一種免疫檢測儀及其試劑在手術中的新用途及使用方法與流程

2023-05-16 00:50:16 4

本發明涉及醫療領域，特別是一種免疫檢測儀及其試劑在手術中的新用途及使用方法

背景技術：

申請號為201610851934.5，授權公告號為cn106370836a，一種免疫檢測儀及其使用方法公開了一種免疫檢測儀，其在實際生產中型號為佰奧達免疫檢測儀，用於對人體的血清、血漿、全血的檢測標誌物(其中包含甲狀旁腺素)進行定量檢測分析，為臨床提供輔助診斷，但是在臨床應用中，我們發現免疫檢測儀聯合甲狀旁腺素檢測試劑可在甲狀腺手術中定量測定從組織中提取的組織洗脫液的甲狀旁腺素含量，其測定結果快速、準確。而分泌甲狀旁腺素是甲狀旁腺獨有的生理功能，其腺體內的甲狀旁腺激素含量遠高於其他組織，因此這一免疫檢測儀及其試劑盒可用於甲狀旁腺的識別，從而為保護甲狀旁腺創造條件。

甲狀腺癌是全球範圍發病率上升最快的實體惡性腫瘤，甲狀腺全切除及中央區淋巴結清掃已成為甲狀腺癌常用的手術治療方式，但是甲狀旁腺損傷導致的術後甲狀旁腺功能低下仍是困擾甲狀腺外科醫師的難題，甲狀旁腺損傷主要包括挫傷、血供障礙和誤切。甲狀腺術後暫時性和永久性甲狀旁腺功能低下的發生率分別為14％-60％和4％-11％，暫時性甲狀旁腺功能低下會造成一過性低鈣症狀，但對病人生活質量不會造成大的影響；而永久性甲狀旁腺功能低下則會造成永久性的低鈣症狀，多以手足麻木和四肢抽搐為表現，嚴重影響病人的生活質量，並成為產生醫療糾紛的主要因素。因此，應重視甲狀腺手術中甲狀旁腺的保護，避免手術時誤切誤傷甲狀旁腺。

但是甲狀旁腺為內分泌腺，多數為扁橢圓形小體，活體呈棕黃色，猶如米粒或似壓扁的黃豆，直徑約3～6mm，外有薄層的結締組織膜包裹。甲狀旁腺的數目不定，文獻報導約48％～62％中國人具有4枚，但也可出現少於4枚或多達十餘個的變異，並且變異的甲狀旁腺其形狀大小及顏色均有變異，形狀會因病變而呈片狀、線狀、條索狀，大小也會因病變而萎縮或增生，色澤因被脂肪包覆而顯脂肪色。這增加了識別的難度。而識別甲狀旁腺的傳統方法主要有肉眼識別法、比重法、冰凍切片病理檢查法、亞甲藍正顯影法、納米碳負顯影法，但是肉眼識別法較為主觀，誤差較大；而比重法不能原位識別，需離體測定，且旁腺被脂肪包裹時，也將浮於水面，很可能被當作脂肪球而誤切；冰凍切片病理檢查則操作複雜，鑑定時間較長(大於30分鐘)需要術者在手術中等待結果，再做下一步操作，延宕手術時間；亞甲藍正顯影法雖較為直觀，但是作為一種藥物，超適應症用藥，副作用大，且無法識別變異的甲狀旁腺；納米碳負顯影法準確率雖較高，但是也常常無法區分脂肪和旁腺，當淋巴管阻塞時，很可能誤導術者的判斷，錯保留已有癌細胞轉移的淋巴結，後果嚴重，且費用較高。因此甲狀旁腺的快速、準確、經濟的識別方法具有實際臨床意義。

技術實現要素：

本發明所要解決的一個技術問題是提供申請號為201610851934.5，授權公告號為cn106370836a，發明名稱為一種免疫檢測儀及其使用方法所公開的一種免疫檢測儀，實際生產中型號為佰奧達免疫檢測儀的新用途。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供這種新用途的操作方法及其提供這種新用途的操作方法中涉及的甲狀旁腺素檢測試劑盒。

本發明達到的技術效果是:

①準確，專一性高，檢測「組織洗脫液」中甲狀旁腺激素的濃度，顯著區分周圍的淋巴結，脂肪等。

②抗幹擾，分泌甲狀旁腺素是甲狀旁腺獨具的生理功能，因此手術部位組織和器官的複雜病生理背景不影響測定結果。

③快速，12分鐘內可以做出判斷，不延宕手術時間。

④操作簡單、判斷直觀，操作步驟1—2人即可完成，直接給出甲狀旁腺激素的濃度數值做判斷。

⑤經濟，成本費用較低，不增加患者負擔。

⑥多點識別，可以同時對手術中多個部位進行識別。

本發明解決上述技術問題採取的技術方案是：申請號為201610851934.5，授權公告號為cn106370836a，發明名稱為一種免疫檢測儀及其使用方法所公開的一種免疫檢測儀的新用途，用於甲狀旁腺的識別。

進一步的，其在甲狀旁腺的識別上的用途是通過對疑似甲狀旁腺組織提取出的組織洗脫液進行檢測達到識別目的的。

本發明人經廣泛研究試驗發現，申請號為201610851934.5，授權公告號為cn106370836a，一種免疫檢測儀及其使用方法所公開的一種免疫檢測儀用於甲狀旁腺的識別上能夠有快速準確的結果。

其用於新用途的具體使用方法是：

為解決上述技術問題，本發明是按如下方式實現的：

步驟1.開機，選擇檢測模式，待檢。

步驟2.提取疑似甲狀旁腺的組織洗脫液。

步驟3.使用移液器吸取步驟2中提取的組織洗脫液90μl，加入甲狀旁腺素檢測試劑盒的進樣區。

步驟4.將步驟3中加入了組織洗脫液的甲狀旁腺素檢測試劑盒插入免疫檢測儀的檢測埠進行檢測。

進一步的，步驟2中所述的疑似甲狀旁腺仍在原位時，其組織洗脫液的提取步驟為：術者術中定位疑似甲狀旁腺，用有齒眼科鑷夾破其被膜，眼科鑷尖端蘸取滲出的組織液，同時手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水，注射到無菌小瓶中；術者將蘸取了組織液的眼科鑷在無菌小瓶中濯洗，將鑷子上粘附的組織液洗脫，術者重複此操作濯洗3次，得組織洗脫液。

進一步的，步驟2中所述的疑似甲狀旁腺仍在原位時，其組織洗脫液的提取步驟還可以為：由手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水，注射至無菌小瓶中，同時注射器中保留少量生理鹽水，再將此注射器穿刺入疑似甲狀旁腺組織內，利用負壓抽吸少量組織液後退針，然後將針尖浸入無菌小瓶的生理鹽水中反覆抽取與注回2-3次，以充分清洗針筒，隨後將液體全部注射至無菌小瓶中，組織洗脫液即製作完畢。這一組織洗脫液的製作方法我們將之命名為針吸法。

進一步的，步驟2中所述的疑似甲狀旁腺已被誤切或雖在原位但觀察已無血供時，其組織洗脫液的提取步驟為：術者可將其取出，成為離體的疑似甲狀旁腺；將其放置於彎盤一角，用手術刀切成多個部分，手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水滴淋其上，術者將之混勻再用注射器回抽，注射到無菌小瓶中，組織洗脫液即製作完畢。

進一步的，在將離體的疑似甲狀旁腺切成多個部分時，應切成片狀，這樣方便在檢測結果為甲狀旁腺後直接植回做補救。

進一步的，步驟1中的檢測模式為常規檢測模式或快速檢測模式中的一種。

進一步的，步驟1中選擇了常規檢測模式時，步驟4中將甲狀旁腺素檢測試劑盒插入免疫檢測儀的檢測埠進行檢測的步驟為：輸入患者信息，將甲狀旁腺素檢測試劑盒插入免疫檢測儀的進樣口，儀器自動計時，時長12分鐘；12分鐘後儀器自動讀數；根據這一取樣方法取樣，根據研究，此法所得數據大於65pg/ml，即可確認該組織為甲狀旁腺。

進一步的，步驟1中選擇了快速模式時，步驟4中將甲狀旁腺素檢測試紙插入免疫檢測儀的檢測埠進行檢測的步驟為：將甲狀旁腺素檢測試劑盒取出並靜置12分鐘後，將甲狀旁腺素檢測試劑盒插入免疫檢測儀的檢測口，輸入患者信息後即讀數；所得讀數大於65pg/ml，即可判斷為陽性；快速檢測模式適用於多個組織或部位需要識別與鑑定的情況。

進一步的，步驟3中所述的甲狀旁腺素檢測試劑盒，包括塑料卡盒與裝在盒裡的甲狀旁腺素檢測試紙，塑料卡盒設置有加樣孔，甲狀旁腺素檢測試紙包括底板、樣品墊、化學偶合墊、反應墊和吸水墊，底板設置為長條形，樣品墊、化學偶合墊、反應墊和吸水墊依次搭接固定覆蓋在底板上方；樣品墊用於接受樣品，樣品墊設置在塑料卡盒的加樣孔下方，步驟2中所得到的組織洗脫液通過加樣孔滴入樣品墊；化學偶合墊上包被有金標抗體偶合物，樣品墊上的組織洗脫液在毛細管作用下前行至化學偶合墊與金標抗體偶合物結合成免疫複合物；反應墊包括檢測區和質控區，檢測區預先包被有甲狀旁腺素第一抗體，在質控區包被有羊抗鏈黴親和素抗體，免疫複合物繼續前行到反應墊的檢測區與甲狀旁腺素第一抗體特異性結合而被截留形成檢測線，未反應完全的免疫複合物繼續前行到反應墊的質控區與羊抗鏈黴親和素抗體特異性結合形成質控線。

進一步的，所述底板設置為pvc材質，所述樣品墊設置為無紡布或玻璃纖維膜，所述化學偶合墊設置為玻璃纖維膜或聚酯膜，所述反應墊設置為硝酸纖維素膜，所述吸水墊設置為吸水濾紙，所述金標抗體偶合物屬於膠體金標記的甲狀旁腺素第二抗體和膠體金標記的鏈黴親和素的偶合物。

本發明所公開的甲狀旁腺素檢測試劑盒採用固相免疫層析分析技術，利用雙抗體夾心法原理，在檢測試紙條硝酸纖維素膜上的檢測區預先包被有甲狀旁腺素第一抗體，在質控區包被有羊抗鏈黴親和素抗體，在檢測試紙條的化學偶合墊上包被有膠體金標記的甲狀旁腺素第二抗體和膠體金標記的鏈黴親和素的偶合物。檢測時，首先將組織洗脫液加到加樣孔中，組織洗脫液中的待檢物甲狀旁腺素多肽鏈的中段(53-68)與化學偶合墊上事先包被的金標抗體偶合物結合形成免疫複合物，該免疫複合物隨著膜的毛細管作用層析至檢測區，與已預先包被在檢測區的甲狀旁腺素第一抗體發生特異性結合(c端結合)而被截留，聚集而形成檢測線，未反應的免疫複合物繼續層析至質控區，與預先包被在膜上的羊抗鏈黴親和素抗體特異性結合，形成質控線。在一定範圍內，檢測線顏色的深淺與待檢樣品中的甲狀旁腺素含量呈正比例關係。反應完成後，通過免疫檢測儀對檢測線和質控線進行掃描分析，並按照儀器內部預置的參數進行計算，從而定量檢測組織洗脫液中的甲狀旁腺激素含量。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，下面結合具體實施方式和附圖，對本發明做進一步詳細說明。在此，本發明的示意性實施方式及其說明用於解釋本發明，但並不作為對本發明的限定。

附圖說明：

圖1，甲狀旁腺素檢測的原理示意圖。

圖2，甲狀旁腺素檢測試紙的結構示意圖。

1、底板；2、樣品墊；3、化學偶合墊；4、反應墊；5、吸水墊；6、檢測線；7、質控線。

1、甲狀旁腺素檢測試劑盒的實施例：包括塑料卡盒與裝在盒裡的甲狀旁腺素檢測試紙，塑料卡盒設置有加樣孔，且塑料卡盒設置有能夠觀察到試紙的透視窗，甲狀旁腺素檢測試紙包括底板、樣品墊、化學偶合墊、反應墊和吸水墊，底板設置為長條形，樣品墊、化學偶合墊、反應墊和吸水墊依次搭接固定覆蓋在底板上方；樣品墊用於接受樣品，樣品墊設置在塑料卡盒的加樣孔下方，步驟2中所得到的組織洗脫液通過加樣孔滴入樣品墊；化學偶合墊上包被有金標抗體偶合物，樣品墊上的組織洗脫液前行至化學偶合墊與金標抗體偶合物結合成免疫複合物；反應墊包括檢測區和質控區，檢測區預先包被有甲狀旁腺素第一抗體，在質控區包被有羊抗鏈黴親和素抗體，免疫複合物繼續前行到反應墊的檢測區與甲狀旁腺素第一抗體特異性結合而被截留形成檢測線，未反應完全的免疫複合物繼續前行到反應墊的質控區與羊抗鏈黴親和素抗體特異性結合得到質控線。

進一步的，所述底板設置為pvc材質，所述樣品墊設置為無紡布或玻璃纖維膜，所述化學偶合墊設置為玻璃纖維膜或聚酯膜，所述反應墊設置為硝酸纖維素膜，所述吸水墊設置為吸水濾紙，所述金標抗體偶合物具體為膠體金標記的甲狀旁腺素第二抗體和膠體金標記的鏈黴親和素的偶合物。

本發明所公開的甲狀旁腺素檢測試劑盒採用固相免疫層析分析技術，利用雙抗體夾心法原理，在檢測試紙條硝酸纖維素膜上的檢測區預先包被有甲狀旁腺素第一抗體，在質控區包被有羊抗鏈黴親和素抗體，在檢測試紙條的化學偶合墊上包被有膠體金標記的甲狀旁腺素第二抗體和膠體金標記的鏈黴親和素的偶合物。檢測時，首先將組織洗脫液加到加樣孔中，組織洗脫液中的待檢物甲狀旁腺素多肽鏈的中段(53-68)與化學偶合墊上事先包被的金標抗體偶合物結合形成免疫複合物，該免疫複合物隨著膜的毛細管作用層析至檢測區，與已預先包被在檢測區的甲狀旁腺素第一抗體發生特異性結合(c端結合)而被截留，聚集而形成檢測線，未反應的免疫複合物繼續層析至質控區，與預先包被在膜上的羊抗鏈黴親和素抗體特異性結合，形成質控線。在一定範圍內，檢測線顏色的深淺與待檢樣品中的甲狀旁腺素的含量呈正比例關係。反應完成後，通過免疫檢測儀對檢測線和質控線進行掃描分析，並按照儀器內部預置的參數進行計算，從而定量檢測組織洗脫液中的甲狀旁腺激素含量。

甲狀旁腺素檢測試劑盒使用了免疫膠體金技術，是以膠體金作為示蹤標誌物標記抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金(colloidalgold)也稱金溶膠，是由金鹽被還原成金後形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核(原子金au)及包圍在外的雙離子層構成，接近於金核表面的是內層負離子(auc12－)，外層離子層h+則分散在膠體間溶液中，顆粒間的靜電排斥力使膠體金游離於溶膠之間，形成懸液。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。膠體金顆粒對蛋白質有很強的吸附功能，而不被壞其生物活性，可以與蛋白質等(葡萄球菌a蛋白、免疫球蛋白)等非共價結合，形成膠體金標記物。體外快速診斷試劑所採用的示蹤材料主要是膠體金納米顆粒，而膠體金顆粒的大小以及分散性是否均一對試劑產品的檢測靈敏性和精密性產生非常大的影響。傳統的膠體金顆粒製備方法獲得的膠體金顆粒顏色往往呈現為紫紅色，大小主要在20-40nm左右，分散性不均勻，從而導致試劑產品的檢測靈敏度偏低，精密性以及批間差比較大。而在這一新用途中涉及的甲狀旁腺(甲狀旁腺素)檢測試劑其顆粒大小為100nm左右，而且具有良好的分散性和均一性，採用該大顆粒膠體金對抗體進行偶合，可大大提高產品的檢測靈敏性以及精密性。

2、免疫檢測儀用於甲狀旁腺識別的使用方法的常規檢測模式的實施例：

步驟1.開機待檢

將佰奧達免疫檢測儀開機，用觸控筆點選常規檢測模式，待檢。

步驟2.組織洗脫液的製作

夾取法：疑似甲狀旁腺在原位時，組織洗脫液的獲取與製作：術者術中定位疑似甲狀旁腺，用有齒眼科鑷夾破其被膜，眼科鑷尖端蘸取滲出的組織液，同時手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水，注射到無菌小瓶中。術者將蘸取了組織液的眼科鑷在無菌小瓶中濯洗，將鑷子上粘附的組織液洗脫，術者重複此操作濯洗3次，得組織洗脫液。

針吸法：由手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水，注射至無菌小瓶中，同時注射器中保留少量生理鹽水，再將此注射器穿刺入疑似甲狀旁腺組織內，利用負壓抽吸少量組織液後退針，然後將針尖浸入無菌小瓶的生理鹽水中反覆抽取與注回2-3次，以充分清洗針筒，隨後將液體全部注射至無菌小瓶中，組織洗脫液即製作完畢。這一組織洗脫液的製作方法我們將之命名為針吸法。

混懸液法：若疑似甲狀旁腺已被誤切或雖在原位但觀察已無血供，術者可將其取出，成為離體的疑似甲狀旁腺。將其放置於彎盤一角，用手術刀切成多個部分，手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水滴淋其上，術者將之混勻再用注射器回抽，注射到無菌小瓶中，組織洗脫液即製作完畢。說明：在將疑似旁腺組織切成多個部分時，最好切成片狀，檢測結果為甲狀旁腺後直接植回做補救。

步驟3.取樣、進樣打開甲狀旁腺檢測試劑盒包裝，取出試劑盒移液槍接好槍頭，使用移液器取上述組織洗脫液90μl，將組織洗脫液從進樣孔加入甲狀旁腺檢測試劑盒。

步驟4.檢測

將甲狀旁腺檢測試紙插入儀器的檢測埠，輸入患者信息，儀器自動計時，時長12分鐘。12分鐘後儀器自動讀數。根據我們臨床試驗的數據，最後檢得結果與冰凍切片病理結果做驗證，此法所得數據大於65pg/ml，時，冰凍切片病理結果為甲狀旁腺。

3、免疫檢測儀用於甲狀旁腺識別的使用方法的快速檢測模式的實施例：

步驟1.開機待檢

將佰奧達免疫檢測儀開機，用觸控筆點選快速檢測模式，待檢。

步驟2.組織洗脫液的製作

夾取法：術者術中定位疑似甲狀旁腺，用有齒眼科鑷夾破其被膜，眼科鑷尖端蘸取滲出的組織液，同時手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水，注射到無菌小瓶中。術者將蘸取了組織液的眼科鑷在無菌小瓶中濯洗，將鑷子上粘附的組織液洗脫，術者重複此操作濯洗3次，得組織洗脫液，這一組織洗脫液的製作方法我們將其命名為夾取法。

針吸法：由手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水，注射到無菌小瓶中。術者用同一個注射器，吸取生理鹽水少許，再將此注射器穿刺入疑似甲狀旁腺組織內，利用負壓抽吸少量組織液，注射器退出體外，然後將針尖浸入裝有生理鹽水的無菌小瓶中反覆抽取、注回生理2-3次，充分清洗針筒後將液體全部注射至無菌小瓶中，組織洗脫液即製作完畢。

混懸液法：若疑似甲狀旁腺已被誤切或雖在原位但觀察已無血供，術者可將其取出，成為離體的疑似甲狀旁腺。將其放置於無菌彎盤一角，用手術刀切成多個部分，手術護士用1ml注射器抽取1ml生理鹽水滴淋其上，術者將之混勻再用注射器回抽，注射入無菌小瓶中，組織洗脫液即製作完畢。說明：在將疑似旁腺組織切成多個部分時，最好切成片狀，確認陽性後直接植回做補救。

步驟3.使用移液器取上述組織洗脫液90μl，從甲狀旁腺素檢測試劑盒的進樣孔滴到甲狀旁腺素檢測試紙，旁置，孵育時間3分鐘-12分鐘。

步驟4.快速檢測

將甲狀旁腺素檢測試紙插入檢測口，輸入患者信息後即讀數。最後檢得結果與冰凍切片病理結果做驗證，此法所得數據大於65pg/ml，均為陽性(即確認是甲狀旁腺)。快速檢測模式適用於多個檢測部位需要檢測或只需初略判斷的情況。

使用免疫檢測儀對甲狀旁腺進行識別，可以在十二分鐘內完成檢測，且使用快速檢測模式，可以同時對多個檢測部位檢測，並且操作簡單方便，成本較低，其原理是對組織洗脫液中甲狀旁腺激素濃度進行檢測，根據濃度結果直觀判斷疑似組織是否為甲狀旁腺，結果較為準確。