一種多用途聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體及其製備方法與應用的製作方法

2023-05-15 05:36:21 1

一種多用途聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】一種多用途聚賴氨酸螢光自組裝載藥納米微球及其製備方法與應用。本發明採用納米自組裝技術製備了羅丹明標記的聚賴氨酸螢光納米微球，並修飾了帶有二硫鍵的疊氮基團側鏈，進一步採用點擊化學方法將炔基修飾的藥物連接在螢光納米微球上。本發明所製備的連結藥物的聚賴氨酸納米自組裝微球可用於被修飾藥物在動物以及細胞水平的示蹤成像分析。同時利用該微球還可以用於捕獲被修飾藥物的結合蛋白，並通過裂解二硫鍵可釋放出靶點結合蛋白及其關聯蛋白，可用於藥物作用靶點的研究。本發明提供了一種研究藥物作用靶點的簡便快捷的工具和方法，該方法集合藥物示蹤、靶點定位、靶點蛋白捕獲及分離功能於一體，簡便易行，在藥物作用機制研究以及靶點發現方面有很好的應用前景。
【專利說明】一種多用途聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體及其製備方 法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥【技術領域】，涉及一種連接有螢光示蹤基團的聚賴氨酸納米自 組裝微球載體的製備工藝，並進一步採用點擊化學技術共價偶聯被修飾藥物的方法。以及 利用本發明所製備的載藥微球，對被修飾藥物進行的整體動物和細胞水平的示蹤成像分 析，藥物靶點定位，靶點蛋白捕獲分離方面的應用。

【背景技術】
[0002] ε -聚賴氨酸（P〇ly-L-lySine，PL)是由25?30個賴氨酸殘基通過醯胺鍵依次連 接而成的同型單體直鏈狀聚合物。聚賴氨酸為白色或淡黃色粉末，吸溼性強，略有苦味，不 受pH值影響。ε -聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，其具有抑菌譜廣、水溶性大、熱穩 定性好、可生物降解且對人和環境無毒害等優點，已經成為優良的食品防腐保鮮劑。ε -聚 賴氨酸能在人體內分解為賴氨酸，而賴氨酸是人體必需的胺基酸，也是世界各國允許在食 品中強化的胺基酸。因此ε-聚賴氨酸是一種營養型抑菌劑，安全性高於其他化學防腐劑， 其急性口服毒性為5 g/kg。ε_聚賴氨酸的抑菌譜廣，對於酵母屬中的尖銳假絲酵母、法紅 酵母、產膜畢氏酵母、玫瑰擲孢酵母；革蘭氏陽性菌中的耐熱脂肪芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、 枯草芽孢桿菌；以及革蘭氏陰性菌中的產氣節桿菌、大腸桿菌等引起食物中毒與腐敗的菌 有強烈的抑制作用。分子量在3600?4300之間的ε-聚賴氨酸其抑菌活性最好，當分子 量低於1300時，ε-聚賴氨酸則失去抑菌活性。
[0003] 此外，由於ε -聚賴氨酸帶正電，能與帶負電的物質發生強烈的靜電吸引力，易 通過生物膜且不易分解，可以有效降低藥物阻力提高藥物的轉運效率。聚賴氨酸還具有 能促進細胞生長和粘附以及促進細胞發揮正常功能等作用，因此作為藥物的緩釋和靶向 載體ε-聚賴氨酸已被廣泛用於生物醫藥領域。作為生物高分子材料骨架，中國專利（申 請號：2014100723354)公開了一種可溶解凝血酶納米顆粒的製備方法，該納米顆粒以凝血 酶為核心，外殼是由水溶性直鏈澱粉與聚賴氨酸交聯形成的納米粒子；中國專利（申請號： 2013107289643, 2013106763740)分別公開了 ε -聚賴氨酸水凝膠的製備方法，以及由該發 明衍生的傷口組織癒合材料；中國專利（申請號：2012101329801)提供了一種兩親性三嵌 段共聚物的納米載體製劑，該共聚物由包含聚乙二醇衍生物、聚賴氨酸和聚亮氨酸的線性 高分子化合物組成，在水溶液中可以自組裝形成具有三層結構的納米載體，並能有效負載 小分子疏水性藥物、基因以及蛋白質或多肽。
[0004] 作為藥物載體，中國專利（申請號：2013106705336)提供了一種作為疏水性藥物的 載體的雙敏感響應型聚合物納米膠束，其成分為正丁胺-聚賴氨酸（葉酸/2, 3-二甲基馬 來酸）-b_聚半胱氨酸；中國專利（申請號：2004100680618)公開了一種短肽修飾的聚賴氨 酸與聚乳酸共聚物納米粒，該納米粒包括藥物和由精氨醯一甘氨醯一天冬氨醯序列短肽、 修飾的聚賴氨酸一聚乳酸共聚物納米粒載體組成，可用於有機藥物、水溶性藥物或水不溶 性抗癌藥物；中國專利（申請號：2004100466794)提供了一種應用"成膠現象"合成半乳糖 化海藻酸鈉與多聚賴氨酸納米膠的製備方法，所得到的肝靶向性納米基因載體系統能為原 發性肝癌的靶向基因治療提供材料；此外，中國專利（申請號：2013101802363)還公開了一 種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體，其中雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵 及pH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性苄氧羰基保護的聚賴氨酸而成。該載 體製劑具有疏水雙分子膜及親水內腔，疏水雙分子膜負載疏水藥物，親水內腔負載親水藥 物，可有效利用腫瘤細胞中的還原環境及酸性環境使得載體製劑崩解釋放藥物實現靶向釋 藥。
[0005] 作為螢光成像納米材料的骨架，中國專利（申請號：2012102228846)公開了一種 功能性近紅外螢光納米微粒的製備方法。該納米微粒平均粒徑在15nm左右，以所裝載的 近紅外螢光染料作為發光中心，以殼聚糖、聚賴氨酸為基本骨架，經海藻酸鈉自組裝包裹 成殼製備而成；中國專利（申請號：201310470907X)還提供了一種信號放大型免疫螢光探 針的製備方法。該探針的製備方法包括：在縮合劑的存在下，對苯二胺和均苯三甲酸經 縮合反應得到多羧基大分子，多羧基大分子經活化後，依次加入抗體、聚賴氨酸進行反應， 再用螢光標記物標記製得所述的探針。該探針標記有較多螢光標記物，結構穩定，可用於 螢光免疫檢測，具有檢測靈敏度高、檢測時間短、成本低等特點。此外，中國專利（申請號： 2013101802363)還公開了一種兩親性三嵌段聚多肽ICG膠束，該膠束包括了分散有吲哚菁 綠並由聚亮氨酸形成的內核，以及環繞內核由聚賴氨酸形成的中間層及部分穿插於所述中 間層的由聚乙二醇形成的外殼。該膠束具備良好的空間穩定性以及出色的螢光性能、光熱 轉換能力，可以實現對腫瘤細胞或組織進行光學成像和光熱治療。
[0006] 綜上所述，目前國內外均以聚賴氨酸或共混其他高分子材料為骨架進行相關材料 的開發。但尚未見以聚賴氨酸自身為骨架，一方面通過醯胺鍵共價連接螢光分子(羅丹明)， 並通過自組裝技術製備納米顆粒，另一方面採用點擊化學技術共價結合可釋放藥物分子； 同時可進行被修飾藥物的體內外示蹤成像分析，靶點定位以及靶點蛋白捕獲分離，集合上 述功能用途為一體的聚賴氨酸納米材料的報導。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的是利用納米自組裝技術，通過引入螢光基團和可被裂解釋藥的二硫 鍵基團製備聚賴氨酸載藥納米微球，並利用聚賴氨酸的生物相容性實現被修飾藥物在動物 組織和細胞內的示蹤，以及靶點蛋白及其相關蛋白的捕獲分離，提供一種多用途聚賴氨酸 螢光自組裝納米微球載體的製備方法與應用。
[0008] 本發明可解決現有技術難以實現的藥物示蹤和靶點捕獲一體化的問題。並以含有 羥基或羧基的藥物為例，通過丙炔酸酯化或丙炔胺的醯胺化修飾引入炔基，並通過和微球 上修飾的疊氮基團的點擊化學反應將藥物連接到微球載體上，運用同一納米載藥微球，分 別實現了藥物體內代謝示蹤、細胞內定位、以及靶點蛋白捕獲分離等不同應用。
[0009] 本發明提供了一種多用途聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體，該載體是在骨架材 料上共價連接有螢光標記基團和藥物分子製成；所述的骨架材料是由含有25?30個賴氨 酸殘基通過醯胺鍵依次連接而成的同型單體聚合物；所述骨架材料上的賴氨酸殘基同時修 飾了帶有二硫鍵的疊氮基團側鏈以及螢光標記物，能夠通過自組裝製備納米微球，並能用 於藥物分子的連接。
[0010] 所述的螢光標記基團是含有羅丹明的標記分子。具體是通過市售的羅丹明活化酯 (NHS-羅丹明），與聚賴氨酸的氨基以醯胺鍵的形式和納米微球載體相連接。
[0011] 所述的帶有二硫鍵的疊氮基團側鏈，具體是通過市售的疊氮化試劑 (Sulfo-SADP)，其一端是活化酯，通過聚賴氨酸的氨基以醯胺鍵的形式與納米微球載體相 連接。
[0012] 所述的藥物分子，是炔基修飾的藥物衍生物，通過丙炔酸與含有羥基的藥物進行 酯化反應引入炔基，或通過丙炔胺與含有羧酸的藥物進行醯胺化反應引入炔基，並進一步 通過點擊化學的方法將其炔基修飾的藥物衍生物與含有疊氮側鏈納米微球載體相連接。
[0013] 具體製備方法如下： 第1、向含有1%至5% Span-80的由汽油和四氯化碳組成的混合有機相(汽油和四氯化 碳的體積比可為1:3至3:1)中加入NHS-羅丹明溶解，並再加入溶解有0. 2%-2%的聚賴氨 酸的水相溶液。其中有機相和水相的比例為1:1至5:1，NHS-羅丹明的用量為聚賴氨酸的 0. 5%至10%。10, 000至20, 000轉高速攪拌後得到乳化液。
[0014] 第2、將上述乳化液轉移至分液漏鬥中，分別加入上述體積比1:1至5:1的石油醚 以及水溶液，混合均勻後靜置分層，收集水相，離心棄去沉澱，上清液即為自組裝的聚賴氨 酸螢光納米微球； 第3、向第2步得到的納米微球溶液中加入疊氮化試劑Sulfo-SADP，室溫攪拌反應0. 5 小時至5小時，得疊氮修飾的納米微球，其中Sulfo-SADP的用量為聚賴氨酸用量的10%至 100% ； 第4、進一步將炔基修飾的藥物緩慢滴入第3步得到的納米微球溶液中，攪拌條件下加 入點擊化學反應的催化劑，室溫反應〇. 5小時至5小時，反應液經超濾濃縮，即為連接有藥 物的螢光納米微球。其中炔基修飾藥物的用量為聚賴氨酸用量的10%至100% ;所述的炔基 修飾的藥物，是採用丙炔酸與含有羥基的藥物通過酯化的方式製備的丙炔酸酯，或採用丙 炔胺與含有羧基的藥物通過醯胺化的方式製備的丙炔醯胺衍生物。
[0015] 此外，本發明還提供了上述聚賴氨酸螢光自組裝納米微球在藥物示蹤與靶點蛋白 捕獲方面的應用。其中包括被修飾藥物牛蒡子苷元的動物以及細胞水平的成像分析；以 及利用甘草次酸修飾的納米微球捕獲甘草次酸靶點蛋白的過程，包括通過納濾分級截留分 離，裂解二硫鍵釋放出靶點蛋白的具體步驟。
[0016] 本發明提供的納米微球的應用之一：在藥物示蹤方面的應用。
[0017] 本發明首先製備了載有牛蒡子苷元的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球，並通過雷射 粒度儀、透射電子顯微鏡分析了上述微球的粒徑和形狀；採用螢光光譜儀考察了其螢光特 性；並進一步通過雷射共聚焦顯微鏡以及小動物活體成像技術評價了其在體和細胞水平的 分布情況。
[0018] 本發明提供的納米微球的應用之二：靶點蛋白捕獲方面的應用。
[0019] 本發明中所述的靶點蛋白捕獲方面的應用，利用超濾分級截留分離捕獲靶點蛋 白，包括以下步驟：孵育細胞、細胞裂解、離心、超濾除雜、洗滌、還原釋放蛋白、超濾洗脫等 步驟(附圖1)。具體操作如下： 向人肺上皮BEAS-2B細胞中加入連接甘草次酸的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球，培 養48小時後，經胰酶消化，超聲破碎，離心，得到結合有靶標蛋白的聚賴氨酸納米微球懸濁 液。將上述含有納米微球的溶液加入到截留分子量為3 kD的超濾管中，離心棄去小分子， 將截留液加入到截留分子量為1〇〇 kD的超濾管中，離心棄去未結合的大分子蛋白，進一步 向截留液中加入二硫蘇糖醇（DTT)溶液還原二硫鍵，再次加入到截留分子量為100 kD的超 濾管中，離心，收集濾液得到與甘草次酸結合的靶點蛋白以及相關蛋白。
[0020] 綜上所述，本發明提供了一種研究藥物分布以及作用靶點所需要的簡便快捷的載 體工具和方法，該聚賴氨酸載藥螢光納米微球，集靶點定位，靶點蛋白捕獲與分離功能於一 體，可用於藥物作用機制的研究。
[0021] 本發明的優點和積極效果： 本發明提供了一種製備多用途聚賴氨酸螢光納米自組裝載藥微球的新方法，並創新性 的同時引入羅丹明螢光標記和可被還原裂解的二硫鍵的疊氮基團，通過點擊化學反應連接 炔基修飾藥物。所製備的納米自組裝載藥微球呈球形，粒度分散均勻，平均粒徑為38 nm，具 有良好的膠體性質，最大發射波長為600 nm，可以有效避免生物樣本自身的幹擾，被突光檢 測和示蹤。同時該納米微球生物相容性好，有利於穿過細胞膜，可以順利地指示和捕獲靶點 蛋白，並通過裂解二硫鍵可釋放出靶點蛋白及其關聯蛋白。該方法製備工藝簡便易行，所制 備的載藥納米微球集靶點示蹤定位，靶點蛋白捕獲及分離功能於一體，可用於被修飾藥物 的動物和細胞水平的成像分析，以及靶點蛋白分離鑑定，在藥物作用機制的研究方面有很 好的應用前景。
[0022]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是實施例1，2和3,疊氮修飾的聚賴氨酸螢光納米微球的合成路線圖； 圖2是實施例4,藥物分子牛蒡子苷元的炔基化修飾以及與聚賴氨酸螢光納米微球連 接路線示意圖； 圖3是實施例5,聚賴氨酸螢光納米自組裝載藥納米微球的形態學和螢光特性考察。其 中，A為納米微球溶液中分散狀況照片；B為納米微球的膠體特性示意圖；C為納米微球粒 徑分布圖；D為納米微球TEM透射電鏡的整體照片；E為納米微球TEM透射電鏡的放大照片； F為羅丹明溶液和聚賴氨酸螢光納米自組裝微球膠體溶液的螢光發射光譜圖； 圖4是實施例6,藥物分子甘草次酸的炔基化修飾以及與聚賴氨酸螢光納米微球連接 路線不意圖； 圖5是實施例7,牛蒡子苷元載藥的聚賴氨酸螢光納米微球的細胞成像圖和小鼠活體 成像示蹤圖片。A組為細胞加入實施例1所製備的聚賴氨酸螢光空白納米微球的陰性對 照，其中，A1為細胞DAPI染色圖片，A2為細胞螢光照片，A3為A1和A2的疊加照片；B組為 細胞加入實施例2所製備的牛蒡苷元修飾的聚賴氨酸螢光納米載藥微球的照片，其中，B1 為細胞DAPI染色圖片，B2為細胞螢光照片，B3為B1和B2的疊加照片；C組為實施例2所 製備的聚賴氨酸螢光納米載藥微球的小鼠活體示蹤圖片；其中，C1為給藥前0分鐘，C2為 給藥後60分鐘的活體成像圖片； 圖6是實施例8,聚賴氨酸納米載藥微球捕獲靶點蛋白的操作示意圖； 圖7是實施例8,實施例5所製備的甘草次酸載藥納米微球捕獲靶點蛋白的SDS-PAGE 電泳檢測圖。其中，第1泳道為蛋白Marker ;第2泳道為細胞裂解蛋白樣品；第3泳道為經 過3 kD超濾管超濾的濾過液；第4泳道為濾液中截留蛋白；第5泳道為DTT還原後，經過 100 kD超濾管超濾的截留液；第6泳道為DTT還原後，經過100 kD的超濾管超濾後的濾過 液。
[0024]

【具體實施方式】
[0025] 實施例1、聚賴氨酸高度螢光化修飾納米微球的製備與疊氮化修飾 取5 g聚賴氨酸鹽酸鹽溶於500 mL純水，上樣於活化的001X7陽離子交換樹脂 (2X80cm)脫鹽，上樣速度為1 mL/分鐘。經1500 mL純水平衡至流出液為中性後，用5%氨 水洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾，濃縮乾燥，得白色至淡黃色固體1. 9 g。
[0026] 取上述脫鹽後的聚賴氨酸200 mg於10 mL純水中，攪拌使其完全溶解得水相溶 液；同時分別將13 mL汽油、12 mL四氯化碳以及1. 25mL Span-80混合，攪拌均勻獲得有機 相。向有機相中加入20 mg NHS-羅丹明（NHS_Rhodamine，Pierce 46406)，攪拌混勻，放置 備用。將上述水相迅速倒入有機相中，12, 000轉攪拌30秒，重複3次，得到均勻的乳化液， 轉移至分液漏鬥中。分別加入50 mL石油醚，室溫攪拌5分鐘，再加入10 mL純水，繼續攪 拌5分鐘，靜置分層，收集水相，得到螢光納米微球粗品。將粗品12, 000轉離心10分鐘， 棄去沉澱，上清液即為聚賴氨酸螢光化修飾的納米自組裝微球。
[0027] 取上述2 mL聚賴氨酸螢光納米微球溶液，加入疊氮化試劑10 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553)(0. 02 mmoL)，室溫攪拌0.5小時，得帶有二硫鍵併疊氮修飾的納米自組裝 聚賴氨酸納米微球，4 °C保存備用。合成路線如圖1所示。
[0028] 實施例2、聚賴氨酸螢光納米微球的製備與疊氮化修飾 取上述實施例1脫鹽後的聚賴氨酸50 mg溶於10 mL純水中，得水相溶液；同時分別將 5mL汽油、15mL四氯化碳以及0.5 mL Span-80混合，攪拌均勻獲得有機相。向有機相中加 入0. 1 mg NHS-羅丹明（NHS-Rhodamine，Pierce 46406)，攪拌溶解，放置備用。將上述水相 迅速倒入有機相中，20, 000轉高速攪拌15秒，重複3次，得到均勻的乳化液，轉移至分液漏 鬥中。分別加入20 mL石油醚，攪拌5分鐘，再加入10 mL純水，繼續攪拌5分鐘，靜置分 層，收集水相，得到螢光納米微球粗品。將粗品12, 000轉離心10分鐘，棄去沉澱，上清液即 為聚賴氨酸螢光納米自組裝微球。取上述聚賴氨酸螢光納米微球溶液2 mL，加入疊氮化試 劑50 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553) (0· 1 mmoL)，室溫攪拌5小時，得到疊氮化修飾的 納米自組裝聚賴氨酸納米微球，4 °C備用。合成路線同圖1。
[0029] 實施例3、聚賴氨酸螢光納米微球的製備與高度疊氮化修飾 取上述實施例1脫鹽後的聚賴氨酸20 mg溶於10 mL純水中，得水相溶液；同時分別 將15 mL汽油、5 mL四氯化碳以及0.2mL Span-80混合，攪拌均勻獲得有機相。向有機相中 加入 2 mg NHS-羅丹明（NHS-Rhodamine，Pierce 46406) (0.002 mmoL)，攬祥溶解，放置備 用。將上述水相迅速倒入有機相中，10, 〇〇〇轉高速攪拌20秒，重複3次，得到均勻的乳化 液，轉移至分液漏鬥中。分別加入10 mL石油醚，攪拌5分鐘，再加入10 mL純水，繼續攪 拌5分鐘，靜置分層，收集水相，得到螢光納米微球粗品。將粗品12, 000轉離心10分鐘， 棄去沉澱，上清液即為聚賴氨酸螢光納米自組裝微球。取上述聚賴氨酸螢光納米微球溶液 4 mL，加入疊氮化試劑 200 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553)(0.4 mmoL)，室溫攪拌 5 小時， 可得到高度疊氮化修飾的納米自組裝聚賴氨酸納米微球，4 °C備用。合成路線同圖1。
[0030] 實施例4、牛蒡子苷元的炔基化修飾以及與聚賴氨酸螢光納米微球的連接 以含有酚羥基的藥物牛蒡苷元為例，通過與丙炔酸的酯化反應進行藥物的炔基化修 飾，進一步通過點擊化學反應與實施例1所製備的疊氮化修飾的聚賴氨酸螢光納米微球偶 聯，合成路線見圖2。具體實施如下： 向圓底燒瓶中分別加入〇. 372 g牛蒡子苷元（1 mmoL)，0. 198 g EDOHC1 (2 mmoL)， 以及5 mL預冷的CH2C12溶劑，磁力攪拌30分鐘，溶解後再依次加入0. 116 g N-羥基琥珀 醯亞胺（NHS，2 mm〇L)，0. 140 g丙炔酸（2 mmoL)，保持冰浴反應4小時。待反應結束後， 向反應液中加入15 mL CH2C12稀釋，然後依次用1M HC1，5% NaHC03溶液，以及飽和食鹽水 洗滌。收集有機相，加入無水Na2S04乾燥，過濾，減壓蒸餾濃縮，得到油狀物即為牛蒡子苷元 丙炔酸酯粗品。
[0031] 將粗品過矽膠柱純化，得到白色固體粉末，稱重得牛蒡子苷元丙炔酸酯0. 196 g， 產率約為 47%。=0.7 (PE / EtOAc 1:1);屮 NMR [CDC13, 400 MHz] 6.98-6.94 (m, 1H), 6.79-6.75 (m, 2H), 6.68-6.65 (m, 1H), 6.58-6.50 (m, 2H), 3.84(s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.76-3.74 (m, 2H), 2.97-2.95 (m, 2H), 2.83 (s, 1H), 2.66-2.48 (m, 4H)。
[0032] 取上述所得的5 mg牛蒡子苷元丙炔酸酯（0. 01 mmoL)溶於100 μ L二甲基亞 碸（DMS0)中，並將其緩慢滴入實施例1製備的1 mL疊氮修飾的聚賴氨酸自組裝納米微球 溶液中，最後加入點擊化學反應的催化劑（〇. 2 mmol/L Tris-triazoleamine，1.0 mmol/L &^04和2.0 mmol/L抗壞血酸鈉)，室溫攪拌1小時。反應結束後加入到截留分子量為3 MilliporekD的超濾管中，3000轉離心30分鐘，棄去濾液，分別用0. 2 mmol/L磷酸鹽緩衝 液2 mL洗滌2次，收集截留液，即為連接有牛蒡子苷元的高度螢光化修飾的納米微球。
[0033] 實施例5、聚賴氨酸螢光納米微球的形態學與螢光特徵 上述實施例3所製備的牛蒡子苷元修飾的聚賴氨酸螢光納米載藥微球在水溶液中呈 現橙黃色，且分散均勻（圖3 A)。通過線光源照射，能夠明顯看到丁達爾現象，證明是膠體溶 液，如圖3 B所示。經雷射粒度分析儀分析，其平均粒徑為38 nm (圖3 C)。採用TEM透射 電子顯微鏡進行觀查，該聚賴氨酸納米微球的粒徑大小均勻，呈規則球狀（圖3 D)，進一步 放大觀測顯示其內部為空心狀，如圖3 E所示。
[0034] 採用螢光光譜儀分別對相同用量的羅丹明溶液和聚賴氨酸螢光納米微球進行了 螢光光譜掃描，考察納米自組裝球的螢光特性。如圖3F所示，在507nm的激發波長下，羅丹 明溶液的最大發射波長為590 nm，而聚賴氨酸螢光納米微球的最大發射波長接近600 nm。 但二者的螢光強度明顯不同，羅丹明溶液的螢光強度為625 a. u，而螢光納米微球的螢光強 度為1149 a. u幾乎增加了一倍。這是因為聚賴氨酸將螢光染料羅丹明較為集中地組裝到 納米微球的內部，微球內部的螢光量子效率提高導致螢光強度得到增強，符合近紅外螢光 探針的基本要求，可有效避免生物樣本的自身幹擾，適合藥物分子的示蹤分析。
[0035] 實施例6、甘草次酸的炔基化修飾以及與聚賴氨酸螢光納米微球的連接 以含有羧酸的藥物甘草次酸為例，通過與丙炔胺的醯胺化反應進行藥物的炔基化修 飾，進一步通過點擊化學反應與實施例2所製備的高度疊氮化修飾的聚賴氨酸螢光納米微 球偶聯，合成路線見圖4。具體實施如下： 向圓底燒瓶中分別加入0. 941 g甘草次酸（2 mmoL)，0. 460 g EDOHC1 (2. 4 mmoL)， 0. 324 g HOBt (2.4 mmoL)，以及5 mL預冷的CH2C12溶劑，磁力攪拌30分鐘，溶解後滴加 三乙胺（TEA) 0.7g (約7 mmoL)，繼續攪拌30分鐘，加入0.165 g丙炔胺（3 mmoL)，保持 冰浴反應過夜。待反應結束後，向反應液中加入15 ml CH2C12稀釋，然後依次用1M HC1，5% NaHC03溶液，以及飽和食鹽水洗滌。收集有機相，加入無水Na2S04乾燥，過濾，減壓蒸餾濃 縮，得到油狀物即為甘草次酸的丙炔醯胺衍生物粗品。
[0036] 進一步採用中壓製備液相進行純化，得到白色固體粉末，稱重得丙炔醯胺化甘草 次酸產物 〇· 482 g,產率約為 48%。屮 NMR (400 MHz, CDC13) δ 5. 93 (t, / = 5. 0 Hz, 1H), 5.70 (s, 1H), 4.13 (ddd, /= 17.5, 5.4, 2.5 Hz, 1H), 4.03 (ddd, /= 17.5, 4.9, 2.5 Hz, 1H), 3.24 (dd, /= 10.5, 5.8 Hz, 1H), 2.80 (dt, /= 13.3, 3.3 Hz, 1H), 2.35 (s, 1H), 2.26 (t, / = 2. 5 Hz, 1H), 2.17 (dd, /= 12.2, 5.1 Hz, 1H), 2.11 - 2.00 (m, 2H), 1.96 (d, /= 10.4 Hz, 1H), 1.90 - 1.74 (m, 3H), 1.72 -1.58 (m, 4H), 1.51 - 1.43 (m, 2H), 1.42 - 1.37 (m, 6H), 1.25 - 1.18 (m, 1H), 1.18 - 1.12 (m, 9H), 1.05 - 1.00 (m, 4H), 0.96 (dd, /= 12.5, 4.7 Hz, 1H), 0.87 - 0.78 (m, 6H), 0.71 (d, /= 11.7 Hz, 1H) ;13C NMR (101 MHz, CDC13) δ ppm 200.18, 175.51, 169.09, 128.54, 79.78, 78.78, 71.67, 61.83, 54.95, 48. 04, 45. 37, 43. 54, 43. 19, 41. 77, 39. 16, 37. 35, 37. 08, 32. 76, 31. 90, 31. 44, 29.31, 28.40, 28.11, 27.28, 26.43, 23.35, 18.67, 17.48, 16.37, 15. 58〇
[0037] 取上述所得的甘草次酸丙炔醯胺衍生物100 mg(約0. 2 mmoL)溶於500 μ L DMS0 中，並將其緩慢滴入實施例2製備的4 mL疊氮修飾的聚賴氨酸自組裝納米微球溶液中， 最後加入點擊化學反應的催化劑（2 mmol/L Tris_triazoleamine，15 mmol/L (]11304和30 mm〇l/L抗壞血酸鈉)，室溫攪拌2小時。反應結束後加入到截留分子量為3 kD的Millipore 超濾管中，3000轉離心30分鐘，棄去濾液，分別用0. 2 mmol/L磷酸鹽緩衝液5 mL洗滌 3次，收集截留液，即為連接有甘草次酸藥物的螢光納米微球，可用於靶點蛋白的捕獲與分 離。
[0038] 實施例7、聚賴氨酸螢光納米微球應用於細胞與活體成像 分別取上述實施例1和2所製備的聚賴氨酸螢光納米自組裝微球30 μ?，加入到人肺 上皮BEAS-2B的培養細胞中，採用共聚焦顯微鏡TCS SP5觀察，使用543 nm激發光，570 nm 發射光檢測細胞內的載藥納米微球的分布狀況。結果如圖5A所示，沒有連接藥物的納米 微球孵育3h後，將細胞用DAPI染色後，反覆洗去游離的螢光染料，經觀察只能看到細胞核 DAPI的藍色螢光，幾乎看不到羅丹明的紅色螢光。而偶聯有牛蒡子苷元的納米微球，同樣 經3小時孵育後，進行DAPI染色，並反覆洗去游離的螢光染料，鏡下觀察發現細胞核呈藍 色，而胞漿內有著很強的紅色螢光，但細胞膜和細胞核內均沒有羅丹明的明顯紅色螢光（圖 5B)。結果表明，本專利所發明的載藥納米微球具有良好的生物相容性，可以有效地進入靶 細胞內，為進一步靶點蛋白的捕獲與富集提供了可行性。
[0039] 為了進一步觀測所製備的載藥納米微球在小鼠體內的示蹤變化，取昆明小鼠並尾 靜脈注射100 μ?實施例2所製備的螢光納米微球，並採用小動物活體成像系統觀測納米微 球在小鼠體內的分布情況。結果如圖5C所示，與給藥前0分鐘的對照組相比，給藥60分 鍾後小鼠的腹腔下部有著明顯的羅丹明螢光聚集，表明載藥聚賴氨酸螢光納米微球經過小 鼠體液循環之後，被代謝並轉移到了小鼠的膀胱中。
[0040] 實施例8、甘草次酸靶點蛋白的捕獲與SDS-PAGE電泳分析 將培養的人肺上皮BEAS-2B細胞鋪於六孔板中，待融合度達到80%以上，密度達到105 以後，分別加入實施例5所製備的連接甘草次酸的聚賴氨酸螢光納米微球100 μ?。採用 DMEM完全培養基繼續培養48小時；經胰酶消化30秒，收集細胞並將細胞懸浮於PBS中，冰 浴中超聲處理，破碎細胞。4°C，10, 000轉離心10分鐘，棄去細胞碎片以及未破碎的細胞， 取上清得到包含有靶點蛋白的聚賴氨酸納米微球的混合溶液（圖6,步驟1)。
[0041] 將上述混合溶液加入到截留分子量為3 kD的Millipore超濾管中，3000轉離心， 經生理鹽水混懸並再次離心棄去小分子，分別收集濾液1和截留液（圖6,步驟2);將截留液 加入到截留分子量為100 kD的Millipore超濾管中，3, 000轉離心，經生理鹽水混懸並再 次離心棄去納米微球未結合的大分子蛋白，分別收集濾液2和截留液（圖6,步驟3);向截留 液中加入100 mM的DTT溶液100 μ?，靜置15分鐘後再次加入到截留分子量為100 kD的 Millipore超濾管中，3, 000轉離心，收集濾液3和截留液4 (圖6,步驟4);具體操作步驟 如圖6所示。
[0042] 分別收集上述的濾液和截留液，並採用10%SDS_PAGE電泳對捕獲效果進行分析。 結果如圖7所示：第1泳道是蛋白Marker，第2泳道為細胞裂解液樣品；經過3 kD的超濾 管超濾，濾液中幾乎沒有明顯的蛋白條帶，如第3泳道所示；而將截留液再上100 kD的超濾 管，濾液中可以檢測到大量的蛋白條帶，表明是未與納米微球結合的細胞可溶性蛋白（第4 泳道）；將截留液加入DTT還原之後，經過100 kD的超濾管，得到的濾液即為與甘草次酸結 合的靶點蛋白以及相關蛋白(第6泳道);而剩餘的截留液，包括沒有通過濾膜的納米微球中 幾乎檢測不到可溶性蛋白（第5泳道)。
[0043] 本實施例表明，本發明公開的聚賴氨酸螢光納米自組裝載藥球，不但可以進行靶 點蛋白的示蹤定位，還可以進行靶點蛋白的捕獲富集，在藥物作用機制的研究方面有很好 的應用前景。
【權利要求】
1. 一種多用途聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體，是在骨架材料上共價連接有螢光標 記基團和藥物分子製成；所述的骨架材料是由含有25?30個賴氨酸殘基通過醯胺鍵依次 連接而成的同型單體聚合物；所述骨架材料上的賴氨酸殘基同時修飾了帶有二硫鍵的疊氮 基團側鏈以及螢光標記物，能夠通過自組裝製備納米微球，並能用於藥物分子的連接。
2. 根據權利要求1所述的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體，其特徵在於所述的螢光 示蹤標記基團是含有羅丹明的標記分子。
3. 根據權利要求2所述的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體，其特徵在於所述的含有 羅丹明的螢光標記分子是通過羅丹明的活化酯，與聚賴氨酸的氨基以醯胺鍵的形式進行連 接。
4. 根據權利要求1所述的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體，其特徵在於所述的帶有 二硫鍵的疊氮基團側鏈，其一端是活化酯，通過聚賴氨酸的氨基以醯胺鍵的形式與納米微 球載體相連接。
5. 根據權利要求1所述的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體，其特徵在於所述的藥物 分子，是炔基修飾的藥物衍生物，並能夠通過點擊化學的方法將其與納米微球載體的疊氮 基團側鏈相連接。
6. 權利要求1所述聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體的製備方法，其特徵是該方法的 具體製備如下： 第1、向含有1%至5% Span-80的由汽油和四氯化碳組成的混合有機相中加入NHS-羅 丹明，其中汽油和四氯化碳的體積比可為1:3至3:1，溶解後再加入含有0. 2%-2%聚賴氨酸 的水溶液，10, 〇〇〇至20, 000轉高速攪拌後得到乳化液；其中有機相和水相的比例為1:1至 5:1，NHS-羅丹明的用量為聚賴氨酸的0. 5%至10% ; 第2、將上述乳化液轉移至分液漏鬥中，分別加入上述體積比1:1至5:1的石油醚以及 水溶液，混合均勻後靜置分層，收集水相，離心棄去沉澱，上清液即為自組裝的聚賴氨酸熒 光納米微球； 第3、向第2步得到的納米微球溶液中加入疊氮化試劑Sulfo-SADP，室溫攪拌反應0. 5 小時至5小時，得疊氮修飾的納米微球； 其中Sulfo-SADP的用量為聚賴氨酸用量的10%至100% ; 第4、進一步將炔基修飾的藥物緩慢滴入第3步得到的納米微球溶液中，攪拌條件下加 入點擊化學反應的催化劑，室溫反應〇. 5小時至5小時，反應液經超濾濃縮，即為連接有藥 物的螢光納米微球；其中炔基修飾藥物的用量為聚賴氨酸用量的10%至100%。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於第4項所述的炔基修飾的藥物，是採用丙炔 酸與含有羥基的藥物通過酯化的方式製備的丙炔酸酯，或採用丙炔胺與含有羧基的藥物通 過醯胺化的方式製備的丙炔醯胺衍生物。
8. 權利要求1所述的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體的應用，用於被修飾藥物在動 物組織以及細胞水平的示蹤成像分析，以及靶點定位研究。
9. 權利要求1所述的聚賴氨酸螢光自組裝納米微球載體的應用，用於在組織與細胞水 平捕獲靶點蛋白，通過裂解二硫鍵能夠釋放出靶點蛋白及其關聯蛋白。
【文檔編號】B82Y5/00GK104146964SQ201410391369
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月11日 優先權日:2014年8月11日
【發明者】白鋼, 崔慶新, 侯媛媛, 姜民 申請人:南開大學