一株芽孢桿菌utm03及其應用的製作方法
2023-05-15 08:14:16 1
專利名稱：一株芽孢桿菌utm03及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及環境微生物技術領域，具體地，涉及一種芽孢桿菌菌株UTM03及其應用。
背景技術：
汙泥是汙水廠處理廢水所產生的固態廢棄物。隨著現有汙水處理廠數量的不斷增多與處理工藝的不斷革新，汙水處理量和處理程度的不斷提高，汙泥產量明顯增加。目前，多數汙水處理廠處置汙泥的方法主要有焚燒、填埋、投海以及堆肥。相對而言，汙泥高溫堆肥是通過好氧微生物的生物代謝作用，放出熱量，使有機物轉化成穩定的腐殖質的過程，其處理成本低廉、可有效殺滅病原菌、寄生蟲卵和雜草種籽，並能使水分蒸發，實現汙泥穩定 化、無害化、減量化。汙泥高溫堆肥處理工藝既可作為土地利用的前處理手段，又可作為降低汙泥含水率，提高汙泥熱值的預處理手段，是一種積極有效的汙泥處理方式。在汙泥高溫堆肥過程中，由於微生物的代謝作用，堆體的溫度會上升，先後經歷中溫階段、高溫階段和降溫階段。堆肥高溫期，堆體最高溫度可達60-70°C以上，堆體中絕大部分的寄生蟲、蟲卵、孢子和病原菌等被殺死，是保證堆肥無害化的最重要階段。然而，此時由於微生物有機體的重要組成物質如蛋白質、核酸等對溫度敏感，將隨著溫度的升高遭受不可逆的破壞而導致機體的死亡，使微生物種群活性受到很大的抑制，表現為種類單一，數量減少，比中溫階段要少I 2個數量級，這無疑限制了有機物質的快速降解。研究表明，芽孢桿菌屬微生物是汙泥堆肥高溫期的主要優勢菌之一，但大多以孢子的形式存在，致使原有物料中有效菌數量不足，如能從汙泥高溫期堆肥中將這些有效菌篩選出來，並接種至汙泥堆肥中，增加汙泥高溫期堆肥的有效活菌數，無疑對於促進汙泥堆肥進程及其無害化將具有重要的現實意義。目前，將芽孢桿菌應用於堆肥的菌種主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，但這些菌株均為中溫菌，在促進堆肥進入高溫期後，由於無法忍受高溫的環境，將失去菌體活性。如專利(申請號200910035641.X)中所用的高溫微生物菌種土芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的篩選溫度是50°C，並不能保證在70°C以上的汙泥堆肥高溫期中仍具活性。因此，此類的常規堆肥接種劑所得堆肥產品缺乏足夠的有效嗜熱微生物種群，每次進行堆肥時都需重新製備菌劑，這大大增加了汙泥堆肥的工作量和成本，也忽視了堆肥返料作為溼汙泥的優良調理劑的功能。
發明內容
本發明的目的在於提供一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)及其應用。本發明提供的菌株為芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株，是以高溫期汙泥堆肥作為分離源，在70°C下經富集分離純化得到的，命名為Bacillus sp. UTM 03。採用形態觀察法和16S rRNA序列測定相結合的方法，將該菌鑑定為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，並將其命名為芽孢桿菌UTM03。該菌株已於2011年12月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.，保藏號為CGMCC No. 5643。嗜熱芽孢桿菌菌株UTM03在LB固體培養基平板上的培養I天后特徵是單菌落為淡黃色，圓形，直徑約3mm，表面溼潤，中央扁平，邊緣波狀。其溫度生長特性是在LB固體培養基平板上，挑取單菌落劃線在65-70°C下暗箱培養12-24小時，便可形成明顯菌落。其菌體細胞特徵是桿菌。所述LB固體培養基的成分是胰蛋白腖8-10g，酵母提取物4-6g，氯化鈉8-12g，瓊脂14-18g，植物凝膠8-12g，蒸餾水1000ml，pH 7. 2-7. 4。本發明提供了含有嗜熱地芽孢桿菌UTM03的菌劑。本發明提供了嗜熱地芽孢桿菌UTM03或其發酵產物或上述菌劑在堆肥中的應用。本發明提供了嗜熱地芽孢桿菌UTM03或其發酵產物或上述菌劑在製備堆肥接種劑中的應用。 本發明還提供了一種汙泥堆肥的方法，包括以下步驟I)發酵菌液的製備取芽孢桿菌菌株UTM03的菌種斜面經活化、擴大培養後,入發酵罐繼續培養，製得；2)原種子堆肥的製備將輔料與汙泥調配後，添加步驟I)製得的發酵菌液，混合均勻，堆肥發酵，得原種子堆肥；3)將步驟2)製得的原種子堆肥與含水率70% -90%的汙泥混合，進行堆肥發酵，得腐熟堆肥，即為一級種子堆肥；4)將一級種子堆肥，按步驟2)代替原種子堆肥進行發酵，得腐熟堆肥，即為二級種子堆肥，如此傳代發酵製備三級種子堆肥和四級汙泥種子堆肥。進一步，步驟I)斜面活化培養的條件為6-12小時，65_70°C ;擴大培養方法與條件搖床振蕩，振蕩頻率100-200rpm，溫度65-75°C，時間1_3天；發酵罐培養，溫度65-70°C，間隔4-12小時攪拌10-30分鐘，攪拌速率100_250rpm，間隔4-12小時通氣10-30分鐘，通氣量I : 0.5-1. 5m3/(V ^m3),發酵時間2-6天；培養液為LB培養基，各級擴培時，其OD6tltl在2-4之間，停止培養。進一步，步驟2)所述輔料為3_5mm長的木屑、稻草和花生殼粉等含水率在20%以下的碳素物料。進一步，步驟2)所述堆體的碳氮比在20-30 I，含水率在50%-65%，按物料總乾重的0. 1%-0. 5%添加發酵菌液，並將輔料、發酵種子液與汙泥混合均勻進行堆肥，堆肥發酵10-15天。進一步，步驟2)、步驟3)所述堆肥是採用條垛式堆肥方式，堆體高I. 2-3m,寬3-6m，長度6-30m，採用強制翻堆的形式進行供氧，期間堆肥間隔2_5天翻堆一次，中心溫度高於75°C時進行翻堆。進一步，步驟3)所述的將原種子堆肥與汙泥混合，堆體含水率在50% -65%,堆肥發酵時間為15-30天。上述步驟3)中，所述腐熟堆肥可作為第I代汙泥種子堆肥，按步驟3)所述進行汙泥堆肥，當第4代汙泥種子堆肥利用完畢時，需重新利用輔料與發酵菌液，再次製備原種子堆肥。本發明還提供了上述汙泥堆肥的方法在汙泥堆肥中的應用。
本發明的優點是提供了一株在70°C下能快速增殖的芽孢桿菌UTM03。本發明還提供了菌株UTM03汙泥堆肥中的應用。利用本發明提供的菌株UTM03進行汙泥堆肥，其優點在於腐熟堆肥可作為原種子堆肥繼續循環使用，降低汙泥堆肥調理劑的使用量，降低堆肥成本，質量穩定，且綠色環保，無汙染，性能優良。原種子堆肥的使用代數控制在4代以內，避免了汙泥堆肥過程中由於鹽分或重金屬濃縮所帶來的次代種子堆肥中鹽度過高，使微生物失活或堆肥產品中因鹽度過高對植物帶來傷害或重金屬超標的問題。可廣泛應用於汙泥堆肥，具有較好的經濟效益和社會效益。
圖I為顯微鏡下嗜熱芽孢桿菌菌株UTM03 (1000X)圖2為本發明菌株UTM03應用於汙泥堆肥的流程示意圖。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I芽孢桿菌UTM03的分離與鑑定在無菌的環境中，稱取5g汙泥堆肥樣品於裝有10粒玻璃珠的50ml無菌水三角瓶中，置於搖床上160r/min振蕩30分鐘，使樣品充分散開，然後放置70°C下，靜置培養12小時。取出以上靜置培養的三角瓶，在無菌的環境中，靜置3分鐘，再用無菌吸管吸取5ml上清液加到裝有50ml已滅菌的細菌培養液中，充分搖勻，放置於70°C下，靜置富集培養48小時，如此，傳代培養4代。細菌液體培養基配方為牛肉膏0. 5g，蛋白腖lg，氯化鈉
0.5g，蒸餾水 100ml, pH7. 2-7. 4，121°C 滅菌 20 分鐘。取出以上培養4代的富集培養三角瓶，用Iml無菌吸管吸取Iml上清液加到裝有9ml無菌水中即得(KT1)稀釋液。依次類推，製得KT1至10_6稀釋液。取6個無菌平皿，用Iml無菌吸管分別吸取以上稀釋液0. 2ml，接入平皿；將已融化並冷卻至50°C左右的細菌培養基倒入無菌培養皿中，每皿約20ml，前後左右輕輕搖動培養皿，使菌液充分混勻，凝固後，在培養皿上作好稀釋度及日期標記.待平板凝固後，將上述平板置於恆溫恆溼培養箱中，在70°C下進行培養24小時。觀察各平板的生長情況，選擇菌落分散較好的平板上挑取菌落形態不同的單菌落進行劃線培養，如此至4代以後，將形態一致的菌落製片，進行簡單染色，在油鏡下觀察菌體形態。多視野下觀察菌體細胞形態，確認菌體形態一致後，用細菌培養基斜面培養至豐厚，於4°C冰箱中保存菌種，備用。細菌固體培養基的成分為在細菌液體培養基中加入瓊脂1.6%，植物凝膠1.0%。以本發明菌株的DNA為模板，PCR擴增其16S rRNA序列，引物為(27f)5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和(1492r):5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反應程序為95°C預變性5分鐘，95°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸90s，30個循環，72°C延伸10分鐘。擴增產物經電泳檢測其純度後測序。擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。獲得的16SrRNA基因序列測序結果在GenBank中進行Blast比對(http://blast,ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，發現與 Bacillus sp. BGSC W9A22 (AY608987. I)同源性最高，把該菌株鑑定為芽孢桿菌屬(Bacillus 8 .)，將其命名為^￥03，並於2011年12月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為芽孢桿菌Bacillussp.，保藏號為 CGMCC No. 5643。實施例2發酵種子液的製備取本發明菌株Bacillus sp. UTM03的斜面在70°C下活化培養8小時，然後接種裝有已滅菌的LB培養液的搖瓶中，置於水浴恆溫振蕩器上進行一級擴培,振蕩頻率160rpm,時間36小時，溫度70°C，經檢測培養液OD6tltl為2. 523 ;取一級培養液在發酵罐內進行擴培，控制溫度65°C，間隔6小時攪拌15分鐘，轉速150rpm，間隔6小時通氣15分鐘，通氣量
I I. 2 (V/V)，發酵時間3天後，檢測發酵液0D_為3. 003，即為發酵種子液。實施例3發酵種子液的製備取本發明菌株Bacillus sp. UTM03的培養斜面在65°C下活化培養12h，然後接種裝有已滅菌的LB培養液的搖瓶中，置於水浴恆溫振蕩器上進行一級擴培，振蕩頻率180rpm,時間36小時，溫度65°C，經檢測培養液0D600為2. 815 ;取一級培養液在發酵罐內進行擴培，控制溫度65 °C，間隔4小時攪拌10分鐘，攪拌速度160rpm，間隔4小時通氣10分鐘，通氣量I : 0.8(V/V)，發酵時間4天後，檢測發酵液0D600為3. 103，即為發酵種子液。實施例4種子堆肥的製備及應用下面以花生殼粉作為輔料，具體說明。首先對脫水汙泥、輔料花生殼粉進行採樣檢測分析，其基本性質見下表I :
權利要求
1.一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株UTM03，其保藏編號為CGMCC No. 5643。
2.含有權利要求I所述芽孢桿菌UTM03的菌劑。
3.權利要求I所述的芽孢桿菌UTM03或其發酵產物或權利要求2所述的菌劑在汙泥堆肥中的應用。
4.權利要求I所述的嗜熱地芽孢桿菌UTM03或其發酵產物或權利要求2所述的菌劑在製備堆肥接種劑中的應用。
5.一種汙泥堆肥方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)發酵菌液的製備取權利要求I所述芽孢桿菌菌株UTM03的菌種斜面經活化、擴大培養後，繼續培養，製得； 2)原種子堆肥的製備將輔料與汙泥調配後，添加步驟I)製得的發酵菌液，混合均勻，堆肥發酵，得原種子堆肥； 3)將步驟2)製得的原種子堆肥與含水率70%-90%的汙泥混合，進行堆肥發酵，得腐熟堆肥，即為一級種子堆肥； 4)將一級種子堆肥，按步驟2)代替原種子堆肥進行發酵，得腐熟堆肥，即為二級種子堆肥，如此傳代發酵製備三級種子堆肥和四級汙泥種子堆肥。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟I)斜面活化培養的條件為6-12小時，65-70°C ;擴大培養方法與條件搖床振蕩，振蕩頻率100-200rpm，溫度65_75°C，時間1-3天；發酵培養，溫度65-70°C，間隔4-12小時攪拌10-30分鐘，攪拌速率100_250rpm，間隔4-12小時通氣10-30分鐘，通氣量I 0. 5-1. 5m3/(V ^m3)，發酵時間2-6天；培養液為LB培養基，各級擴培時，其OD_在2-4之間，停止培養。
7.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)所述輔料為3-5mm長的木屑、稻草和花生殼粉等含水率在20%以下的碳素物料。
8.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)所述堆體的碳氮比在20-30 I，含水率在50% -65%，按物料總乾重的0. I % -0. 5 %添加發酵菌液，並將輔料、發酵種子液與汙泥混合均勻進行堆肥，堆肥發酵10-15天。
9.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)、步驟3)所述堆肥是採用條垛式堆肥方式，堆體高I. 2-3m,寬3-6m，長度6_30m，採用強制翻堆的形式進行供氧，期間堆肥間隔2-5天翻堆一次，中心溫度高於75°C時進行翻堆。
10.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟3)所述的將原種子堆肥與汙泥混合，堆體含水率在50-65%，堆肥發酵時間為15-30天。
全文摘要
本發明提供了一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株UTM03，其保藏編號為CGMCC No.5643。本發明提供的菌株UTM03在70℃下能快速增殖。本發明還提供了菌株UTM03在汙泥堆肥中的應用。利用本發明提供的菌株UTM03製備的種子堆肥及其汙泥堆肥應用方法，可避免了汙泥堆肥中因鹽分或重金屬濃縮，所帶來的使微生物失活或堆肥產品對植物帶來傷害或重金屬超標的問題，可廣泛應用於汙泥堆肥，具有較好的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12R1/07GK102703351SQ20121017764
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年1月21日
發明者劉永躍, 周順桂, 汪湧, 許宜北 申請人:大地綠源環保科技(北京)有限公司