Ι富集之前和之後以及模擬轉染的細胞的基因組DNA消化物。如通過密度計量 術測定的改進百分比列於各泳道下方。
[0014] 圖4顯示在進行或不進行RCA-Ι富集下，MgatlZFN轉染的細胞的IgG糖譜。（A)呈 現由模擬轉染的細胞、用ZFN DNA或RNA轉染的細胞在不進行RCA-Ι選擇下、和用ZFN DNA 或RNA轉染的細胞在進行RCA-Ι選擇下產生的IgG中的各糖型（Man5、G0、G0F、GlF和G2F) 的百分比。（B)圖解測定的各糖型的結構。
[0015] 圖5呈現Mgatl破壞的IgG產生性克隆的基因型。顯示的是以下細胞系的序列比 對：非轉染的野生型（wt);經受ZFN轉染和克隆分離的兩個野生型克隆（15號、46號）；在 無RCA-Ι下選擇的兩個Mgatl破壞的細胞系（73號、92號）和在RCA-Ι存在下選擇的四個 Mgatl破壞的細胞系（21號、25號、27號、37號）。陰暗區域標記ZFN切割位點。
[0016] 圖6說明Mgatl敲除克隆對RCA-Ι的不敏感性。繪製的是在不存在或存在RCA-I 下生長時，野生型（wt、15號、46號）和Mgatl敲除（73號、92號、21號、25號、27號、37號） 克隆的分批培養物中的峰值活細胞密度。
[0017] 圖7顯示野生型和Mgatl敲除IgG產生性克隆的IgG糖譜。（A)顯示在第5天自 非轉染的（wt)和兩個野生型（15號、46號）克隆收集的IgG樣本中的不同糖型的百分比。 (B)呈現在第5天自六個Mgatl敲除（73號、92號、21號、25號、27號、37號）克隆收集的 IgG樣本中的不同糖型的百分比。（C)顯示在第8天自野生型克隆收集的IgG樣本中的不 同糖型的百分比。（D)呈現在第8天自六個Mgatl敲除克隆收集的IgG樣本中的不同糖型 的百分比。ND=未檢測出。
[0018] 圖8說明野生型和Mgatl敲除克隆隨時間的生長。（A)呈現在分批培養中，野生型 (wt、15號、46號）和Mgatl敲除（73號、92號、21號、25號、27號、37號）克隆歷經13天的 活細胞百分比。（B)顯示野生型和六個Mgatl敲除克隆歷經13天的分批培養中的活細胞密 度。
[0019] 圖9顯示野生型和Mgatl敲除克隆的IgG產率。繪製的是野生型（wt、15號、46 號）和Mgatl敲除（73號、92號、21號、25號、27號、37號）克隆的峰值體積產率。
[0020] 發明詳述
[0021] 本公開提供用於產生具有簡單糖型的重組蛋白的組合物和方法，其中簡單糖型包 含一個或多個末端甘露糖殘基。具體來說，本公開提供缺乏甘露糖基（α-l，3-)_糖蛋白 β -1，2-Ν-乙醯氨基葡萄糖轉移酶I (Mgatl)的細胞系。在一些實施方案中，Mgatl缺乏的 細胞系包含失活或敲除的編碼Mgatl的染色體序列以使所述細胞系不產生Mgatl。因此，細 胞系產生具有一個或多個末端甘露糖殘基的糖蛋白。本文公開的Mgatl缺乏的細胞系適用 於疫苗產生，因為具有末端甘露糖殘基的糖蛋白有助於甘露糖受體介導的攝取。另外，具有 簡單糖型的糖蛋白適用於X射線結晶學研究。此外，本文公開的Mgatl缺乏的細胞避免與 隨機化學突變誘發相關的潛在調控擔憂且維持與親本細胞系的生長和產率特徵類似的生 長和產率特徵。
[0022] 本公開也提供用於製備Mgatl缺乏的細胞的方法。舉例來說，可通過使用靶向性 核酸內切酶使編碼Mgatl的染色體序列失活來製備缺乏Mgatl的細胞。也提供用於使用本 文公開的Mgatl缺乏的細胞產生具有簡單糖型的重組糖蛋白的方法。
[0023] (I)Mgatl缺乏的細胞系
[0024] (a)細胞系的性質
[0025] 本公開的一個方面涵蓋缺乏Mgatl的細胞系。Mgatl也稱為N-乙醯氨基葡萄 糖轉移酶I(GlcAc-TI或GnTI)或N-糖基-寡糖-糖蛋白N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶 I。Mgatl催化N-乙醯氨基葡萄糖（GlcNAc)轉移至增長N-聚糖的寡甘露糖核心（即 Man5GlcNAc2(Man5)部分）上（參見圖 1)。
[0026] 在一些實施方案中，相對於親本細胞系，Mgatl缺乏的細胞系的Mgatl水平降低。 舉例來說，相對於不缺乏Mgatl的親本細胞系，Mgatl缺乏的細胞系中的Mgatl的水平可從 約5 %降低至約10 %，從約10 %降低至約20 %，從約20 %降低至約30 %，從約30 %降低至 約40 %，從約40 %降低至約50 %，從約50 %降低至約60 %，從約60 %降低至約70 %，從約 70 %降低至約80 %，從約80 %降低至約90 %，或從約90%降低至約99. 9 %。在其它實施 方案中，Mgat 1缺乏的細胞系基本上不產生Mgat 1。如本文所用，術語"基本上無Mgat 1"是 指使用本領域中熟知的程序，無MgatlmRNA和/或蛋白質可在Mgatl缺乏的細胞系或源於 其的溶解產物中被檢測到。適用於測定mRNA或蛋白質的水平的程序的非限制性實例包括 PCR、qPCR、蛋白質印跡和ELISA測定。
[0027] 缺乏Mgatl的細胞系產生具有簡單糖型的糖蛋白。簡單糖型是指包含一個或多個 末端甘露糖殘基的糖型。一般來說，簡單糖型缺乏半乳糖和/或唾液酸殘基。示例性簡單 糖型是Man5GlcNac2或Man5。在一些實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系可產生末端甘露糖 殘基的水平從約1. 1倍增加至約3倍，從約3倍增加至約10倍，從約10倍增加至約30倍， 從約30倍增加至約100倍，或超過約100倍的糖蛋白。在其它實施方案中，Mgatl缺乏的 細胞系可產生末端半乳糖和/或唾液酸殘基的水平從約1. 1倍降低至約3倍，從約3倍降 低至約10倍，從約10倍降低至約30倍，從約30倍降低至約100倍，或超過約100倍的糖 蛋白。
[0028] Mgatl缺乏的細胞系的蛋白質產生水平或產率水平與不缺乏Mgatl的細胞系的蛋 白質產生水平或產率水平類似。如本文所用，"類似蛋白質產生"是指Mgatl缺乏的細胞系 產生的蛋白質水平與不缺乏Mgatl的細胞系大致相同或高於不缺乏Mgatl的細胞系。蛋白 質產率可通過測定每單位體積產生的蛋白質的量（即峰值體積產率）來定量。在一些實施 方案中，相對於由不缺乏Mgatl的細胞系產生的蛋白質的量，由Mgatl缺乏的細胞系產生 的蛋白質的量可變化約±10%。在其它實施方案中，相對於由不缺乏Mgatl的細胞系產生 的蛋白質的量，由Mgatl缺乏的細胞系產生的蛋白質的量可從約10%增加至約20%，從約 20 %增加至約30%，從約30 %增加至約40%，或從約40 %增加至約50%。
[0029] Mgatl缺乏的細胞系的生長速率與不缺乏Mgatl的細胞系的生長速率類似。如本 文所用，"類似生長速率"是指相對於不缺乏Mgatl的細胞系增加或相對於不缺乏Mgatl的 細胞系降低小於約50%的生長速率。可通過在培養某一時期之後測定活細胞的百分比或 每單位體積的活細胞的數目（即活細胞密度）來定量生長速率。在一些實施方案中，Mgatl 缺乏的細胞系相對於不缺乏Mgatl的細胞系具有增加的生長速率。舉例來說，相對於不缺 乏Mgatl的細胞系，Mgatl缺乏的細胞系的活細胞百分比或活細胞密度可從約1 %增加至約 10%，從約10%增加至約30%，從約30%增加至約5%，從約50%增加至約100%，或超過 100%。在其它實施方案中，相對於不缺乏Mgatl的細胞系，Mgatl缺乏的細胞系的活細胞 百分比或活細胞密度可從約1 %降低至約10%，從約10 %降低至約30%，從約30 %降低至 約 50%。
[0030] 本文公開的Mgatl缺乏的細胞系具有穩定表型。舉例來說，Mgatl缺乏的細胞系持 續延長時期和/或歷經無數代細胞產生具有簡單糖型的糖蛋白。換句話說，本文公開的細 胞系不回復產生具有複雜糖型的糖蛋白。另外，缺乏Mgatl的細胞系持續延長時期和/或 歷經無數代細胞維持高水平的蛋白質產率和出色生長速率。
[0031] (b)編碼Mgatl的失活染色體序列
[0032] 在一些實施方案中，缺乏Mgatl的細胞系包含編碼Mgatl的失活染色體序列。舉例 來說，細胞系的基因組可被編輯以使編碼Mgatl的染色體序列失活。如本文所用，術語"失 活染色體序列"是指不能產生蛋白質產物的染色體序列。在細胞系包括整倍體細胞的實施 方案中，編碼Mgatl的失活染色體序列可為單等位基因以使細胞系產生的Mgatl的水平降 低。在細胞系包括整倍體細胞的其它實施方案中，編碼Mgatl的失活染色體序列可為雙等 位基因以使所述細胞系不產生Mgatl。在細胞系是非整倍體的其它實施方案中，可使編碼 Mgatl的染色體序列的一個或多個拷貝失活以使細胞產生的Mgatl的量降低。在細胞系是 非整倍體的其它實施方案中，可使編碼Mgatl的染色體序列的所有拷貝都失活以使所述細 胞系不產生Mgatl。在示例性實施方案中，細胞系就編碼Mgatl的染色體序列而言是單倍 體,且編碼Mgatl的染色體序列的失活導致Mgatl表達完全喪失。
[0033] 可通過缺失至少一個鹼基對（bp)、插入至少一個bp、取代至少一個bp或其組合使 編碼Mgatl的染色體序列失活。由於缺失、插入和/或取代，Mgatl編碼序列經受閱讀框移 動，由此防止產生蛋白質產物。可使用如以下在章節（II)中詳述的靶向性核酸內切酶介 導的基因組編輯技術使編碼Mgatl的染色體序列失活。在各種實施方案中，可通過缺失外 顯子編碼區域的全部或一部分、缺失控制區域的全部或一部分、和/或缺失拼接位點以使 Mgatl的表達消除來使編碼Mgatl的染色體序列失活。在其它實施方案中，可通過缺失、插 入和/或核苷酸取代以將過早終止密碼子、新拼接位點和/或SNP引入染色體序列中以使 細胞系不能產生Mgatl來使編碼Mgatl的染色體序列失活。
[0034] 在一個實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系包含在編碼Mgatl的染色體序列的約lbp 至整個編碼區域的範圍內的缺失。在另一實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系包含在Mgatl的 編碼區域的約2bp至約55bp、約55bp至約100bp、約100bp至約300bp、約300bp至約600bp、 約600bp至約1200bp、或超過約1200bp的範圍內的缺失。在示例性實施方案中，Mgatl缺 乏的細胞系包含編碼Mgatl的染色體序列的2bp、4bp、7bp、10bp、18bp、24bp、28bp或55bp 的缺失。在另一示例性實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系包含編碼Mgatl的染色體序列的 由104bp的插入所置換的157bp的缺失。
[0035] (c)任選的其它缺乏
[0036] 在一些實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系也包含穀氨醯胺合成酶（GS)、二氫葉酸 還原酶（DHFR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT)或其組合的缺乏。GS、DHFR和/ 或HPRT的缺乏可為天然存在的。或者，GS、DHFR和/或HPRT的缺乏可為工程改造的。舉 例來說，因為細胞包含失活的編碼GS、DHFR或HPRT的染色體序列，所以細胞可分別缺乏GS、 DHFR或HPRT。在一些實施方案中，可通過靶向性核酸內切酶介導的基因組編輯使編碼GS、 DHFR或HPRT的染色體序列失活。在示例性實施方案中，使編碼GS、DHFR或HPRT的染色體 序列的所有拷貝都失活以使細胞系分別不產生GS、DHFR或HPRT。在示例性實施方案中， Mgatl缺乏的細胞系是GS-/-。
[0037] (d)細胞系類型
[0038] 缺乏Mgatl的細胞系的類型可變化。細胞系可為人細胞系、非人哺乳動物細胞系、 非哺乳動物脊椎動物細胞系、無脊椎動物細胞系或酵母細胞系。
[0039] 適合哺乳動物細胞系的非限制性實例包括中國倉鼠卵巢（CH0)細胞、幼小倉鼠腎 (BHK)細胞；小鼠骨髓瘤NS0細胞、小鼠胚胎成纖維細胞3T3細胞（NIH3T3)、小鼠B淋巴瘤 A20細胞；小鼠黑素瘤B16細胞；小鼠成肌細胞C2C12細胞；小鼠骨髓瘤SP2/0細胞；小鼠胚 胎間質C3H-10T1/2細胞；小鼠癌瘤CT26細胞、小鼠前列腺DuCuP細胞；小鼠乳房EMT6細 胞；小鼠肝細胞瘤Η印alclc7細胞；小鼠骨髓瘤J5582細胞；小鼠上皮MTD-1A細胞；小鼠心 肌MyEnd細胞；小鼠腎RenCa細胞；小鼠胰腺RIN-5F細胞；小鼠黑素瘤X64細胞；小鼠淋巴 瘤YAC-1細胞；大鼠成膠質細胞瘤9L細胞；大鼠B淋巴瘤RBL細胞；大鼠成神經細胞瘤B35 細胞；大鼠肝細胞瘤細胞（HTC);水牛鼠肝BRL3A細胞；犬腎細胞（MDCK);犬乳腺（CMT)細 胞；大鼠骨肉瘤D17細胞；大鼠單核細胞/巨噬細胞DH82細胞；猴腎SV-40轉化的成纖維 細胞（C0S7)細胞；猴腎CVI-76細胞；非洲綠猴腎（VER0-76)細胞；人胚腎細胞（HEK293、 HEK293T);人宮頸癌細胞（HELA);人肺細胞（W138);人肝細胞〇fep G2);人U2-0S骨肉瘤細 胞、人A549細胞、人A-431細胞和人K562細胞。哺乳動物細胞系的詳盡清單可見於美國典 型培養物保藏中心（American Type Culture Collection)目錄（ATCC，Mamassas，VA)中。
[0040] 適合非哺乳動物細胞系的實例包括但不限於非洲蟾蜍屬（Xenopus)細胞系（如 S3、XTC、BB7、ff-2、15/0和15/40);斑馬魚細胞系（如ZF4、PAC2等）；昆蟲細胞系（如SF9、 S2等）；和酵母細胞系，如畢赤酵母屬細胞系以及酵母屬細胞系。
[0041] 在示例性實施方案中，細胞系是廣泛用於產生重組蛋白，如抗體、糖蛋白等的類 型。在示例性實施方案中，細胞系是CH0細胞系。眾多CH0細胞系可從ATCC獲得。適合 CH0細胞系包括但不限於CH0-K1細胞及其衍生物。
[0042] (e)任選的核酸
[0043] 在一些實施方案中，Mgatl缺乏的細胞系可進一步包含至少一種編碼重組蛋白的 核酸序列。一般來說，重組蛋白是異源的，這指的是所述蛋白質不為細胞所天然具有。重組 蛋白可不加限制地為抗體、抗體片段、單克隆抗體、人源化抗體、人源化單克隆抗體、嵌合抗 體、IgG分子、IgG重鏈、IgG輕鏈、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、疫苗、生長因子、 細胞因子、幹擾素、白介素、激素、凝結（或凝血）因子、血液組分、酶、治療性蛋白質、營養蛋 白質、上文任一種的功能性片段或功能性變體、或包含上文蛋白質和/或其功能性片段或 變體的任一種的融合蛋白。
[0044] 在一些實施方案中，編碼重組蛋白的核酸序列可連接於編碼次黃嘌呤-鳥嘌呤磷 酸核糖轉移酶（HPRT)、二氫葉酸還原酶（DHFR)和/或穀氨醯胺合成酶（GS)的核酸序列，以 使HPRT、DHFR和/或GS可用作可擴增的可選擇標記物。
[0045] 在一些實施方案中，編碼重組蛋白的核酸序列可為染色體外的。也就是說，編碼 重組蛋白的核酸可從質粒、粘粒、人工染色體、微型染色體或另一染色體外構建體短暫表 達。表達構建體可包含其它表達控制序列（例如增強子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序 列、轉錄終止序列等）、可選擇標記物序列（例如抗生素抗性基因）、複製起點等。其它信息 可見於"Current Protocols in Molecular Biology，'Ausubel 等，John Wiley&Sons, New York, 2003 或"Molecular Cloning:A Laboratory Manual''Sambrook 和 Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY,第 3 版，2001 中。
[0046] 在其它實施方案中，編碼重組蛋白的核酸序列可染色體性地整合入細胞的基因組 中。因此，重組蛋白可被穩定表達。在這個實施方案的一些迭代中，編碼重組蛋白的核酸 序列可可操作地連接於適當異源表達控制序列（即啟動子）。在其它迭代中，編碼重組蛋 白的核酸序列可置於內源性表達控制序列的控制之下。可使用同源重組、靶向性核酸內切 酶介導的基因組編輯、病毒載體、轉位子、質粒和其它熟知手段使編碼重組蛋白的核酸序列 整合入細胞系的基因組中。其它指導可見於Ausubel等2003(上文）以及Sambrook和 Russell, 2001(上文）中。
[0047] (f)示例性實施方案
[0048] 在一個示例性實施方案中，細胞系是編碼Mgatl的染色體序列的單拷貝被失活的 CH0細胞系（即細胞的基因型是Mgatl-/0)。在另一示例性實施方案中，細胞系是編碼Mgatl 的染色體序列的單拷貝被失活的GS-/-CH0細胞系（即細胞的基因型是GS-/-，Mgatl-/0)。 一般來說，通過缺失編碼序列的一部分使編碼Mgatl的染色體序列失活。
[0049] (II)用於製備缺乏Mgatl的細胞系的方法
[0050] 可通過多種方法製備缺乏Mgatl的細胞系。在某些實施方案中，可通過靶向性核 酸內切酶介導的基因組編輯方法製備Mgatl缺乏的細胞系。在其它實施方案中，可通過 RNAi方法、隨機突變誘發、位點特異性重組系統或本領域中已知的其它方法製備Mgatl缺 乏的細胞系。
[0051] 缺乏Mgatl的細胞系廣生具有一個或多個末端甘露糖殘基的糖蛋白。在其它實 施方案中，Mgatl缺乏的細胞系可通過與蓖麻凝集素-I(RCA-I) -起孵育來進一步富集。 RCA-Ι是一種細胞毒性凝集素，其不結合末端甘露糖殘基且因此允許選擇缺乏Mgatl活性 的細胞，因為所述細胞廣生具有末端甘露糖殘基的糖蛋白。
[0052] (a)靶向性核酸內切酶介導的基因組編輯
[0053] 靶向性核酸內切酶可用於編輯（即失活或修飾）特定染色體序列。可通過將靶向 性核酸內切酶或編碼所述靶向性核酸內切酶的核酸引入細胞中使特定染色體序列失活，所 述靶向性核酸內切酶被工程改造來靶向特定染色體序列。在一個實施方案中，靶向性核酸 內切酶識別並結合特定染色體序列且引入通過非同源末端接合（NHEJ)修復過程修復的雙 鏈斷裂。因為NHEJ是易出錯的，所以可能發生缺失、插入和/或取代至少一個核苷酸，由此 破壞染色體序列的閱讀框以致不產生蛋白質產物。在另一實施方案中，靶向性核酸內切酶 也可用於通過共同引入與靶向的染色體序列的一部分具有實質性序列同一性的聚核苷酸， 通過同源重組反應來編輯染色體序列。由靶向性核酸內切酶引入的雙鏈斷裂是通過同源性 定向修復過程來修復以使以導致染色體序列被編輯的方式使染色體序列與聚核苷酸交換。
[0054] (i)靶向件核酸內切酶
[0055] 多種靶向性核酸內切酶可用於編輯染色體序列。靶向性核酸內切酶可為天然存在 的蛋白質或工程改造蛋白質。在一個實施方案中，靶向性核酸內切酶可為大範圍核酸酶。大 範圍核酸酶是特徵在於識別序列較長，即識別序列通常在約12個鹼基對至約40個鹼基對 的範圍內的脫氧核糖核酸內切酶。由於這個要求，識別序列通常僅在任何給定基因組中出 現一次。在大範圍核酸酶之中，名為LAGLIDADG的歸巢核酸內切酶的家族已成為基因組和 基因組工程改造研究的一種有價值工具。可使用為本領域技術人員所熟知的技術，通過修 飾大範圍核酸酶的識別序列來使所述大範圍核酸酶靶向特定染色體序列。
[0056] 在另一實施方案中，靶向性核酸內切酶可為轉錄活化子樣效應物（TALE)核酸酶。 TALE是來自植物病原體黃單胞菌屬的轉錄因子，其可易於被工程改造來結合新型DNA靶 標。TALE或其截短形式可連接於如FokI的核酸內切酶的催化結構域以產生稱為TALE核酸 酶或 TALEN 的靶向性核酸內切酶（Sanjana 等，2012, Nat Protoc, 7 (1) : 171-192)。
[0057] 在另一實施方案中，靶向性核酸內切酶可為位點特異性核酸內切酶。具體來說，位 點特異性核酸內切酶可為識別序列很少存在於基因組中的"稀有切點（rare-cutter) "核酸 內切酶。通常，位點特異性核酸內切酶的識別序列僅在基因組中出現一次。在另一替代實 施方案中，靶向性核酸內切酶可為靶向的DNA雙鏈斷裂人工誘導劑。
[0058] 在示例性實施方案中，靶向性核酸內切酶可為鋅指核酸酶（ZFN)。通常，ZFN包含 DNA結合結構域（即鋅指）和裂解結構域（即核酸酶），其兩者均在以下加以描述。
[0059] 鐸指結合結構域。鐸指結合結構域可被工稈改造來識別和結合仟何所詵核 酸序列。參見例如 Beerli 等（2002)Nat.Biotechnol.20:135_141 ;Pabo 等（2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340 ;Isalan 等（2001)Nat. Biotechnol. 19:656-660 ;Segal 等（2001)Curr.0pin· Biotechnol. 12:632-637 ;Choo 等（2000)Curr.0pin· Struct. Biol. 10:411-416 ;Zhang 等（2000)J. Biol. Chem. 275 (43):33850-33860 ;Doyon 等 (2008) Nat. Biotechnol. 26: 702-708;和 Santiago 等（2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA105:5809-5814。相較於天然存在的鋅指蛋白質，工程改造鋅指結合結構域可具有新穎 結合特異性。工程改造方法包括但不限於合理設計和各種類型的選擇。合理設計包括例如 使用包含雙聯體、三聯體和/或四聯體核苷酸序列和個別鋅指胺基酸序列的資料庫，其中 各雙聯體、三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列的鋅指的一個或多 個胺基酸序列相關。參見例如美國專利號6, 453, 242和6, 534, 261，所述專利的公開內容以 引用的方式整體併入本文。舉例來說，美國專利6, 453, 242中所述的算法可用於設計鋅指 結合結構域以靶向預先選擇的序列。替代方法，如使用非簡併識別代碼表的合理設計也可 用於設計鋅指結合結構域以革巴向特定序列（Sera等（2002)Biochemistry41:7074-7081)。 用於鑑定DNA序列中的潛在靶位點以及設計鋅指結合結構域的公開可用的網絡基工具在 本領域中是已知的。舉例來說，用於鑑定DNA序列中的潛在靶位點的工具可見於http:// www. zincfingertools. org處。用於設計鋅指結合結構域的工具可見於http://zifit. partners.org/ZiFiT 處。（也參見Mandell 等（2006)Nuc. Acid Res. 34:W516_W523;Sander 等（2007)Nuc.Acid Res.35:W599-W605。）
[0060] 鋅指結合結構域可被設計來識別並結合長度在約3個核苷酸至約21個核苷酸的 範圍內的DNA序列。在一個實施方案中，鋅指結合結構域可被設計來識別並結合長度在約 9至約18個核苷酸的範圍內的DNA序列。一般來說，本文使用的鋅指核酸酶的鋅指結合結 構域包含至少三個鋅指識別區域或鋅指，其中各鋅指結合3個核苷酸。在一個實施方案中， 鋅指結合結構域包含四個鋅指識別區域。在另一實施方案中，鋅指結合結構域包含五個鋅 指識別區域。在另一實施方案中，鋅指結合結構域包含六個鋅指識別區域。鋅指結合結構 域可被設計來結合任何適合靶DNA序列。參見例如美國專利號6, 607, 882 ;6, 534, 261和 6, 453, 242，所述專利的公開內容以引用的方式整體併入本文。
[0061] 選擇鋅指識別區域的示例性方法包括描述於以下專利中的噬菌體展示和雙雜交 系統：美國專利號 5, 789, 538 ;5, 925, 523 ;6, 007, 988 ;6, 013, 453 ;6, 410, 248 ;6, 140, 466 ; 6, 200, 759 ;和 6, 242, 568 ;以及 TO 98/37186 ;W0 98/53057 ;W0 00/27878 ;W0 01/88197 和 GB2, 338, 237,所述專利各自以引用的方式整體併入本文。此外，已例如在W0 02/077227中 描述鋅指結合結構域的結合特異性的增強，所述專利的整個公開內容以引用的方式併入本 文。
[0062] 設計和構建融合蛋白（和其編碼聚核苷酸）的鋅指結合結構域和方法為本領域 技術人員所知且詳述於例如美國專利號7, 888, 121中，所述專利以引用的方式整體併入本 文。可使用適合接頭序列（包括例如長度是五個或更多個胺基酸的接頭）將鋅指識別區域 和/或多指鋅指蛋白質連接在一起。對於長度是六個或更多個胺基酸的接頭序列的非限制 實例，參見美國專利號6, 479, 626 ;6, 903, 185 ;和7, 153, 949,所述專利的公開內容以引用 的方式整體併入本文。本文所述的鋅指結合結構域可在蛋白質的個別鋅指之間包括適合接 頭的組合。
[0063] 在一些實施方案中，鋅指核酸酶進一步包含核定位信號或序列（NLS)。NLS是 有助於將鋅指核酸酶蛋白質靶向至核中以在染色體中的靶序列處引入雙鏈斷裂的氨 基酸序列。核定位信號在本領域中是已知的。參見例如Makkerh等（1996) Current Biology6:1025-1027。
[0064] 裂解結構域。鋅指核酸酶也包括裂解結構域。鋅指核酸酶的裂解結構域部分可從 任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得。可從其獲得裂解結構域的核酸內切酶的非限制性實例 包括但不限於限制核酸內切酶和歸巢核酸內切酶。參見例如New England Biolabs目錄或 Belfort 等（1997)Nucleic Acids Res. 25:3379-3388。裂解 DNA 的其它酶是己知的（例如 S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母H0核酸內切酶）。也參見Linn 等（編）Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, I993。這些酶（或其功能性 片段）的一個或多個可用作裂解結構域的來源。
[0065] 裂解結構域也可源於裂解活性需要二聚化的如上所述的酶或其部分。兩個鋅指核 酸酶可為裂解所需，因為各核酸酶包含活性酶二聚體的單體。或者，單一鋅指核酸酶可包含 兩個單體以產生活性酶二聚體。如本文所用，"活性酶二聚體"是能夠裂解核酸分子的酶二 聚體。兩個裂解單體可源於相同核酸內切酶（或其功能性片段），或各單體可源於不同核酸 內切酶（或其功能性片段）。
[0066] 當兩個裂解單體用於形成活性酶二聚體時，兩個鋅指核酸酶的識別位點優選被安 置來使兩個鋅指核酸酶與它們的相應識別位點的結合使裂解單體彼此處於允許裂解單體 例如通過二聚化來形成活性酶二聚體的空間定向。因此，識別位點的近側邊緣可由約5至 約18個核苷酸分隔。舉例來說，近側邊緣可由約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或 18個核苷酸分隔。然而，應了解任何整數個核苷酸或核苷酸對都可插入兩個識別位點之間 (例如約2至約50個核苷酸對或更多個核苷酸對）。鋅指核酸酶的識別位點的近側邊緣 (諸如像本文詳述的那些）可由6個核苷酸分隔。一般來說，裂解位點位於識別位點之間。 [0067] 限制核酸內切酶（限制酶）存在於許多物種中且能夠以序列特異性方式結合 DNA (在識別位點處），且在結合位點處或附近裂解DNA。某些限制酶（例如IIS型）在遠離 識別位點的位點處裂解DNA且具有可分開的結合結構域和裂解結構域。舉例來說，IIS型酶 FokI在距它的處於一條鏈上的識別位點9個核苷酸處且在距它的處於另一條鏈上的識別 位點13個核苷酸處催化DNA的雙鏈裂解。參見例如美國專利號5, 356, 802 ;5, 436, 150和 5, 487, 994 ;以及 Li 等（1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4275-4279 ;Li 等（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2764-2768 ;Kim 等（1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:883-887 ; Kim等（1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982。因此，鋅指核酸酶可包含來自至少一種IIS 型限制酶的裂解結構域和一個或多個可或可不加以工程改造的鋅指結合結構域。示例性 IIS型限制酶例如描述於國際公布W0 07/014,275中，所述公布的公開內容以引用方式整 體併入本文。其它限制酶也含有可分開的結合結構域和裂解結構域，且這些酶也由本公開 涵蓋。參見例如 Roberts 等（2003)Nucleic Acids Res. 31:418-420。
[0068] 裂解結構域可與結合結構域分開的示例性IIS型限制性酶是FokI。這個特定酶以 二聚體形式具有活性（Bitinaite 等（1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:10, 570-10, 575)。 因此，出於本公開的目的，在鋅指核酸酶中使用的FokI酶的部分被認為是裂解單體。因此， 對於使用FokI裂解結構域的靶向的雙鏈裂解，兩個各自包含FokI裂解單體的鋅指核酸酶 可用於重構活性酶二聚體。或者，也可使用含有鋅指結合結構域和兩個FokI裂解單體的單 一多肽分子。
[0069] 在某些實施方案中，裂解結構域包含一個或多個使均二聚化最小或防止均二聚化 的工程改造裂解單體。作為非限制實例，在FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、 490、491、496、498、499、500、531、534、537和538處的胺基酸殘基都是影響？〇1^1裂解半結構 域的二聚化的靶標。形成專性雜二聚體的FokI的示例性工程改造裂解單體包括成對單體， 其中第一裂解單體在FokI的胺基酸殘基位置490和538處包括突變且第二裂解單體在氨 基酸殘基位置486和499處包括突變。
[0070] 因此，在工程改造裂解單體的一個實施方案中，在胺基酸位置490處的突變將 Glu(E)替換為Lys(K);在胺基酸殘基538處的突變將Iso(I)替換為Lys(K);在胺基酸殘基 486處的突變將Gin (Q)替換為Glu (E);且在位置499處的突變將Iso (I)替換為Lys (K)。具 體來說，工程改造裂解單體可通過以下方法來製備：在一個裂解單體中將位置490自E突變 為K且將位置538自I突變為K來產生稱為"E490K:I538K"的工程改造裂解單體，且在另一 裂解單體中將位置486自Q突變為E且將位置499自I突變為K來產生稱為"Q486E:I499K" 的工程改造裂解單體。上述工程改造裂解單體是異常裂解得以最小化或消除的專性雜二聚 體突變體。工程改造裂解單體可使用適合方法，例如，如美國專利號7, 888, 121中所述，通 過野生型裂解單體（FokI)的定點突變誘發製備，所述專利整體併入本文。
[0071] (ii)仵詵的聚核苷酸
[0072] 在一些實施方案中，用於靶向的基因組編輯的方法進一步包括將至少一種聚核苷 酸引入細胞中，所述聚核苷酸包含與在靶向的裂解位點的至少一側上的序列具有實質性序 列同一性的序列。舉例來說，聚核苷酸可包含與在靶向的裂解位點的一側上的序列具有實 質性序列同一性的第一序列和與在靶向的裂解位點的另一側上的序列具有實質性序列同 一性的第二序列。或者，聚核苷酸可包含與在靶向的裂解位點的一側上的序列具有實質性 序列同一性的第一序列和與遠離靶向的裂解位點定位的序列具有實質性序列同一性的第 二序列。遠離靶向的裂解位點定位的序列可為靶向的裂解位點的上遊或下遊的數十、數百 或數千個核苷酸。
[0073] 聚核苷酸中與染色體序列中的序列具有實質性序列同一性的第一和第二序列的 長度可變化且將變化。一般來說，聚核苷酸中的第一和第二序列各自長度是至少約10個核 苷酸。在各種實施方案中，與染色體序列具有實質性序列同一性的聚核苷酸序列的長度可 在約10至30個核苷酸、約30至約100個核苷酸、約100至約300個核苷酸、約300至約 1000個核苷酸、約1000至約3000個核苷酸、或超過3000的範圍內。
[0074] 短語"實質性序列同一性"是指聚核苷酸中的序列與目標染色體序列具有至少約 75 %序列同一性。舉例來說，聚核苷酸中的至少一個序列可與靶向的染色體序列相同，例外 之處是它含有缺失、插入和/或取代至少一個核苷酸以使在同源重組後將改變的序列引入 染色體序列中。在各種實施方案中，聚核苷酸中的序列可與目標染色體序列具有約75 %、 76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性。
[0075] 在替代實施方案中，聚核苷酸可包含由與染色體序列具有實質性序列同一性的序 列側接的另一序列。在同源重組後，另一序列可整合入染色體序列中，由此使染色體序列失 活和/或修飾染色體序列。
[0076] 聚核苷酸的長度可變化且將變化。舉例來說，聚核苷酸的長度可在約20個核苷酸 直至約200, 000個核苷酸的範圍內。在各種實施方案中，聚核苷酸的長度在約20個核苷酸 至約100個核苷酸、約100個核苷酸至約1000個核苷酸、約1000個核苷酸至約10, 000個 核苷酸、約10, 〇〇〇個核苷酸至約100, 〇〇〇個核苷酸、或約100, 〇〇〇個核苷酸至約200, 000 個核苷酸的範圍內。
[0077] 通常,聚核苷酸將為DNA。。DNA可為單鏈或雙鏈。供體聚核苷酸可為DNA質粒、細 菌人工染色體（BAC)、酵母人工染色體（YAC)、病毒載體、一段線性DNA、PCR片段、裸核酸或 與遞送媒介物（如脂質體或泊洛沙姆（poloxamer))複合的核酸。
[0078] 在一些實施方案中，聚核苷酸可進一步包含標記物。適合標記物的非限制性實例 包括限制位點、突光蛋白質或可選擇標記物。所述標記物使得能夠篩選祀向的整合物。
[0079] (iii)引入細朐中
[0080] 可將靶向性核酸內切酶以蛋白質形式或以編碼靶向性核酸內切酶的核酸形式引 入細胞中。編碼靶向性核酸內切酶的核酸可為DNA或RNA(即mRNA)。在編碼核酸是mRNA 的實施方案中，mRNA可被5'加帽和/或3'聚腺苷酸化。在編碼核酸是DNA的實施方案中， DNA可為線性或環狀。DNA可為載體的一部分，其中編碼DNA任選可操作地連接於適合啟動 子。關於適當載體、啟動子、其它控制元件以及將載體引入細胞中的手段的其它信息可例如 見於 Ausubel 等，2〇〇3 (上文）和 / 或 Sambrook 和 Russell, 2〇01 (上文）中。
[0081] 可通過多種手段將靶向性核酸內切酶或編碼靶向性核酸內切酶的核酸和上述任 選的聚核苷酸引入細胞中。適合遞送手段包括顯微注射、電穿孔、聲致穿孔、基因槍法、磷酸 鈣介導的轉染、陽離子轉染、脂質體轉染、樹狀體轉染、熱休克轉染、核轉染、磁轉染、脂質體 轉染、刺穿轉染（impalefection)、光轉染、專有試劑增強的核酸攝取，以及通過脂質體、免 疫脂質體、病毒體或人工病毒粒子來遞送。在某些實施方案中，通過核轉染或電穿孔將靶向 性核酸內切酶分子和任選的聚核苷酸引入細胞中。
[0082] 在將一種以上祀向性核酸內切酶分子和一種以上聚核苷酸引入細胞中的實施方 案中，所述分子可同時或依序引入。舉例來說，可同時引入各自對靶向的裂解位點（和任選 的聚核苷酸）具有特異性的靶向性核酸內切酶分子。或者，可依序引入各靶向性核酸內切 酶分子以及任選的聚核苷酸。
[0083] 靶向性核酸內切酶（或編碼核酸）分子與任選的聚核苷酸的比率可變化且將變 化。一般來說，靶向性核酸內切酶分子與聚核苷酸的比率可在約1:10至約10:1的範圍 內。在各種實施方案中，靶向性核酸內切酶分子與聚核苷酸的比率是約1:10、1: 9、1: 8、1: 7、 1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1 或 10:1。在一個實施方案 中，比率是約1:1。
[0084] (iv)示例件實施方案
[0085] 在一些實施方案中，通過工程改造鋅指核酸酶（ZFN)以裂解Mgatl基因中的特定 序列來製備缺乏Mgatl的細胞系。在將ZFN或編碼ZFN的核酸引入親本細胞系中後，ZFN結 合且裂解Mgatl基因中的特定序列。易出錯的NHEJ過程修復Mgatl基因中的雙鏈斷裂，由 此引入至少一個bp的缺失、插入和/或取代以使Mgatl基因失活。一般來說，缺失Mgatl 編碼序列的某一區域以使閱讀框破壞且缺乏Mgatl的細胞系不產生Mgatl蛋白。在一些實 施方案中，通過在RCA-Ι存在下進行選擇來進一步富集通過ZFN介導的基因組編輯產生的 Mgatl缺乏的細胞系。在一些實施方案中，通過使CHO細胞系與靶向Mgatl的ZFN接觸來制 備Mgatl缺乏的細胞系。在一些情況下，CHO細胞系是GS-/-。
[0086] (b) RNA 幹擾
[0087] 在另一實施方案中，可使用抑制靶mRNA或轉錄物的表達的RNA幹擾（RNAi)劑制 備Mgatl缺乏的細胞系。RNAi劑可導致靶mRNA或轉錄物裂解。或者，RNAi劑可防止或破 壞革巴mRNA翻譯成蛋白質。
[0088] 在一些實施方案中，RNAi劑可為短幹擾RNA (siRNA)。一般來說，siRNA包括長度在 約15至約29個核苷酸的範圍內的雙鏈RNA分子。siRNA的長度可為約16-18、17-19、21-23、 24-27或27-29個核苷酸。在特定實施方案中，siRNA的長度是約21個核苷酸。siRNA可 任選進一步包含一個或兩個單鏈突出部分，例如在一端或兩端上的3'突出部分。siRNA可 由雜交在一起的兩個RNA分子形成，或者，可從短髮夾RNA(shRNA)(參見下文）產生。在一 些實施方案中，siRNA的兩鏈完全互補，以使在兩個序列之間形成的雙鏈體中不存在錯配或 凸出部分。在其它實施方案中，siRNA的兩鏈大致上互補，以使在兩個序列之間形成的雙鏈 體中可存在一個或多個錯配和/或凸出部分。在某些實施方案中，siRNA的一個或兩個5' 末端具有磷酸基團，而在其它實施方案中，一個或兩個5'末端缺乏磷酸基團。在其它實施 方案中，siRNA的一個或兩個3'末端具有輕基，而在其它實施方案中，一個或兩個5'末端 缺乏羥基。
[0089] 稱為"反義鏈"或"引導鏈"的一個siRNA鏈包括與靶轉錄物雜交的部分。在某 些實施方案中，siRNA的反義鏈與靶轉錄物的某一區域完全互補，即它與靶轉錄物雜交而 歷經長度在約15與約29個核苷酸之間，長度優選是至少16個核苷酸，且長度更優選是 約18-20個核苷酸的靶區域無單一錯配或凸出部分。在其它實施方案中，反義鏈大致上互 補於靶區域，即由反義鏈和靶轉錄物形成的雙鏈體中可存在一個或多個錯配和/或凸出部 分。通常，使siRNA靶向靶轉錄物的外顯子序列。本領域技術人員熟識設計針對靶轉錄物 的siRNA的程序、算法和/或商業服務。示例性實例是Rosetta siRNA設計算法（Rosetta Inpharmatics，North Seattle, WA)和 MISSION? siRNA (Sigma-Aldrich，St. Louis, M0)。 可使用為本領域技術人員所熟知的方法體外酶促合成siRNA。或者，可使用本領域中熟知的 寡核苷酸合成技術化學合成siRNA。
[0090] 在其它實施方案中，RNAi劑可為短髮夾RNA (shRNA)。一般來說，shRNA是包含至 少兩個互補部分的RNA分子，所述部分雜交或能夠雜交以形成足夠長以介導RNA幹擾（如 上所述）的雙鏈結構，以及至少一個形成連接shRNA的形成雙鏈體的區域的環的單鏈部分。 所述結構也稱為莖-環結構，其中莖是雙鏈體部分。在一些實施方案中，所述結構的雙鏈體 部分完全互補，以使在shRNA的雙鏈體區域中不存在錯配或凸出部分。在其它實施方案中， 所述結構的雙鏈體部分大致上互補，以使在shRNA的雙鏈體部分中存在一個或多個錯配和 /或凸出部分。所述結構的環的長度可為約1至約20個核苷酸，長度優選是約4至約10個 核苷酸，且長度更優選是約6至約9個核苷酸。環可位於互補於靶轉錄物的區域（即shRNA 的反義部分）的5'或3'末端。
[0091] shRNA可進一步在5'或3'末端上包含突出部分。任選的突出部分的長度可為約 1至約20個核苷酸，且長度更優選是約2至約15個核苷酸。在一些實施方案中，突出部分 包含一個或多個U殘基，例如約1個與約5個之間的U殘基。在一些實施方案中，shRNA的 5'末端具有磷酸基團，而在其它實施方案中，它不具有磷酸基團。在其它實施方案中，shRNA 的3'末端具有羥基，而在其它實施方案中，它不具有羥基。一般來說，shRNA由保守細胞 RNAi機構處理成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前體，且類似地能夠抑制互補於shRNA的 一部分（即shRNA的反義部分）的靶轉錄物的表達。本領域技術人員熟識用於設計和合成 shRNA的可用資源（如上所詳述）。一示例性實例是MISSION^ shRNA(Sigma-Aldrich)。
[0092] 在其它實施方案中，RNAi劑可為RNAi表達載體。通常，RNAi表達載體用於細胞內 (體內）合成RNAi劑，如siRNA或shRNA。在一個實施方案中，使用含有兩個啟動子的單一 載體轉錄兩個單獨互補siRNA鏈，所述兩個啟動子各自引導單一 siRNA鏈轉錄（即各啟動 子可操作地連接於siRNA的模板以使可發生轉錄）。兩個啟動子可呈相同定向，在所述情況 下，各啟動子可操作地連接於一個互補siRNA鏈的模板。或者，兩個啟動子可呈相對定向， 側接單一模板以使啟動子的轉錄導致合成兩個互補siRNA鏈。在另一實施方案中，RNAi表 達載體可含有驅動包含兩個互補區域的單一 RNA分子的轉錄，以使轉錄物形成shRNA的啟 動子。
[0093] 本領域技術人員將了解，siRNA和shRNA劑優選通過轉錄一個以上轉錄單元而在 體內產生。一般說來，用於引導一個或多個siRNA或shRNA轉錄單元在體內表達的啟動子 可為RNA聚合酶III(Pol III)的啟動子。如U6或H1啟動子的某些Pol III啟動子不需 要轉錄的區域內的順式作用調控元件，且因此，在某些實施方案中是優選的。在其它實施方 案中，Pol II的啟動子可用於驅動一個或多個siRNA或shRNA轉錄單元的表達。在一些實 施方案中，可使用組織特異性、細胞特異性或誘導性Pol II啟動子。
[0094] 可使用標準重組DNA方法產生提供用於合成siRNA或shRNA的模板的構建體且插 入適於在真核細胞中表達的廣泛多種不同載體的任一種中。重組DNA技術描述於Ausubel 等，2003(上文）以及Sambrook和Russell, 2001(上文）中。本領域技術人員也了解，載 體可包含其它調控序列（例如終止序列、翻譯控制序列等）以及可選擇標記物序列。DNA 質粒在本領域中是已知的，包括基於PBR322、PUC等的那些DNA質粒。因為許多表達載體 已含有一個或多個啟動子，所以可能僅必須在關於啟動子適當的位置處插入編碼目標RNAi 劑的核酸序列。病毒載體也可用於提供細胞內RNAi劑表達。適合病毒載體包括反轉錄 病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體等。在特定實施方案 中，RNAi表達載體是shRNA慢病毒基載體或慢病毒粒子，如MISSION Kl TRC shRNA產品 (Sigma-Aldrich)中提供的載體或粒子。
[0095] 可使用為本領域技術人員所熟知的方法將RNAi劑或RNAi表達載體引入細胞中。 所述技術描述於例如Ausubel等，2003(上文）或Sambrook和Russell, 2001(上文）中。 在某些實施方案中，例如病毒載體的RNAi表達載體被穩定整合入細胞的基因組中，以使歷 經隨後代細胞，Mgatl表達被破壞。
[0096] (c)位點特異性重組
[0097] 在替代實施方案中，可使用位點特異性重組技術製備Mgatl缺乏的細胞系。舉例 來說，位點特異性重組技術可用於缺失全部或一部分目標染色體序列，或將單核苷酸多態 性（SNP)引入目標染色體序列中。在一個實施方案中，使用Cre-loxP位點特異性重組系統、 Flp-FRT位點特異性重組系統或其變體靶向目標染色體序列。所述重組系統可商購獲得，且 對於這些技術的其它教義見於例如Ausubel等，2003 (上文）中。
[0098] (III)用於產生具有簡單糖型的重組蛋白的方法
[0099] 也提供使用Mgatl缺乏的細胞來產生具有簡單糖型的重組蛋白的方法。簡單糖型 是指包含一個或多個末端甘露糖殘基的糖型。一般來說，簡單糖型缺乏半乳糖和/或唾液 酸殘基。示例性簡單糖型是Man5GlcNac2或Man5。如上所提及，具有簡單糖型的糖蛋白適 用於X射線結晶學研究。具有簡單糖型的糖蛋白具有其它應用。舉例來說，Mgatl缺乏的 細胞可用於產生疫苗。Mgatl缺乏的細胞產生含有末端甘露糖殘基的糖蛋白。抗原上的末 端甘露糖殘基允許由抗原遞呈細胞上的甘露糖受體達成對它的攝取。抗原遞呈細胞（即巨 噬細胞或樹突細胞）接著遞呈抗原以達成由T細胞識別，由此發動免疫反應。使用包含末 端甘露糖殘基的抗原可增強向T細胞遞呈抗原的效率。另外，僅具有末端甘露糖殘基的糖 蛋白可通過促進甘露糖受體介導的對這些蛋白質的攝取而適用於其它治療目的。
[0100] 可製備具有簡單糖型的糖蛋白。本公開的另一方面涵蓋一種用於產生具有簡單糖 型的重組蛋白的方法。所述方法包括將編碼重組蛋白的核酸引入缺乏Mgatl的細胞系中以 及表達所述重組蛋白，其中所述表達的重組蛋白包含一個或多個末端甘露糖殘基。以上在 章節（I)中描述Mgatl缺乏的細胞系。
[0101] 在Mgatl缺乏的細胞系中產生的重組糖蛋白可為任何適合糖蛋白，包括治療性蛋 白質和蛋白質生物劑。舉例來說，重組蛋白可不加限制地為抗體、抗體片段、單克隆抗體、人 源化抗體、人源化單克隆抗體、嵌合抗體、IgG分子、IgG重鏈、IgG輕鏈、IgA分子、IgD分子、 IgE分子、IgM分子、疫苗、生長因子、細胞因子、幹擾素、白介素、激素、凝結（或凝血）因子、 血液組分、酶、營養蛋白質、上文任一種的功能性片段或功能性變體、或包含上文蛋白質和/ 或其功能性片段或變體的任一種的融合蛋白。在示例性實施方案中，重組糖蛋白是人蛋白 質。
[0102] 用於產生重組蛋白的方法在本領域中是熟知的，且其它教義由Ausubel 等，2003(上文）提供。一般來說，重組蛋白是自外源引入的核酸表達。如以上在章節（I) (e)中所詳述，編碼重組蛋白的核酸可為染色體外的或編碼重組蛋白的核酸可整合入基因 組中。
[0103] 用於培養細胞系以使重組蛋白得以表達的方法在本領域中是熟知的。適當培養基 和培養系統在本領域中是已知的且可商購獲得。在一個實施方案中，重組蛋白是由本文公 開的細胞系通過無血清混懸培養產生。
[0104]
[0105] 除非另外定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語都具有由本發明所屬領域 的技術人員通常理解的含義。以下參考書目提供技術人員以本發明中使用的許多術語的一 般性定義：Singleton 等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第 2 版 1994) ;The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 編，1988) ;The Glossary of Genetics,第 5 版，R. Rieger 等（編），Springer Verlag (1991);以及 Hale 和Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另外指定，否則如本 文所用，以下術語具有歸於它們的含義。
[0106] 在介紹本公開或其優選實施方案的要素時，冠詞"一個（種）"和"所述"意指存在 一個或多個要素。術語"包含"、"包括"和"具有"意圖是包括性的且意味可能存在除所列 要素以外的其它要素。
[0107] 如本文所用，術語"內源性序列"是指為細胞所天然具有的染色體序列。
[0108] 術語"外源性序列"是指不為細胞所天然具有的染色體序列，或天然染色體位置在 染色體中處於不同位置的染色體序列。
[0109] 術語"編輯"、"基因組編輯"或"染色體編輯"是指特定染色體序列通過其被改變 的過程。編輯的染色體序列可包含插入至少一個核苷酸、缺失至少一個核苷酸和/或取代 至少一個核苷酸。
[0110] 如本文所用的"基因"是指編碼基因產物的DNA區域（包括外顯子和內含子）以 及調控基因產物的產生的所有DNA區域，無論所述調控序列是否鄰近於編碼序列和/或轉 錄的序列。因此，基因包括但未必限於啟動子序列、終止子、翻譯調控序列（如核糖體結合 位點和內部核糖體進入位點）、增強子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著位點 和基因座控制區域。
[0111] 術語"異源"是指實體不為目標細胞或物種所天然具有。
[0112] 術語"核酸"和"聚核苷酸"是指呈線性或環狀構形，且呈單鏈或雙鏈形式的脫氧 核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出於本公開的目的，這些術語不應被解釋為限制聚合物 的長度。術語可涵蓋天然核苷酸的已知類似物，以及在鹼基、糖和/或磷酸部分（如硫代磷 酸酯骨架）中被修飾的核苷酸。一般來說，特定核苷酸的類似物具有相同鹼基配對特異性； 即A的類似物將與T配對。
[0113] 術語"核苷酸"是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可為標準核苷酸（即腺 苷、鳥苷、胞苷、胸苷和尿苷）或核苷酸類似物。核苷酸類似物是指具有修飾的嘌呤或嘧啶 鹼基或修飾的核糖部分的核苷酸。核苷酸類似物可為天然存在的核苷酸（例如肌苷）或非 天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或鹼基部分上的修飾的非限制性實例包括添加（或移除） 乙醯基、氨基、羧基、羧甲基、羥基、甲基、磷醯基和硫醇基團，以及用其它原子取代鹼基的碳 和氮原子（例如7-脫氮嘌呤）。核苷酸類似物也包括雙脫氧核苷酸、2'-0_甲基核苷酸、鎖 定核酸（LNA)、肽核酸（PNA)和嗎啉代寡核苷酸。
[0114] 術語"多肽"與"蛋白質"可互換用於指代胺基酸殘基的聚合物。
[0115] 術語"重組"是指在兩個聚核苷酸之間交換遺傳信息的過程。出於本公開的目的， "同源重組"是指例如在修復細胞中的雙鏈斷裂期間發生的所述交換的特殊化形式。這個 過程需要兩個聚核苷酸之間具有序列類似性，使用"供體"或"交換"分子為"靶"分子（即 經受雙鏈斷裂的分子）的修復提供模板，且不同地稱為"非交叉基因轉換"或"短道基因轉 換"，因為它會導致遺傳信息自供體轉移至靶標。在不受任何特定理論束縛下，所述轉移可 涉及在斷裂的靶標與供體之間形成的異源雙鏈DNA的錯配校正，和/或"合成依賴性鏈退 火"，其中供體用於再合成將成為靶標的一部分的遺傳信息；和/或相關過程。所述特殊化 同源重組常導致靶分子的序列改變，以使供體聚核苷酸的部分或全部序列併入靶聚核苷酸 中。
[0116] 如本文所用，術語"靶位點"或"靶序列"是指限定染色體序列的待編輯的部分，且 靶向性核酸內切酶被工程改造來對其進行識別、結合以及裂解的核酸序列。
[0117] 術語"上遊"和"下遊"是指核酸序列中相對於固定位置的位置。上遊是指在所述 位置的5'（即靠近鏈的5'末端）的區域，且下遊是指在所述位置的3'（即靠近鏈的3'末 端）的區域。
[0118] 用於測定核酸和胺基酸序列同一性的技術在本領域中是已知的。通常，所述技 術包括測定基因的mRNA的核苷酸序列和/或測定由其編碼的胺基酸序列，以及將這些序 列與第二核苷酸或胺基酸序列進行比較。也可以這個方式測定和比較基因組序列。一般 來說，同一性是指兩個聚核苷酸或多肽序列的分別核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸的 精確對應。兩個或更多個序列（聚核苷酸或胺基酸）可通過確定它們的同一性百分比 來進行比較。兩個序列（無論核酸或胺基酸序列）的同一性百分比是兩個比對序列之 間的精確匹配的數目除以較短序列的長度且乘以100。核酸序列的近似比對由Smith和 Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482_489 (1981)的局部同源性算法提供。 通過使用由 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O.Dayhoff 編，5 增刊.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C·，USA 開 發，且由 Gribskov，Nucl. Acids Res. 14(6) :6745-6763(1986)加以標準化的計分矩陣，這個 算法可應用於胺基酸序列。用以確定序列同一性百分比的這個算法的示例性執行程序由 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)在 "BestFit" 實用程序中提供。用於計算序列 之間的同一性或類似性百分比的其它適合程序通常在本領域中是已知的，例如另一比對程 序是以預設參數加以使用的BLAST。舉例來說，BLASTN和BLASTP可使用以下預設參數來加 以使用：遺傳密碼=標準；過濾器=無；鏈=兩者；截斷=60 ;預期=10 ;矩陣=BL0SUM62 ; 描述=50個序列；排序依據=高分；資料庫=非冗餘GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank ⑶S翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序的細節可見於GenBank網站上。關於本 文所述的序列，序列同一性的所需程度範圍是約80%至100%以及介於其之間的任何整數 值。通常，序列之間的同一性百分比是至少70-75%、優選80-82%、更優選85-90%、甚至更 優選92 %、仍更優選95 %且最優選98 %序列同一性。
[0119] 因為可在不脫離本發明的範圍下對上述細胞和方法做出各種改變，所以在以上描 述中和在以下給出的實施例中含有的所有事項都應解釋為說明性的而非具有限制性意義。 實施例
[0120] 以下實施例說明本發明的某些方面。
[0121] 實施例1 :使用ZFN破壞CH0細胞中的Mgatl
[0122] A.製備ZFN表達載體和靶向Mgatl的ZFN mRNA
[0123] ZFN介導的敲除技術用於敲除CH0細胞中的Mgatl基因或使所述基因失 活，由此產生會產生具有含有末端Man5部分的均質簡單N-聚糖譜的蛋白質的細 胞。使用小鼠同源性註解含有Mgatl基因座的Mgatl基因組重疊群（Xu等，2011，Nat Biotechnol，29:735-741)。使用專有算法設計靶向CH0 Mgatl編碼區域內的特定位點的 ZFN。圖2A圖解Mgatl中的靶位點的位置。Mgatl中的靶序列是5'-AACAAGTTCAAGTTCccag caGCTGTGGTAGTGGAGGAC-3'（SE Q ID N0:1 ;其中ZFN結合位點用大寫表示且裂解位點用小 寫表示。）使用標準程序製備MgatlZFN表達構建體且使用體外轉錄、mRNA聚腺苷酸化和 加帽方法，如COMPOZR"敲除鋅指核酸酶（ZFN) (Sigma-Aldrich)產品信息中所述，自 ZFN質粒DNA產生Mgatl ZFN mRNA。簡而言之，使質粒ZFN DNA線性化且使用苯酚/氯仿 DNA提取法加以純化。MessageMax?T7ARCA加帽信息轉錄試劑盒（Cell Script Inc.)用 於對線性化DNA加帽。聚（A)聚合酶加尾試劑盒（Epicentre)用於添加聚（A)尾巴。使用 MEGAclear? 試劑盒（Ambion)純化 ZFN mRNA。
[0124] B.在IgG產生性CH0細胞系中轉染靶向Mgatl的ZFN
[0125] 表達重組抗狂犬病人IgG的CH〇ZNK (GS-/_)細胞（Sigma Aldrich)以混 懸培養物形式維持在補充有25 μ Μ氨基亞碸蛋氨酸的EX-CELLU CH0⑶融合培養基 (Sigma-Aldrich)中。在轉染之前1天將細胞在0. 5X106個細胞/毫升下接種在生物反應 器管中。於150yL生長培養基中的1X106個細胞和5yg MgatlZFN DNA或mRNA用於各轉 染。通過在140V和950 μ F下於0.2cm比色皿中進行電穿孔來進行轉染。將電穿孔的細胞 置放在2mL生長培養基中，進行6孔板靜態培養。在轉染後第3天和第10天，自培養物移 除細胞且使用GeneElute?哺乳動物基因組DNA小型製備試劑盒（Sigma-Aldrich)分離基 因組DNA。進行如COMPOZRK敲除ZFN產品信息中所述的Cel-I核酸酶測定以測定ZFN 介導的基因裂解的效率。
[0126] 圖2B描繪顯示在ZFN轉染的（ZFN質粒DNA或mRNA轉染）細胞池中進行的Cel-I 測定的結果的凝膠。兩個裂解片段220bp和197bp存在於轉染後第3天和第10天的基因組 DNA消化物中，從而指示在兩個時間點均具有陽性ZFN活性。在第3天和第10天的ZFN活 性分別是8. 8%和9. 6%。在兩個時間點，用RNA轉染的細胞均具有稍微更強烈的條帶。隨 時間的穩定ZFN活性暗示沒有與Mgatl破壞相關的明顯細胞毒性或生長抑制。換句話說， 在ZFN轉染的群體中，未觀察到野生型細胞超過ZFN修飾的細胞的生長優勢。
[0127] 實施例2 :凝集素選擇和分離單細胞克隆
[0128] MgatlZFN轉染的細胞用蓖麻凝集素-I (RCA-Ι)(-種結合半乳糖而非甘露糖的細 胞毒性凝集素）處理過夜以富集Mgatl被破壞的細胞。在轉染後第14天，接種等分的細胞 以使用活細胞FACS進行單細胞克隆。使用FACSAria?III細胞分選儀（Becton-Dickinson) 在每孔一個細胞下將細胞於補充有10%胎牛血清（FBS)和4mM L-穀氨醯胺的漢姆氏 (Ham' s)-F12營養混合物中接種在96孔組織培養處理板（Corning)中。擴增剩餘細胞直 至第18天且接著在1 X 106個細胞/毫升下接種在T混懸培養燒瓶（Coring)中。使細胞與 含10 μ g/mL最終濃度的RCA-Ι的生長培養基一起孵育過夜，接著用PBS洗滌並返回至生長 培養基中。將細胞擴增至T燒瓶中並培養10天，且接著接種以如上所述進行單細胞克隆。 在RCA-Ι處理後10天，測定細胞的ZFN活性。
[0129] 圖3描繪顯示在RCA-1富集之前和之後，在ZFN轉染的細胞池中進行的Cel-I測 定的結果的凝膠。用RCA-Ι選擇的細胞顯示相較於未選擇細胞的3. 8-5. 5%，ZFN活性是約 33-36%，從而指示Mgatl破壞的細胞被成功富集。
[0130] 實施例3 :分泌的重組抗狂犬病人IgG的糖譜
[0131] 相對高通量 SEC-MS (Waters Acquity UP.LC?/Q_Tof Premier?)工藝流程用於糖 分析。工藝流程利用蛋白質A自細胞培養上清液純化IgG，隨後對完整IgG重鏈組分進行準 確質量分析。使用每孔具有50 μ 1蛋白質A樹脂和750 μ 1克隆上清液的96孔過濾板來進 行蛋白質Α純化。用100μ 125mM朽1檬酸鹽（ρΗ3. 0)洗脫IgG。通過使用BiopharmaLynx? 軟體（Waters)以自動方式進行解卷積和數據處理來進行質量數據分析。通過胰蛋白酶消 化所選樣本且通過MALDI-T0F在糖肽層面上驗證聚糖鑑定和相對分布（報導為總聚糖的 a% )來確認糖肽形式。
[0132] 評估各細胞池（ZFN轉染和模擬轉染，進行或不進行RCA-Ι選擇）的分泌的重組抗 狂犬病人IgG的糖譜。RCA-Ι富集的池顯示相對於未暴露於RCA-Ι的細胞，Man5糖型的水 平增加（圖4)。相較於MgatlZFN轉染的細胞的13. 7%以及通過RCA-Ι選擇富集的ZFN轉 染的細胞的92. 8%，模擬轉染的細胞顯示0. 3% Man5。在模擬轉染的細胞和未經受RCA-I 富集的ZFN轉染的細胞中，G0F和G1F糖型最豐富。
[0133] 實施例4 :Mgatl修飾的單細胞克隆的基因型表徵
[0134] 自單細胞克隆（IgG產生性細胞系或宿主GS(_/_)細胞系）的培養物 分離基因組DNA。通過PCR擴增Mgatl基因的一部分且使用Τ0Ρ0系統（Life Technologies, Carlsbad, CA)克隆PCR產物。製備樣本用於DNA測序。對最少10個Τ0Ρ0 克隆進行測序以進行基因型表徵。
[0135] 為比較在存在或不存在RCA-Ι富集下Mgatl修飾的克隆的頻率，如上所述通過 FACS對與或不與RCA-Ι -起培養的ZFN轉染的細胞進行單細胞克隆。對於非富集的池，76 個克隆中的2個克隆（2. 63%)具有Mgatl基因的短缺失（參見圖5和表1 ;73號和92號 克隆）。對來自使用QuickExtract? DNA提取解決方案（Epicentre)獲得的細胞溶解產物 的巢式PCR產物的初始測序指示來自RCA-Ι富集的群體的所有克隆（52/52)都含有破壞的 Mgatl基因序列。對這些克隆的測序揭示Mgatl的缺失是2bp缺失至55bp缺失（參見圖5 和表1，21號、25號、27號和37號克隆）。各克隆都含有一個破壞的等位基因，其中未檢測 到野生型序列。因此，這些細胞的基因型是MGAT-l(-/0)和GS(-/-)。
[0136]
【權利要求】
1. 一種細胞系，所述細胞系缺乏甘露糖基（α-l，3-)-糖蛋白β-1，2-Ν-乙醯氨基葡萄 糖轉移酶I (Mgatl)。
2. 如權利要求1所述的細胞系，其中所述細胞系包含編碼Mgatl的失活染色體序列。
3. 如權利要求2所述的細胞系，其中所述染色體序列是用靶向性核酸內切酶失活的。
4. 如權利要求3所述的細胞系，其中所述靶向性核酸內切酶是鋅指核酸酶。
5. 如權利要求2至4中任一項所述的細胞系，其中所述失活染色體序列包含2bp至 55bp的缺失。
6. 如前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述細胞系不產生Mgatl。
7. 如前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述細胞系進一步包含穀氨醯胺合成 酶（GS)、二氫葉酸還原酶（DHFR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT)或其組合的缺 乏。
8. 如前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述細胞系是中國倉鼠卵巢（CHO)細 胞系。
9. 如權利要求8所述的細胞系，其中所述CHO細胞系是GS-/-細胞系。
10. 如前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述細胞系表達包含一個或多個末 端甘露糖殘基的至少一種糖蛋白。
11. 如前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述細胞系具有與不缺乏Mgatl的 細胞系的生長速率類似的生長速率。
12. 如前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述細胞系產生與不缺乏Mgatl的 細胞系的蛋白質水平類似的蛋白質水平。
13. -種用於產生缺乏Mgatl的細胞的方法，所述方法包括用靶向編碼Mgatl的染色體 序列中的特定序列的靶向性核酸內切酶轉染宿主細胞。
14. 如權利要求13所述的方法，其中所述靶向性核酸內切酶是鋅指核酸酶。
15. 如權利要求13或14所述的方法，所述方法進一步包括與蓖麻凝集素 -I (RCA-Ι) - 起孵育所述轉染的細胞。
16. 如權利要求13至15中任一項所述的方法，所述方法進一步包括： a) 將編碼重組蛋白的核酸引入所述細胞中；以及 b) 表達所述重組蛋白。
17. -種用於產生具有一個或多個末端甘露糖殘基的重組蛋白的方法，所述方法包 括： a) 將編碼所述重組蛋白的核酸引入細胞系中，在所述細胞系中，靶向性核酸內切酶使 編碼Mgatl的全部染色體序列失活以使所述細胞系不產生Mgatl ;以及 b) 表達所述重組蛋白。
【文檔編號】C12N15/00GK104245932SQ201380005345
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年1月10日 優先權日:2012年1月11日
【發明者】林楠, 納塔利·西洛弗, 亨利·喬治, 凱文·凱澤 申請人:西格馬-奧爾德裡奇有限責任公司