一種新型包載雷公藤甲素和羥基喜樹鹼的多臂聚乙二醇納米藥物的製備方法與流程
2023-05-15 04:54:06
本發明涉及了一種新型包載雷公藤甲素和羥基喜樹鹼的多臂聚乙二醇納米藥物的製備方法，特別是涉及一種利用多臂聚乙二醇與疏水藥物的反應，同另一種疏水藥物自組裝形成納米粒子的方法，屬於先進納米技術和生物製藥領域。
背景技術：
雷公藤甲素（triptolide,tp）是中藥雷公藤（tripterygiumwilfordiihook.f.）中分離出的活性最高的環氧化二萜內酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。由於雷公藤的生理活性強，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤和抗生育作用。但它屬於毒性很強的藥物，臨床不良反應的發生頻率遠高於其它藥物，主要發生在消化系統、泌尿系統、生殖系統、心血管系統、骨髓和血液系統。其中又以消化系統最為常見，主要表現為噁心、嘔吐、腹痛、腹瀉及消化道出血等。因此，研究新型的給藥系統以降低其毒性具有十分重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種新型包載雷公藤甲素和羥基喜樹鹼的多臂聚乙二醇納米藥物的製備方法，該方法具有步驟簡單，成本低，載藥材料無毒，聯合載藥效果好的優點。
本發明的上述目的通過以下技術方案實現：多臂聚乙二醇與雷公藤甲素偶聯，在自組裝過程中包裹另一種抗癌藥物羥基喜樹鹼，形成雙載藥系統的納米粒子膠束。具體步驟如下：
（1）將多臂聚乙二醇分散於吡啶中，濃度為0.01-5毫克/毫升，磁力攪拌10-30分鐘，使其溶解；
（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），激活羧基30分鐘，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶（dmap）；
（3）取適量雷公藤甲素溶於吡啶，並轉移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反應過夜，並連續通入氮氣，去除酯化反應生成的水；
（4）向反應後的混合液中1:3（體積比）的比例加入無水乙醚，出現絮狀沉澱，4000轉離心30分鐘，收集沉澱，繼續用乙醚洗滌沉澱兩次，離心收集固體沉澱；
（5）將上述所得固體沉澱溶於去離子水，用磷酸鹽緩衝溶液透析12小時，並輕微攪拌透析外液，加快透析速度，每隔4小時更換透析外液；
（6）將上述透析物零下80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48小時，得到偶聯物白色粉末；
（7）取上述粉末適量與羥基喜樹鹼共同溶於二甲基亞碸，攪拌均勻，然後緩慢滴入劇烈攪拌的去離子水中，自組裝得到納米粒子，將溶液8000轉離心30分鐘，收集沉澱物，重新分散在去離子水中，透析6小時，透析物零下80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48小時，得到白色粉末，即為多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物。
所述的多臂聚乙二醇可為單臂，四臂或八臂聚乙二醇，可以含不同的官能團，與不同拒水藥物發生反應，且分子量2000~80000之間；
所述的不溶水藥物雷公藤甲素依然適用於含反應功能基團的其它拒水藥物，如熊果酸；
所述的包裹藥物羥基喜樹鹼可以由其它疏水性強的藥物替代，或者納米級金屬，納米級金屬氧化物；
所述的吡啶用四氫呋喃、二甲基亞碸、二氯甲烷替代，其偶聯方法仍然適用；
所述的納米粒子粒徑均一，且在10-100nm。
本發明具有以下優點：
1）本發明的反應機理是通過高分子化合物多臂聚乙二醇的羧基與雷公藤甲素的羥基發生酯化反應，得到多臂聚乙二醇藥物偶聯物。
2）本發明的自組裝過程是通過反應到多臂聚乙二醇上的疏水藥物基團的拒水作用，形成空心內核，多臂聚乙二醇的親水端為外層，疏水藥物羥基喜樹鹼為內核核心，自組裝形成的兩親性納米粒子，納米粒子均一。
3）本發明針對運載兩種疏水藥物的設計，根據兩種疏水藥物的不同作用機制，可實現聯合殺死腫瘤細胞。
4）本發明不需要高溫高壓等耗能設備，亦不需要複雜裝置，所用化學試劑用量少，可回收，工藝簡單，降低生產成本。
附圖說明
圖1為本發明製備多臂聚乙二醇-雷公藤甲素雷公藤甲素的紫外圖。
圖2為本發明製備多臂聚乙二醇-雷公藤甲素雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物的場發射電鏡形貌圖。
圖3為本發明製備多臂聚乙二醇-雷公藤甲素雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物的掃描電鏡形貌圖。
具體實施方式
實施例一
（1）取多臂聚乙二醇1g，分散於20ml吡啶中，磁力攪拌30min，使其溶解；
（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），激活羧基30分鐘，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶（dmap）；
（3）取0.5g雷公藤甲素溶於5ml吡啶，並轉移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反應過夜，並連續通入氮氣，去除酯化反應生成的水；
（4）向反應後的混合液中1:3（v/v）的比例加入無水乙醚，出現絮狀沉澱，4000rpm離心30min，收集沉澱，繼續用乙醚洗滌沉澱兩次，離心收集固體沉澱；
（5）將上述所得固體沉澱溶於去離子水，用磷酸鹽緩衝溶液透析12h，並輕微攪拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更換透析外液；
（6）將上述透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到偶聯物白色粉末；
（7）取上述粉末0.1g與羥基喜樹鹼0.05g共同溶於2ml二甲基亞碸，攪拌均勻，然後緩慢滴入劇烈攪拌的去離子水中，自組裝得到納米粒子，將溶液8000rpm離心30min，收集沉澱物，重新分散在去離子水中，透析6h，透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物。
實施例二
（1）取多臂聚乙二醇0.5g，分散於10ml吡啶中，磁力攪拌20min，使其溶解；
（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），激活羧基30min，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶（dmap）；
（3）取0.1g雷公藤甲素溶於5ml吡啶，並轉移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反應過夜，並連續通入氮氣，去除酯化反應生成的水；
（4）向反應後的混合液中1:3（v/v）的比例加入無水乙醚，出現絮狀沉澱，4000rpm離心30min，收集沉澱，繼續用乙醚洗滌沉澱兩次，離心收集固體沉澱；
（5）將上述所得固體沉澱溶於去離子水，用磷酸鹽緩衝溶液透析12h，並輕微攪拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更換透析外液；
（6）將上述透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到偶聯物白色粉末；
（7）取上述粉末0.01g與羥基喜樹鹼0.005g共同溶於0.5ml二甲基亞碸，攪拌均勻，然後緩慢滴入劇烈攪拌的去離子水中，自組裝得到納米粒子，將溶液8000rpm離心30min，收集沉澱物，重新分散在去離子水中，透析6h，透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物。
實施例三
（1）取多臂聚乙二醇2g，分散於30ml吡啶中，磁力攪拌30min，使其溶解；
（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），激活羧基30min，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶（dmap）；
（3）取0.5g雷公藤甲素溶於5ml吡啶，並轉移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反應過夜，並連續通入氮氣，去除酯化反應生成的水；
（4）向反應後的混合液中1:3（v/v）的比例加入無水乙醚，出現絮狀沉澱，4000rpm離心30min，收集沉澱，繼續用乙醚洗滌沉澱兩次，離心收集固體沉澱；
（5）將上述所得固體沉澱溶於去離子水，用磷酸鹽緩衝溶液透析12h，並輕微攪拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更換透析外液；
（6）將上述透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到偶聯物白色粉末；
（7）取上述粉末0.1g與羥基喜樹鹼0.02g共同溶於二甲基亞碸1.5ml，攪拌均勻，然後緩慢滴入劇烈攪拌的去離子水中，自組裝得到納米粒子，將溶液8000rpm離心30min，收集沉澱物，重新分散在去離子水中，透析6h，透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物。
實施例四
（1）取多臂聚乙二醇1g，分散於20ml吡啶中，磁力攪拌30min，使其溶解；
（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），激活羧基30min，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶（dmap）；
（3）取0.3g雷公藤甲素溶於5ml吡啶，並轉移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反應過夜，並連續通入氮氣，去除酯化反應生成的水；
（4）向反應後的混合液中1:3（v/v）的比例加入無水乙醚，出現絮狀沉澱，4000rpm離心30min，收集沉澱，繼續用乙醚洗滌沉澱兩次，離心收集固體沉澱；
（5）將上述所得固體沉澱溶於去離子水，用磷酸鹽緩衝溶液透析12h，並輕微攪拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更換透析外液；
（6）將上述透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到偶聯物白色粉末；
（7）取上述粉末0.1g與羥基喜樹鹼0.01g共同溶於二甲基亞碸2ml，攪拌均勻，然後緩慢滴入劇烈攪拌的去離子水中，自組裝得到納米粒子，將溶液8000rpm離心30min，收集沉澱物，重新分散在去離子水中，透析6h，透析物-80℃冷凍過夜，並冷凍乾燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羥基喜樹鹼）納米藥物。