禽流感病毒h9亞型陽性血清和陰性血清標準物質及製備方法

2023-05-15 09:47:21

專利名稱：禽流感病毒h9亞型陽性血清和陰性血清標準物質及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種禽流感病毒H9亞型陽性血清合陰性血清標準物質及製備方法， 屬於獸用生物製品領域。
背景技術：
英國藥典(BP)的化學對照物質是從1963年才開始提出，由於WHO在英國建 立了國際生物標準物質中心，所以英國一直沿用國際標準物質，而其本國標準物質建立 較晚，至1970年後，歐洲藥典問世，英國除引用國際標準物質外，也用歐洲藥典標準物 質，少量使用本國的標準物質。即使如此，BP1968年版及其增補本再加英國藥典(1968 年)收載的數量已超過260個，1980年版已超過300個，BP1993版收載了 371個。美 國藥典委員會可提供約1805多種藥品標準物質；歐洲藥典委員會有2098種，其中生物制 品標準物質有319種。目前，我國已研製出國家一級標準物質1262種，二級標準物質1739種，涉及鋼 鐵、地質、石油、核材料、環境、食品以及臨床檢驗等領域。獸用生物製品的標準物質 研究較滯後，目前只有192種，而獸用生物製品檢驗用標準物質幾乎為零。獸用生物製品標準物質是控制和確定獸用生物製品產品質量、校準驗證檢驗儀 器和方法是否準確的物質標準，是正確診斷傳染病、準確監測免疫情況的物質基礎。禽流感(Al)是我國重點防控的重大動物疫病，禽流感病毒(AIV)H9亞型流行很 廣泛。目前禽流感診斷、免疫監測及其疫苗免疫效果評價中應用最廣泛的方法是HI試 驗，這是2006年我國農業部批准通過的方法，但是目前我國尚無禽流感病毒H9亞型血凝 抑制試驗用標準物質及其相關研究的報導，國外國際動物衛生組織(O正)等參考實驗室 也沒有，嚴重影響了前後不同時期檢測數據的一致性和不同實驗室數據的可比性。近年 各級實驗室對禽流感標準物質的需求越來越多，特別是H9亞型和H5亞型相關的診斷試 劑標準物質，因此研製禽流感病毒H9亞型血凝抑制抗原標準物質尤為迫切，該標準物質 是禽流感H9亞型準確診斷、免疫監測及對其疫苗免疫效果進行正確評價的根本保障，提 高禽流感的防控水平。目前我國標準物質的研製主要參考和遵循1987年7月10日國家計量局發布實施 的《標準物質管理辦法》以及一級標準物質技術規範(JJG 1006-94)，但是這個技術規範 是適用於化學成分、物理化學特性及工程技術特性一級標準物質的研製，對於生物製品 標準物質，特別是獸用生物製品標準物質研製目前尚無技術規範可循。因此獸用生物制 品標準物質研製是一項無基礎的研究，填補了該項研究領域的空白。

發明內容
本發明涉及禽流感病毒H9亞型陽性血清和陰性血清標準物質及製備方法。本標 準物質的陽性血清標準物質有強陽性血清標準物質和弱陽性血清標準物質，此兩種陽性血清標準物質只與禽流感病毒H9亞型抗原呈陽性反應，其HI分別為2 71og2和41og2 51og2 ；此兩種陽性血清與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋症候群病毒抗原均應為 陰性反應；陰性血清標準物質在同一條件下，分別與禽流感、雞新城疫、減蛋症候群病 毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、減蛋綜 合徵病毒抗原均為陰性反應。其製備方法主要為(1)按常規方法用禽流感病毒H9亞型CKSHOl株病毒製備 的油乳劑滅活疫苗；(2)陽性血清標準物質候選物系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽 流感病毒H9亞型油乳劑滅活疫苗，製備強陽性血清候選物需經2次免疫，製備弱陽性血 清候選物僅1次免疫，選取HI抗體效價2 81og2和51og2的免疫雞隻，分別採集SPF雞血 清並進行半成品檢驗，並分別加入適宜穩定劑後凍幹；(3)陰性血清系採自SPF雞血，分 離血清並進行半成品檢驗，凍幹；(4)以上製備的強陽性血清、弱陽性血清和陰性血清 標準物質候選物經檢驗、均一性檢驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值而成為強陽 性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質。本發明的技術方案一、禽流感病毒H9亞型陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質的製備1.免疫用疫苗的製備(1)病毒液的製備及檢驗用禽流感病毒H9亞型CKSHOl株病毒(由中國國家禽 流感參考實驗室(中國哈爾濱市中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所內)鑑定、保管和供 應)按照常規方法製備病毒液，並對病毒液進行檢驗1)無菌檢驗每瓶雞胚液分別取樣，按《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典 委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版三部.中國農業出版社，2006，本發明以下 簡稱《中國獸藥典》)規定的方法進行檢驗，應無細菌或黴菌或支原體生長也無外源病2)HA價測定每瓶雞胚液分別取樣，按本說明書附錄進行(下稱《附錄》)，樣 品對雞紅細胞凝集價均2 71og2。(2)病毒液的滅活及檢驗1)滅活將上述檢驗合格的胚液以滅菌多層紗布濾過，混合於一個大容器內，按 最終濃度為0.2%的量加入甲醛溶液；加甲醛溶液後最好傾倒於另一瓶中，以避免瓶頸附 近粘附的病毒未能接觸滅活劑。然後置於37°C滅活24h (以瓶內溫度達到37°C開始計時， 期間振搖1次)。滅活後將胚液置於2 8°C條件下保存。2)滅活檢驗取10 11日齡SPF雞胚5個，各尿囊腔內接種滅活胚液0.1ml， 37°C孵育72h，收穫雞胚液，測定血凝性為陰性，並盲傳1代，測定血凝性，也無血凝現 象，判為滅活完全。(3)佐劑的選擇選用符合生物製品規定的進口佐劑，如德國產的MarC0152白 油、新加坡產的80和司盤80等為乳化佐劑。(4)保護劑的處理將司盤和白油按6 94的比例混合後加熱至130°C 30min，無 菌冷卻後備用；吐溫經高壓滅菌後備用。(5)疫苗的製備先將滅菌後的吐溫按8%的比例加入滅活檢驗合格的病毒液中， 將其混勻；將冷卻的白油佐劑定量加入組織搗碎機內，低速開啟組織搗碎機，將混勻吐
4溫的病毒液按白油佐劑1/2的量緩慢加入組織搗碎機內，然後將組織搗碎機的轉速提高 至SOOOr/min工作lOmin。將獲得油包水型疫苗分裝於疫苗瓶內備用。2.陽性血清製備(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養於負壓隔離器內，用製備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式2次接種疫苗，第一次接種劑量為1.0ml/只，間隔21日後進行第二 次接種，劑量為1.5ml/只，且分點注射。(2)試血於第2次免疫接種後28日，用翅下靜脈採血方式採集血清，採血同時對 雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(《附錄》)，挑選HI抗體效價2 81og2的SPF 雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價2 81og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔離 器內進行心臟採血，血液採集完畢後先置於37°C4h，然後再置於4°C冰箱內過夜，在無 菌室超淨工作檯內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心後混合於同一 滅菌後的容器內。(4)血清半成品的檢驗1)無菌檢驗對混合後的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或黴 菌生長。2)HI抗體價的測定按附錄進行測定，結果應2 81og2。3)特異性鑑定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新 城疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感病 毒H9亞型抗原呈陽性反應(HI^71og2)，與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合 徵病毒抗原均應為陰性反應(HI < 41og2)。(5)血清的配製經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物 公司生產)和0.5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍幹保護劑 並充分攪拌均勻，並按照《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(6)分裝與凍幹將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶1ml，分裝後迅速放入凍 幹機內進行冷凍真空乾燥。凍幹後扎鋁蓋、標號後放置-20°C保存。(7)成品檢驗1)物理性狀呈微黃色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁分離，加稀釋液後迅速溶解， 溶解後的外觀應與液體血清相同。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規定方法進行，應無菌生長。3)效價測定按《附錄》進行，HI抗體效價應2 71og2。4) pH測定將血清按規格稀釋後，用pH儀測定其pH值，應為7.9 8.2。5)特異性檢驗同半成品，應符合規定。6)剩餘水分測定按《中國獸藥典》剩餘水分測定法進行，應低於4%。7)真空度測定按《中國獸藥典》真空度測定法進行，符合規定。8)血清HI抗體效價的定值①定值方法紅細胞凝集抑制試驗96孔微量板法進行測定。②定值單位由6 8家具有資質且事先經過比對確認其定值能力相同的試驗室， 採用同一方法進行協作標定。
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③定值要求(a)應對每個被測標準樣品分別做6到8次獨立的測定，分兩個單元，每個單元 做3次獨立測定；兩個單元之間相隔不少於3天。所獲得的6個數據應按統計學方法檢 驗異常值，如發現有異常值，應予標明，並補做一次測定。然後報出全部結果。(b)所有用於定值測量的計量器具/測量儀器需經檢定或校準合格，並在有效期 內。④數據處理(a)匯總全部原始數據，考察全部測量數據分布的正態性。(b)在數據服從正態分布或近似正態分布的情況下，將每個實驗室的所測數據的 平均值視為單次測量值，構成一組新的測量數據。用統計學方法從統計上剔除可疑值。 計算出總平均值和標準偏差。(c)當全部數據服從正態分布或近似正態分布情況下，也可視其為一組新的測 量數據。用統計學方法從統計上剔除可疑值，再計算全部原始數據的總平均值和標準偏差。9)均一性檢驗①抽樣數量凍幹數量在500支以上時取樣25支；凍幹數量在500隻以下時取樣 15支。②測量分別稱量每支內容物的淨重量，用統計學方法分析其均一性。③穩定性檢驗血清分別在-20°C、4°C、37°C條件下保存，並定期進行HA價 測定，每一時間均要進行數次重複測量，用統計學方法剔除可疑值，再計算每次的平均 值，該值與定值的偏差應不大於標準偏差。3.弱陽性血清製備(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養於負壓隔離器內，用製備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式接種疫苗，接種劑量為0.5ml/只。(2)試血於免疫接種後14 21日，用翅下靜脈採血方式採集血清，採血同時 對雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按《附錄》進行)，挑選HI抗體效價為 51og2的SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價51og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔離器 內進行心臟採血，血液採集完畢後先置於37°C 4h，然後再置於4°C冰箱內過夜，在無菌 室超淨工作檯內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心後混合於同一滅 菌後的容器內。(4)血清半成品的檢驗1)無菌檢驗對混合後的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或黴 菌生長。若有雜菌汙染，應用0.22 y的濾膜對其進行過濾除菌。2)HI抗體價的測定按《附錄》進行測定，結果應為51og2。3)特異性鑑定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞 新城疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感 病毒H9亞型抗原呈陽性反應(HI為51og2)，與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜 合徵病毒抗原均應為陰性反應。
(5)血清的配製經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物 公司生產)和0.5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍幹保護劑 並充分攪拌均勻，並按照《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(6)分裝與凍幹將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶lml，分裝後迅速放入凍 幹機內進行冷凍真空乾燥。凍幹後扎鋁蓋、標號後放置-20°C保存。(7)成品檢驗1)物理性狀同陽性血清。2)無菌檢驗同陽性血清。3)效價測定按《附錄》進行，HI抗體效價應41og2或51og2。4) pH測定將血清按規格稀釋後，用pH計測定其pH值，應為7.6 8.25)特異性檢驗同陽性血清。6)剩餘水分測定同陽性血清。7)真空度測定同陽性血清。8)血清HI抗體效價的定值同陽性血清。9)均一性檢驗同陽性血清。10)穩定性檢驗同陽性血清。4.陰性血清(1)血清分離青年SPF雞飼養於生物安全動物實驗室內的負壓隔離器內，以無 菌注射器在生物安全動物實驗室內的負壓隔離器內進行心臟採血，血液採集完畢後先置 於37°C4h，然後再置於4°C冰箱內過夜，在無菌室超淨工作檯內提取血清，然後混合於 同一滅菌後的容器內。(2)血清半成品的檢驗1)無菌檢驗對混合後的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或黴 菌生長。2)效價測定按附錄進行，HI抗體效價應為陰性。3)特異性將血清在同一條件下(按《附錄》進行)，分別與禽流感、雞新城 疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、 雞新城疫、減蛋症候群病毒抗原均為陰性反應。(3)血清的配製按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物公司生產)和0.5% 的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍幹保護劑並充分攪拌均勻，並 按照二〇〇五年版《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(4)分裝與凍幹按2ml/瓶進行定量分裝，分裝後迅速冷凍真空乾燥凍幹，按 《中華人民共和國獸用生物製品規程》(中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生
物製品規程二〇〇〇年版，化學工業出版社，2001，本發明簡稱《規程》)規定方法進 行。(5)成品檢驗1)物理性狀呈微黃色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁分離，加稀釋液後迅速溶解， 溶解後的外觀應與液體血清相同。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行，應無菌生長。
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3)效價測定同陽性血清。4)特異性同陽性血清。5)剩餘水分測定按《中國獸藥典》剩餘水分測定法進行，應低於4%。6)真空度測定按《中國獸藥典》真空度測定法進行，符合規定。二、H9亞型陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質的使用陽性、弱陽性血清系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒H9亞型油乳 劑滅活疫苗後，採集SPF雞血清並加入適宜穩定劑後凍幹製成；陰性血清系採自SPF雞 血，分離血清，凍幹製成。 主要用於禽流感病毒H9亞型HI試驗對照。1.標準抗原的稀釋取禽流感H9亞型抗原凍幹安瓿1支，啟封后加lml生理 鹽水恢復原量；先做10倍、20倍、80倍稀釋。然後依次進行1/320、1/400、1/480、 1/560、1/640 倍稀釋。2.紅細胞凝集試驗(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25 ii L加入到孔中，加入生理 鹽水25iiL，再加入雞紅細胞懸液25iiL。(2)對照50 ii L生理鹽水+25 u L 1 %雞紅細胞懸液。(3)微量振蕩器振蕩lmin 2min。(4)室溫(24 26 °C )放置30min，判定結果。將血凝板傾斜70 °且靜置 lOmin左右開始記錄，凡反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現 與紅細胞對照孔一樣者為完全不凝集孔(_)；反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面緩慢 向下呈淚珠狀流淌者為不完全凝集孔(+)；反應孔底部有紅細胞沉積但不沿傾斜面流淌 者為50%凝集孔(++)；除底部有少許紅細胞外，反應孔其他部位幾乎為完全凝集孔者 (+++)；反應孔底部無紅細胞，整個反應孔完全凝集者為完全凝集孔(#)。(5)結論完全凝集孔對應的最高稀釋度應為1/400倍稀釋。3.微量血凝抑制試驗(1)4HA■抗原的配製與驗證1)抗原稀釋方法將含有400個血凝單位的抗原先進行10倍稀釋，再進行100 倍稀釋，即100倍稀釋液為4HA■血凝素。將配製的4HA1(I(IU血凝素用生理鹽水進行 1 2、1 3、1 4、1 5、1 6 禾口 1 7 稀釋。2)取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25 PL加入到孔中，加入生理鹽 水25iiL，再加入雞紅細胞懸液25iiL。3)對照50 ii L生理鹽水+25 u L 1 %雞紅細胞懸液。4)以上試驗做2個平行重複。5)在微量振蕩器振蕩lmin 2min。6)室溫(24 26°C )放置30min，判定結果。7)判定標準如果配製的抗原液為4HA，則1 4稀釋度將給出100%凝集點， 即反應孔底部無紅細胞，整個反應孔完全凝集；如果4HA1(I(I高於4個單位，可能1 5或 1 6為100%凝集點；如果較低，則可能1 2或1 3為100%凝集點。應根據測定 結果適當調整，其準確稀釋倍數=使100%紅細胞凝集終點的稀釋倍數X400/4，使抗原工作液確為4HA1QQ。(2)血清的稀釋1)標準陽性血清的的稀釋血清恢復原量後，依次進行10倍、20倍和120倍稀 釋；然後進行720、840、960、1080和1200倍稀釋。將稀釋好的陽性血清每一稀釋倍數 取0.025ml，分別加入到V型微量反應板對應孔中。2)陰性血清的稀釋在V型微量反應板中，每孔加0.025ml生理鹽水；第1孔加 入恢復原量後的陰性血清0.025ml，反覆抽打3 5次混勻；從第1孔吸取0.025ml血清 加入第2孔，混勻後吸取0.025ml加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第6孔，從第6孔吸 取0.025ml棄去。3)被標定血清的稀釋血清恢復原量後，依次進行10倍、20倍和120倍稀釋；然 後進行480、600、720、840、960、1080…依次遞增120倍進行稀釋。將稀釋好的陽性血 清每一稀釋倍數取0.025ml，分別加入到V型微量反應板對應孔中。(3) V型微量反應板上所有血清孔加入4HA1QQ的抗原液25 μ L。最後1排設50 μ L 生理鹽水和25 μ L生理鹽水+25 μ L4HA100抗原(各4個孔)做對照。(4)充分振蕩後，室溫(24 26°C )下靜置30min。每孔再加入雞紅細胞懸 液25yL，充分振蕩。(5)室溫(24 26°C )放置30min後判定結果。將血凝板傾斜70°且靜置 IOmin左右開始記錄，凡反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現 與紅細胞對照孔一樣者為完全不凝集孔(_)；反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面緩慢 向下呈淚珠狀流淌者為不完全凝集孔(+)；反應孔底部有紅細胞沉積但不沿傾斜面流淌 者為50%凝集孔(++)；除底部有少許紅細胞外，反應孔其他部位幾乎為完全凝集孔者 (+++)；反應孔底部無紅細胞，整個反應孔完全凝集者為完全凝集孔(#)。(6)結論標準陽性血清840倍稀釋孔為(_)，960、1080和1200倍稀釋孔和陰性血清所 有稀釋孔為(+)、(++)、(+++)或(#) ； 50 μ L生理鹽水對照孔為(-)，25 μ L生理鹽水 +25 μ L 4ΗΑ·抗原孔為(#)，此時試驗方可判為成立。被標定血清的完全不凝集孔對應的最高稀釋度即為該血清的紅細胞凝集抑制 價。本發明的優點本發明涉及禽流感病毒Η9亞型陽性血清和陰性血清標準物質及製備方法。本標 準物質陽性血清系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒Η9亞型油乳劑滅活疫苗 後，採集SPF雞血清並進行半成品檢驗，加入適宜穩定劑後凍幹；陰性血清系採自SPF 雞血，分離血清並進行半成品檢驗，凍幹；經成品檢驗、均一性檢驗及穩定性檢驗及標 準物質的標定、定值等一系列的工藝過程而製成。該標準物質是禽流感Η9亞型準確診 斷、免疫監測及對其疫苗免疫效果進行正確評價的根本保障，提高禽流感的防控水平。 對禽流感Η9亞型進行診斷和相關產品檢驗工作進行評價和質量控制的基本保障。實施例1陽性血清製造及半成品檢驗1.陽性血清製造
(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養於負壓隔離器內，用製備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式2次接種疫苗，第一次接種劑量為1.0ml/只，間隔21日後進行第二 次接種，劑量為1.5ml/只，且分點注射。(2)試血於第2次免疫接種後28日，用翅下靜脈採血方式採集血清，採血同 時對雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按《附錄》進行)，挑選HI抗體效價 > 81og2的SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價2 81og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔離 器內進行心臟採血，血液採集完畢後先置於37°C4h，然後再置於4°C冰箱內過夜，在無 菌室超淨工作檯內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心後混合於同一 滅菌後的容器內。2.陽性血清半成品的檢驗(1)無菌檢驗對混合後的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或 黴菌生長。(2)HI抗體價的測定按附錄進行HI抗體價的測定，結果應2 81og2。(3)特異性鑑定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞 新城疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感 病毒H9亞型抗原呈陽性反應(HI > 71og2)，與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜 合徵病毒抗原均應為陰性反應(HI < 41og2)。(4)血清的配製經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物 公司生產)和0.5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍幹保護劑 並充分攪拌均勻，並按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(5)分裝與凍幹將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶lml，分裝後迅速放入凍 幹機內進行冷凍真空乾燥。凍幹後扎鋁蓋、標號後放置-20°C保存。實施例2弱陽性血清製造及半成品檢驗1.弱陽性血清製造(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養於負壓隔離器內，用製備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式接種疫苗，接種劑量為0.5ml/只。(2)試血於免疫接種後14 21日，用翅下靜脈採血方式採集血清，採血同時 對雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按《附錄》進行)，挑選HI抗體效價為 51og2的SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價51og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔離器 內進行心臟採血，血液採集完畢後先置於37°C 4h，然後再置於4°C冰箱內過夜，在無菌 室超淨工作檯內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心後混合於同一滅 菌後的容器內。2.弱陽性血清半成品的檢驗(1)無菌檢驗對混合後的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或 黴菌生長。若有雜菌汙染，應用0.22 y的濾膜對其進行過濾除菌。(2)HI抗體價的測定按附錄進行HI抗體價的測定，結果應為51og2。
(3)特異性鑑定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞 新城疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感 病毒H9亞型抗原呈陽性反應(HI為51og2)，與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜 合徵病毒抗原均應為陰性反應。(4)血清的配製經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物 公司生產)和0.5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍幹保護劑 並充分攪拌均勻，並按照二〇〇五年版《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(5)分裝與凍幹將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶lml，分裝後迅速放入凍 幹機內進行冷凍真空乾燥。凍幹後扎鋁蓋、標號後放置-20°C保存。實施例3陰性血清製造及半成品檢驗1.陰性血清製造青年SPF雞飼養於生物安全動物實驗室內的負壓隔離器內，以無菌注射器在生 物安全動物實驗室內的負壓隔離器內進行心臟採血，血液採集完畢後先置於37°C 4h，然 後再置於4°C冰箱內過夜，在無菌室超淨工作檯內提取血清，然後混合於同一滅菌後的容 器內。2.陰性血清半成品的檢驗(1)無菌檢驗對混合後的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或 黴菌生長。(2)效價測定按附錄測定HI抗體效價，應為陰性。(3)特異性將血清在同一條件下(按《附錄》進行)，分別與禽流感、雞新城 疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、 雞新城疫、減蛋症候群病毒抗原均為陰性反應。(4)血清的配製按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物公司生產)和0.5% 的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍幹保護劑並充分攪拌均勻，並 按照二〇〇五年版《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(5)分裝與凍幹按2ml/瓶進行定量分裝，分裝後迅速冷凍真空乾燥凍幹，按照 《規程》規定方法進行。實施例4血清成品檢驗1.物理性狀檢驗結果均為微黃色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液後 迅速溶解。2.無菌檢驗結果檢驗結果見表1，所有凍幹製品全部呈陰性。表1無菌檢驗統計表
權利要求
1.一種禽流感病毒H9亞型陽性血清和陰性血清標準物質，其特徵在於陽性血清標準 物質有強陽性血清標準物質和弱陽性血清標準物質，此兩種陽性血清標準物質只與禽流 感病毒H9亞型抗原呈陽性反應，其HI分別為2 71og2和41og2 51og2 ；此兩種陽性血清 與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋症候群病毒抗原均應為陰性反應；陰性血清標 準物質在同一條件下，分別與禽流感、雞新城疫、減蛋症候群病毒抗原進行紅細胞凝集 抑制試驗，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、減蛋症候群病毒抗原均為陰性 反應。
2.一種禽流感病毒H9亞型陽性血清和陰性血清標準物質及製備方法，其特徵在於(1)按常規方法用禽流感病毒H9亞型CKSHOl株病毒製備的油乳劑滅活疫苗；(2)陽性血清標準物質候選物系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒H9亞 型油乳劑滅活疫苗，製備強陽性血清候選物需經2次免疫，製備弱陽性血清候選物僅1次 免疫，選取HI抗體效價2 81og2和51og2的免疫雞隻，分別採集SPF雞血清並進行半成品 檢驗，並分別加入適宜穩定劑後凍幹；(3)陰性血清系採自SPF雞血，分離血清並進行半成品檢驗，凍幹；(4)以上製備的強陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質候選物經檢驗、均一性 檢驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值而成為強陽性血清、弱陽性血清和陰性血清 標準物質。
全文摘要
本發明涉及禽流感病毒H9亞型陽性血清和陰性血清標準物質及製備方法。本標準物質陽性血清系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒H9亞型油乳劑滅活疫苗後，採集SPF雞血清並進行半成品檢驗，加入適宜穩定劑後凍幹；陰性血清系採自SPF雞血，分離血清並進行半成品檢驗，凍幹；經成品檢驗、均一性檢驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值等一系列的工藝過程而製成。該標準物質是禽流感H9亞型準確診斷、免疫監測及對其疫苗免疫效果進行正確評價的根本保障，提高禽流感的防控水平。對禽流感H9亞型進行診斷和相關產品檢驗工作進行評價和質量控制的基本保障。
文檔編號C07K16/10GK102012433SQ201010532340
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者劉景利, 孫建宏, 張從祿, 徐姍姍, 戴志紅, 田國彬, 胡井雷, 韓正博 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所