槲皮素-7-o-葡萄糖甙在柘木或其製劑質量控制中的應用的製作方法

2023-05-15 04:50:21

專利名稱：：槲皮素-7-o-葡萄糖甙在柘木或其製劑質量控制中的應用的製作方法槲皮素-7-0-葡萄糖甙在柘木或其製劑質量控制中的應用駄鰣本發明涉及一種已知化合物的新用途，具體涉及槲皮素-7-0-葡萄糖甙在柘木或其製劑質量控制中的應用。背暈技術柘木為桑科柘屬植物Cudraniatricuspidata(Carr.)Bun.落葉灌木或小喬木，其功能為清熱涼血，近代民間用於消化道腫瘤。主要化學成分為黃酮類、氧雜蒽酮類、木脂素、香豆素及多糖類化合物，70年代至90年代，國內外學者(中日韓)對柘木抗癌作用進行研究，基本確認黃酮類化合物是柘木抗癌、抑癌有效成分，多糖參與了免疫調節，對抗癌具有協同作用。在國內，有關柘木的藥品開發始於60年代，研發成功的製劑有糖漿劑，該劑型己被收載於部頒藥品標準，經臨床使用，證實柘木糖漿對消化道腫瘤患者化療或放療有輔助治療作用，並能改善病人的生活質量。此外，CN1515294則公開了含柘木的固體製劑及其製備方法。然而，目前柘木製劑的質控體系還不夠完善，檢測指標單一，沒有形成一個更嚴格的質控體系，在這樣的質控體系下，仍然難以保證產品的質量穩定，這與中藥現代化並走向國際的發展方向是不相適應。7-葡萄糖-山奈酚甙(populnin)是目前用於柘木製劑質控的唯一黃酮甙成分，這在專利申請文件CN1515294及CN1726962中均有報導。然而，7-葡萄糖-山奈酚即山柰酚-7_0~葡萄糖甙不僅存在於柘木(Cudraniatricuspidata)中(張月華等，醫藥工業(3):15-20,1980),其它植物中也存在該化合物，如國外木賊屬植物Equiset咖telmateta(K.R.MarkhametalTetrahedron34:1389-1397,1978)、火炭母草葉(polygonumChineseL.)(CA1977，87:180733U)、景天屬植物SedumTerhata(JATRCKJ.CAKUEBruttonia33(4):498-507,1981)、蒙藥廣棗(choerospondiasaxillaris)(鄧麗嘉等中草藥105(3):8-9，1989)、牡丹花(Paeoniasuffrutixosa)(XiaoWANGetalJ.ofchromatogr.A1075(1-2):127-131，2005)、國外大戟科植物Chamaesyceprostrate(RojassetalPlantaMedic65(5):478-478,1999)、國外白花丹科植物Limoniastrummonopetatum(HMRasmanetalPlantaMedica72(10):1055,2006)、國外植物Metamaraetamsubsp.gussonei葉及種子中(F.confatietalphytotherapyResearch18(7):585-587,2004)。歐洲植物資料庫記載(http-//www.liberherhar咖.com)在Althaeaofficinalis的花、Brassicanigra的葉、Centaureacyanus的莖、積血草(Centellaasiatice)的葉、問荊(Equisetumarvense)的莖、銀杏(Ginkgobiloba)的莖、Madicagosative的蓮葉、Macluraurantiaca的葉、Serenoarepensd的花、Thespesiapopulnea的花以及葡萄(Vitisvinifera)葉含有populnin。因此可以認為該成分並非柘木獨有，雖然質控過程中對這個單一成分進行檢測是一種技術進步，但它並非是最為理想的程度，因此繼續尋找其它的檢測指標，探索並建立一種更為科學、合理的藥品質量保障體系仍具有積極的現實意義。槲皮素-7-0-葡萄糖甙早期報導存在於錦葵科植物陸地棉(Gosspiumhirsutura)和棉屬(Gosspi咖)其它種類植物花中(《天然活性成分簡明手冊》孫文基繩金房主編，北京中國醫藥科技出版社，1998，7ISBN7-5067-5)，以後陸續報導，在澳洲栽培的心形益母草(LeonuruscardiacaL.)(kartiigTetalJ.Natprod48:494,1985)、藏藥蒸倒牛(Biebersteiniaheterost簡nMaxim)(張曉峰等藥學學報30(3):211-214，1995)、紅花葉(CarthamustimctriusL)(YaginumaSatoeetalBiosciencebiotechnologyandbiochemistry67(8):1691-1698,2003)、蒲公英(Taraxacummongolic咖)同屬品種TaraxacumofficinaleWEB.exWPGG(KatrinSchutzetalRapidCommunicationinMaxSpectrometry19(2):179-186，2004)、豇豆種皮(Bigussinensis)(QichangetalJ.AgricFoodchem52(22):6694，2004)、夏枯草(Prunellavulgaris)(I.S.DmitruketalChemofNaturalCompounds23(3):374-375,2004)以及日本桃葉珊瑚(Aucubajaponica)(TsukasaIwashinaJ.ofJapaneseBotany72(6):337-346,1997)中也有該成分存在。據歐洲植物資料庫記載(http://www.liberherharum.com),在Artemisiaannua的根莖、Brassicanigra的葉、Centaureac，us的基、Chamomi11arecutita的花、Gossypiumsp的花、paeonialactflora的葉、Pinussilvestris的葉、Salixalba的蓮皮及taraxacumofficinale的花也有槲皮素-7-0-葡萄糖甙成分。本發明人在柘木有效成分分離中獲得了槲皮素-7-0-葡萄糖甙，根據上述文獻的比較分析，植物中除了柘木同時含有山柰酚-7-0-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-葡萄糖武二成分外，至今尚未見其它植物品種同時含有上述二成分的報導，對此發明人認為若能在柘木及其製劑質控中同時檢測上述二成分，不僅能顯著提高質控項目專屬性，而且擴大了有效成分控制數量，有利於進一步完善柘木及其製劑的質量控制體系。基於上述設想，發明人通過研究，建立了槲皮素-7-0-葡萄糖甙和山柰酚-7-O"葡萄糖甙作為柘木製劑質控指標的方法。
發明內容本發明的目的是公開槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的新用途，即在柘木或柘木製劑質量控制中的應用。本發明的另一目的是公開一種柘木或柘木製劑的質量控制方法。本發明第一方面，公開了槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙在柘木或拓木製劑質量控制中的應用。發明人在柘木水溶性成分分離中獲得了槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙單體。關於槲皮素和山奈酚以及它們的糖甙化合物，國際上普遍認為具有抗氧化、抗炎、抗心血管疾病以及抗癌等生理活性(ElliottMiddletonetalPharmacologicalReviews52(4):673-751，2002)，這些功效成分也與柘木的功效相符，因此發明人認為，槲皮素-7-0-D-葡萄糖甙完全符合作為柘木或柘木製劑的質控指標的要求，可以用於柘木或柘木製劑的質量控制。同時，與山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙指標成分相結合，該質控方法不僅提高了項目的專屬性，而且擴大了有效成分控制數量，有利於完善柘木及其製劑質控體系。發明人經大量研究，給出了從柘木中分離槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙的方法，並建立了如何將槲皮素-7-0"e-d-葡萄糖甙用作柘木或柘木製劑的質控指標的具體方法，包括槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙的鑑別及定量，這部分內容在發明人公開的柘木或柘木製劑的質量控制方法中有詳細的闡述。本發明第二方面，公開了一種柘木或柘木製劑的質量控制方法，包括檢測槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙的含量。較佳的，槲皮素-7-0-e_d-葡萄糖甙的含量測定方法為hplc法。更佳的，質量控制過程還包括檢測總黃酮的含量及山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙的含量。較優的，總黃酮含量以山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙為對照，採用UV法定量測定，山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙含量以HPLC法測定。優選的，質控過程還包括用TCL法鑑別槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙和山奈酚-7-0-3-D-葡萄糖甙。上述HPLC法測定槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的操作步驟按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)進行測定(1)色譜條件與系統適應性試驗填充劑為十八烷基矽垸基合矽膠，流動相為體積比為38:62的甲醇-水溶液或甲醇一體積百分比0.3%的醋酸水溶液或甲醇一體積百分比0.1%的三氟乙酸水溶液，檢測波長為257nm，理論板數按槲皮素-7-0~P-D-葡萄糖甙計算，應不低於1000;(2)配置槲皮素-7-O-D-葡萄糖甙對照品溶液；(3)供試樣品溶液製備精密稱取或量取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理，先用大孔樹脂柱純化處理，再經微孔濾膜過濾獲得；(4)測定法分別精密精密吸取對照品溶液與供試樣品溶液5-15n1，注入液相色譜儀，測定，即得。實施例中，優選了下述方案a)色譜條件與系統適應性試驗用十八烷基矽烷基合矽膠為填充劑；甲醇-水(或0.3%醋酸水或0.1%三氟乙酸水)(38:62)(v:v)為流動相；檢測波長為257nm，理論板數按槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙計算，應不低於1000。b)對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷減壓乾燥至恆重的槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙對照品適量，加甲醇製成每ml含50iig的溶液，即得。c)供試品溶液製備(1)柘木取本品粉末約0.5g,精密稱定，置錐形瓶中，加入60%乙醇(v%)50ml，加熱回流4小時，過濾，濾液濃縮至約10ml，加於大孔樹脂柱(0.8cmxl0cm,用適量水預洗)上,用水50ml洗脫，棄去水液，再用甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，至50ml量瓶中，並稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45&m)濾過，即得。(2)提取物或製劑取本品適量，研細，取約50-100mg，精密稱定，用水10ral超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30分鐘使溶解，加於大孔樹脂柱(0.8cmxl0cm，用適量水預洗)上，用水50ml洗脫，棄去水液，再用甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，至50ml量瓶中，並稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。d)測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5-15nl，注入液相色譜儀，測定，即得。上述UV法的操作步驟為(1)配置山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙對照品溶液；(2)製備標準曲線；(3)供試樣品溶液製備精密稱取或量取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理製成樣品；(4)測定法在樣品溶液加AlCl3及醋酸鉀溶液前後，分別用分光光度計測定408nm波長處的吸收度，以兩者吸收度的差值從標準曲線上讀出供試品溶液中山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙的重量，計算，即得。實施例中，優選了下述方案a)對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷減壓千燥至恆重的山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙對照品4mg,置100ml量瓶中，加60%乙醇適量使溶解，並稀釋至刻度，搖勻，即得(每lml中含無水山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙40yg)。b)標準曲線的製備精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分別置10ml量瓶中，各加O.lmol/L三氯化鋁溶液2ml,1mol/L醋酸鉀溶液3ml,加60%乙醇至刻度，搖勻，放置10分鐘；另取0.1mol/L三氯化鋁溶液2ml，lmol/L醋酸鉀溶液3ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置10分鐘，作為空白。照分光光度法(中國藥典2005年一部附錄VB)，在408nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。c)測定法(1)柘木取本品粉末約O.5g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入6Cm乙醇50ml，稱定重量，置水浴回流提取4小時，防冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，棄取初濾液，精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定吸收度(Al);另精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，照標準曲線製備項下的方法，自"加O.lmol/L三氯化鋁溶液"起，依法測定吸收度(A2)，以兩者吸收度的差值從標準曲線上讀出供試品溶液中山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的重量(yg)，計算，即得。本品柘木含總黃酮以山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙(C21H2。0u)計，不得少於0.16%。(2)提取物或製劑取本品適量，研細，取約50-100mg,精密稱定，置50ml量瓶中，加入60%乙醇40ml，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30分鐘使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勾，測定吸收度(A,);另精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，照標準曲線製備項下的方法，自"加0.1mol/L三氯化鋁溶液"起，依法測定吸收度(A2)，以兩者吸收度的差值從標準曲線上讀出供試品溶液中山奈酚-7-o~e-D-葡萄糖甙的重量(ug)，計算，即得。上述HPIX法測定山奈酚-7-0-P-D-葡萄糖甙的操作步驟按照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)進行測定(O色譜條件與系統適應性試驗填充劑為十八垸基矽烷基合矽膠，流動相為體積比44:56的甲醇-水溶液或甲醇一O.3%的醋酸水溶液或甲醇一0.1%的三氟乙酸水溶液檢測波長為265nm，理論板數按山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙計算，應不低於1000;(2)配置山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙對照品溶液；(3)供試樣品製備精密稱取或量取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理，先用大孔樹脂柱純化處理，再經微孔濾膜過濾獲得；(4)測定法分別精密吸取對照品溶液與供試樣品溶液5-15ii1，注入液相色譜儀，測定，即得。實施例中，優選了下述方案a)色譜條件與系統適應性試驗用十八烷基矽垸基合矽膠為填充劑；甲醇-水(或0.3%醋酸水或0.1%三氟乙酸水)(44:56)(v:v)為流動相；檢測波長為265nm,理論板數按山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙計算，應不低於1000。b)對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷減壓乾燥至恆重的山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙對照品適量，加甲醇製成每ml含40ug的溶液，即得。c)供試品溶液製備(1)柘木取本品粉末約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，加入60%乙醇50ml，加熱回流4小時，過濾，濾液濃縮至幹，殘渣加甲醇40ml超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30分鐘，溶解後轉移至50ml量瓶中，放冷，並稀釋至刻度，搖勻，用徼孔濾膜(0.45Pm)濾過，即得。(2)提取物或製劑取本品適量，研細，取約50-100mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加入甲醇40ral，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30分鐘使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。d)測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5-15nl，注入液相色譜儀，測定，即得。上述的TCL法的操作步驟為(1)取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理後，製成供試品溶液；(2)分別配置山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-0-D-葡萄糖甙的對照品溶液；(3)照薄層色譜法吸取上述溶液各5-10lil，分別點樣於同一矽膠G薄層板上，以體積比為5:3:3:1乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水的溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈下，檢視供試品色譜中是否在與對照品色譜的位置上，顯相同的黃綠色螢光斑點。實施例中，優選了下述方案(1)取柘木(0.5g)或提取物或製劑(50-lOOrag)粉末，加甲醇5ml，柘木樣品超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30分鐘，提取物或製劑樣品超聲處理(功率250W，頻率50kHz)IO分鐘，濾過，濾液置水浴上濃縮至約lml，作為供試品溶液；(2)另分別取山奈酚-7-o~e-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙對照品，加甲醇各製成每lml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液；(3)照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各5-10"1,分別點樣於同一矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:3:1)(體積比)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜的位置上，顯相同的黃綠色螢光斑點。本發明的第三方面，公開了從柘木中分離槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的方法，包括下列步驟(1)取經水或稀醇提取的柘木提取濃縮液，過大孔樹脂柱；(2)經水洗脫後，以體積比為30%95%的乙醇溶液梯度洗脫；(3)收集30%50%乙醇流份，濃縮後，過矽膠柱，以體積比為030:10070的甲醇-乙酸乙酯溶液為洗脫劑，梯度洗脫，以TLC法為檢測手段，收集含有槲皮素-7-0~P-D-葡萄糖甙成分的流份；(4)濃縮、乾燥步驟(3)獲得的流份，用少量甲醇溶解，用凝膠柱分離，用甲醇作為洗脫液，以TLC法為檢測手段，收集含有槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙成分的流份；(5)經反相製備液相分離精製，經反相矽膠柱先出樣的成分即為槲皮素-7-0"0-d-葡萄糖甙。實施例中，優選了下述方案(1)經水或稀醇提取的柘木提取濃縮液，過大孔樹脂柱；(2)水充分洗脫後，以30%95%乙醇(v%)溶液梯度洗脫；(3)收集30%50%乙醇流份，濃縮，加適量矽膠，混和、乾燥、粉碎，置矽膠柱頂，以甲醇-乙酸乙酯(030:10070)(體積比)為洗脫劑，梯度洗脫，以TLC法為檢測手段，收集含有槲皮素-7-o~e-d-葡萄糖甙成分的流份；\(4)濃縮、乾燥上述流份，用少量甲醇溶解，置凝膠柱(S印hadexLH-20)上進一步分離，用甲醇作為洗脫液，仍以TLC法為檢測手段，收集含有槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙成分的流份；(5)部分濃縮上述流份，進樣至填有反相矽膠(RP-18)的製備液相色譜儀，流動相為甲醇-水(40:60)，先出樣的流份為槲皮素-7-0-0-D-葡萄糖武，該流份放置過夜，有淡黃色針狀結晶析出，過濾，乾燥結晶體，即得；後出樣的是山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙。上述方法可用於製備質控中使用的槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙對照品，並且用該方法獲得的槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙純度超過98%(HPLC歸一法)。本發明的優點在於提供了一個用於柘木或柘木製劑質量控制的全新指標一槲皮素-7-0-葡萄糖甙，至目前為止，存在槲皮素-7-0-葡萄糖甙的植物中均未報導發現存在山柰酚-7-0-葡萄糖甙，而柘木中恰恰同時存在這兩種物質，槲皮素-7-0-葡萄糖甙與山柰鼢-7-0~葡萄糖甙相結合不僅可以凸現柘木或柘木製劑測試的專屬性和特異性，而且又擴大的單一有效成分數量控制，彌補了柘木製劑質控指標單一的缺陷，完善了柘木製劑的質控體系。圖l槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙化學結構式圖2山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙化學結構式具體實施例方式本發明中，"柘木製劑"包括柘木液體製劑及固體製劑，上述液體製劑不僅包括柘木糖漿、柘木注射液等液體形式的成品製劑，還包括柘木提取物、柘木流浸膏等半成品製劑；固體製劑包括顆粒劑、片劑、膠囊劑、幹糖漿劑等固體形式的成品製劑，還包括柘木幹浸裔粉等半成品製劑。柘木提取物、柘木浸膏的製備方法在專利CN1515294中獲得公開，柘木顆粒劑、片劑、膠囊劑、幹糖漿劑的製備方法在專利CN1515294及CN1726962中均有公開，柘木糖漿、柘木注射液的製備方法在CN1726962中獲得公開。本發明中，"槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙"的結構式參見圖l。本發明中，"山奈酚-7-o~e-D-葡萄糖甙"的結構式參見圖2。下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如《中國藥典》2005版中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。實施例1柘木幹浸膏粉的製備100kg柘木小塊，加水7倍，提取4小時，放出藥液，進行第二次提取，加水5倍，提取時間3小時，合併提取液，減壓濃縮至相對密度1.07(80'C),噴霧乾燥，得幹浸裔粉5kg。實施例2柘木部位提取物的幹浸裔粉製備100kg柘木小塊，加60%乙醇500kg,提取3小時，放出藥液，進行第二次提取，加60%乙醇400kg，提取時間2小時，合併提取液，減壓濃縮至藥液無醇味，過一填有中性大孔樹脂柱，然後用純淨水、20%、40%、60%、80乙醇，收集60—80%乙醇洗脫液並濃縮乾燥，得部位提取幹浸膏粉1.5kg。實施例3柘木顆粒劑的製備取實施例1製得的浸膏粉與乳糖按2:1比例混合，制粒，得到黃棕色顆粒。實施例4柘木幹糖漿的製備100kg柘木小塊，加30%乙醇6倍，提取3小時，放出藥液，進行第二次提取，加同濃度的乙醇5倍，提取時間3小時，合併提取液，減壓濃縮至相對密度1.07(80r)，噴霧乾燥，得幹浸膏粉4.5kg。取上述稀醇總提取的浸膏粉與輔料按l:l比例充分混合，製成幹糖漿劑。輔料由糖粉、乳糖、可溶性澱粉和CMC(4:3:2:1)組成。實施例5柘木片的製備取實施例2製得的幹浸膏粉(黃酮含量18%)45%，加微晶纖維素35%，低取代徑丙纖維素8%，澱粉8%，混合制粒，內加微粉矽膠、硬脂酸鎂各0.5%,壓片，薄膜包衣3%,片重0.5g。實施例6柘木膠襄的製備取實施例2製得的浸裔粉(總黃酮含量18%)60%，糊精20%、澱粉10%,混合，另取10%量澱粉製漿，用於溼法制粒，乾燥後裝填膠囊，粒重0.4，每粒含總黃酮4(kg,其中populnin4mg，槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙3.5mg。實施例7槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙與山奈酚-7-0"e-D"葡萄糖甙的分離和鑑別取經水或稀醇提取的柘木提取濃縮液，直接過一己經水相處理的大孔樹脂柱，經水充分洗脫乾淨後，以30%95%乙醇溶液梯度洗脫，對收集的30%50%乙醇流份部分，經濃縮後，上一矽膠柱，以乙酸乙酯-甲醇(030%甲醇)梯度洗脫，洗脫液以TLC法為檢測手段，矽膠TLC檢測的展開條件乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:0.5:0.5)，顯色條件噴灑A1C13乙醇液，薄板揮幹後在365nra螢光下檢視欲分離成分是否在與槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙或山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙對照色譜相同的位置上，顯有相同黃綠螢光斑點，有則確認為含槲皮素-7-0-e-0-葡萄糖甙或山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙的流份。分別合併含山奈酚-7-0-0-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-e-d-葡萄糖甙的流份，富含山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖武和槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的流份分別濃縮後，以甲醇作洗脫液，多次過凝膠柱分離，收集欲分離的山奈酚-7-0"e-0-葡萄糖甙和槲皮素-7-0~e-d-葡萄糖甙。得到的山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙粗品分別經反相製備液相進一步純化分離，精製後二個的對照品純度達到98%(HPLC歸一法)。山奈酚-7-0-P-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0~&-D-葡萄糖甙化學結構經UV、EI-MS、ESI-MS、H-隨R及C-NMR光譜分析研究加以確認。鑑定經分離的山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙淡黃色粉末(MeOH)，mp.259261'C(未校正)，紫外吸收入max(MeOH):252、265和369nm。質譜EIM/Z286(強峰，甙元離子峰)，448(微弱，分子離子峰)，ESI(M-1)/Z447.2(最強峰)，(M+l)/Z449.0(最強峰)，理論分子量448.37。核磁共振1H-隨(DMS0-d6)S(ppm):5.11(1H,甙鍵上質子)、6.38(1H'd,C6—H)、6.77(1H，d,C8-H)、6.90(2H，d,C3，—H,C5,—H)、8.04(2H,d，C2，-H,C6，—H)、9.53(1H，C3-0H)、10.13(1H,C4,-0H)、12.45(1H，C5-0H);13C-簡R(DMS0-d6)S(ppm)數據見表l。紫外吸收、質譜以及氫、碳核磁共振數據與山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙文獻值(張月華，任婉薇，萬樹文等.柘木化學成分研究[J].醫藥工業(3):15，1980)均對應吻合，其中碳譜的數據與文獻值高度一致(K.R.Markham，B.Ternal,R.Stanley,H.GeigerandT.J,MabryCARBON-13NMRSTUDIESOFFLAV0N0IDS-III[J].Tetrahedron.1978,34:1389-1397)。山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的結構見圖2。經分離的槲皮素-7-0-e-d-葡萄糖甙淡黃色粉末(Me0H),卿.219223'C(未校正)，紫外吸收入max(MeOH):208、257和375nm。質譜ESI(M-1)/Z463.24(最強峰)，理論分子量464.37。核磁共振1H-NMR(固-d6)S(卯m):5.15(1H，d,甙鍵上質子)、6.41(1H,d，C6-H)、6.76(1H,d,C8—H)、6.91(1H,d，C5,-H)、7.55(1H,dd,C2，-H)、7.71(1H,d，C6,-H)、9.10(3H,m，C3、C3，、C4，-0H)、12.47(1H，s,C5-0H);13C-NMR(DMS0-d6)S(ppm)數據見表1。質譜以及氫、碳核磁共振數據與槲皮素-7-0"P-D-葡萄糖甙文獻值(張曉峰，胡伯林，周丙南.藏藥燻倒牛的活性物質研究[J].藥學學報。1995，30(3):211-214)均對應吻合。碳譜的測定數據與文獻(K.R.Markham,B.Ternal,R.Stanley,H.GeigerandT.J.MabryCARBON-13NMRSTUDIESOFFLAVONOIDS-III[J].Tetrahedron.1978，34:1389-1397)高度一致。槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙的結構見圖1。表l.化合物I(山奈酚-7-(hP-D-葡萄糖甙)和II(槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙)l3C-NMR測定的化學位移數據(ppm)tableseeoriginaldocumentpage14經上述試驗確認從柘木中分離獲得的化合物分別是山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙，純度達98%。實施例8柘木或柘木製劑TLC鑑別試驗取柘木粉末0.5g，加甲醇5ml，超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30分鐘；取適量提取物以及實施例16製備的柘木製劑樣品，加甲醇5ml，分別超聲處理10分鐘。上述各溶液分別濾過，濾液置水浴上濃縮至約lml，作為供試品溶液。另取實施例7獲得的山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0"e-D-葡萄糖甙，分別用甲醇溶解(0.2mg/ml)，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液5ul和對照溶液5ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:3:1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴灑AlCl3乙醇液，置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜的位置上，所有供試品均顯相同黃綠螢光斑點。實施例9柘木或柘木製劑中總黃醑、山奈酚-7"0-e-D"葡萄糖甙和槲皮素-7-0"e-D-葡萄糖甙含jt檢鍘1.總黃酮測定1.1對照品溶液的製備精密稱取實施例7獲得的山奈酚-7-0-P葡萄糖甙(populnin)對照品4mg，置100ml量瓶中，加60%乙醇適量使溶解，並稀釋至刻度，搖勻，即得(每lml中含無水p叩ulnin40Pg)。1.2標準曲線的製備精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分別置10ml量瓶中，各加0.1mol/L三氯化鋁2ml，1mol/L醋酸鉀溶液3ml,加60%乙醇至刻度，搖勻，靜置10分鐘，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VB)試驗，以相應的試液做空白，在408nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。結果表明楊屬苷對照品在0.02360.1892mg範圍內線性關係良好，其回歸方程為C=0.272A+0.000478,r=0.99991.3精密度試驗取同一對照品溶液，按標準曲線製備項下方法連續測定5次，吸收度平均值為0.324，RSD值為0.35W，表明精密度良好。1.4重複性試驗精密稱取同批樣品5份，按樣品測定項下方法操作，測定總黃酮含量，平均含量為l.Ol%，RSD值為0.06劣，表明重複性良好。1.5樣品溶液穩定性試驗同一樣品溶液，每隔10分鐘測定吸收度。結果顯示，樣品溶液在30分鐘內吸收度基本穩定，故操作時間宜控制在30分鐘以內。1.6加樣回收率試驗取己知含量的樣品6份，定量加入對照品，按樣品測定項下方法操作，測定總黃酮量，計算回收率，結果見表2.表2.加樣回收率實驗結果序號原有量加入量測得值回收率平均回收RSD(mg)(mg)(mg)(%)率(%)(%)10.25600.29550.5639104.2020.25600.29550.5661104.9530.25600.39400.6613102.87102.961.9240.25600.39400.6591102.3150.25600.39400.647799.4260.25600.39400.6659104.041.7樣品測定(1)柘木取本品粉末約0.5g,精密稱定，置具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇50ml，稱定重量，置水浴回流提取4小時，防冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，棄取初濾液，精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定吸收度(Al);另精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，照標準曲線製備項下的方法，自"加0.1mol/L三氯化鋁溶液"起，依法測定吸收度(A2)，以兩者吸收度的差值從標準曲線上讀出供試品溶液中山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的重量(tig)，計算，即得。結果見表3.。表3.柘木藥材總黃酮含量測定數據批號050918051005051107黃酮含量(％)0.2190.2240.237平均含量(％)0.227經過三批藥材的測定，其平均總黃酮含量為0.227%，現暫擬以其平均含量的70%計，制訂含量限度，本品柘木含總黃酮以山奈酚-7-0-D-葡萄糖甙(C21H20011)計，不得少於0.16%。(2)提取物或製劑分別取實施例16樣品適量，研細，取約50-100mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加入60。/。乙醇40ml，超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30分鐘使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定吸收度(A!);另精密量取續濾液3ml，置10ml量瓶中，照標準曲線製備項下的方法，自"加0.1mol/L三氯化鋁溶液"起，依法測定吸收度(A2)，以兩者吸收度的差值從標準曲線上讀出供試品溶液中山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙的重量(ttg)，計算，即得。結果見表4.。表4.柘木提取物或製劑總黃酮含量測定數據tableseeoriginaldocumentpage162.山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-0-D-葡萄糖甙含量檢測2.1山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適應性試驗用十八烷基矽烷基合矽膠為填充劑甲醇-0.3%醋酸水(44:56)(v:v)為流動相；檢測波長為265nm，理論板數按山奈酚-7-0"P-D-葡萄糖甙計算，應不低於iooo。對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷減壓乾燥至恆重的山奈酚-7-0-D-葡萄糖甙對照品適量，加甲醇製成每ml含40ug的溶液，即得。供試品溶液製備(1)柘木取本品粉末約0.5g,精密稱定，置錐形瓶中,加入60%乙醇50ml，加熱回流4小時，過濾，濾液濃縮至幹，殘渣加甲醇40ral超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30分鐘，溶解後轉移至50ral量瓶中，放冷，並稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得。(2)提取物或製劑取本品適量，研細，取約50-100mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加入甲醇40ml，超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30分鐘使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45"m)濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液lOnl,注入液相色譜儀，測定，即得。2.2槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適應性試驗用十八烷基矽垸基合矽膠為填充劑；甲醇_0.3%醋酸水(38:62)(v:v)為流動相；檢測波長為257咖，理論板數按槲皮素-7-0~P-D-葡萄糖甙計算，應不低於IOOO。對照品溶液的製備精密稱取經五氧化二磷減壓乾燥至恆重的槲皮素-7-o~e-D-葡萄糖甙對照品適量，加甲醇製成每ml含50wg的溶液，即得。供試品溶液製備(1)柘木取本品粉末約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中,加入6096乙醇50ml，加熱回流4小時，過濾，濾液濃縮至約10ml，加於大孔樹脂柱(0.8cmX10cm，用適量水預洗)上,用水50ml洗脫，棄去水液，再用甲醇40ml洗脫，收集洗脫液,至50ml量瓶中，並稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。(2)提取物或製劑取本品適量，研細，取約50-100mg，精密稱定，用水l(kl超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30分鐘使溶解，加於大孔樹脂柱(0.8cmxl0cm,用適量水預洗)上，用水50ml洗脫，棄去水液，再用甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，至50ral量瓶中，並稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液IOPI,注入液相色譜儀，測定，即得。測試結果見表5.。表5.柘木或提取物或製劑中山奈酚和槲皮素的糖甙含量數據tableseeoriginaldocumentpage18實驗結果顯示，回流提取時間為4或5小時，積分面積值相差無幾，故選用4小時回流提取方案。3)提取物或製劑超聲提取時間選擇取柘木提取物100mg,4份，精密稱定，分別置錐形瓶中，加甲醇50ml，再稱定重量，同時置於超聲儀(功率250W，頻率50kHz)水浴中進行超聲提取，分別在10、20、30和40分鐘後取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，作為供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10lU，注入液相色譜儀，測定山奈酚-7-0-P-D-葡萄糖甙的積分面積。分析柱用十八垸基矽烷基合矽膠為填充劑；甲醇-水(44:56)(v:v)為流動相；檢測波長為265nm,測定結果見表8.。表8.不同時間超聲提取的樣品積分面積測定complextableseeoriginaldocumentpage19實驗結果顯示，超聲提取時間為30或40分鐘，積分面積值相差無幾，故選用30分鐘超聲提取方案。有關hplc測定山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙含量的線性關係、精密度、重複性、穩定性均符合分析要求，加樣回收率分別為99.76%和98.24%。實施例10穩定性試驗對於經實施例8和實施例9檢測合格的柘木顆粒劑樣品，我們進行了加速穩定性研究，試驗條件為溫度37'C，相對溼度75%，放置三個月，在0月、l月、2月、3月分別檢查顆粒水分、顆粒粒度、溶化性、衛生學指標，實施了TLC鑑別，黃酮的含量測定。在試驗期間，檢査項目均符合現行版《中國藥典》的要求，鑑別試驗和含量測定值無顯著性變化。實施例11毒理學研究對於實施例l的樣品，進行了最大給藥量測定提取物灌胃給小鼠7、14、28g/kg,其最高劑量相當生藥510g/kg,為臨床使用劑量的101倍，結果動物無一死亡，亦未發現明顯的毒副反應。結論柘木提取物灌胃對小鼠的最大給藥量為28g/kg。實施例12藥效試驗對於實施例l的樣品，進行了藥效學試驗1.柘木提取物體外抗腫瘤活性試驗(1〉對人HCT-116腸癌細胞生長活性的影響柘木提取物對人HCT-116腸癌細胞的生長活性具有明顯的抑制作用。其中，實施例1樣品最小抑瘤濃度為2.5X10、/ml;乙醇(60%)提取物最小抑瘤濃度為6.3X10—5g/ml。見表9。表9.對人HCT-116腫瘤細胞生長的抑制率(％)tableseeoriginaldocumentpage20(2)對人SGC-7901胃癌細胞生長活性的影響實施例1樣品和柘木醇提物對人SGC-7901胃癌細胞的生長活性具有明顯的抑制作用，其最小抑瘤濃度均為2.5X1(Tg/ml。見表IO。表10.對人HCT-116腫瘤細胞生長的抑制率(％)tableseeoriginaldocumentpage20實施例1樣品和乙醇提取物體外給藥，對人HCT-116腸癌細胞或人SGC-7901胃癌細胞均有不同程度的直接抑制作用。2.抗胃癌作用試驗灌胃給實施例1樣品2.6、5.2g/kg，皮下注射氟尿嘧啶注射液100mg/kg，對裸小鼠所荷SGC-7901癌細胞的生長活性均有顯著的抑制作用(P〈0.01或P<0.05)，其抑瘤率分別為47.9%、32.2%、75.6%。見表ll。表11.實施例1樣品對SGC-7901癌細胞株的抑制作用(X±SD)tableseeoriginaldocumentpage20氟尿嘧啶0.1X460.276±0.139**-75.6模型對照61.133±0.198*P〈0.05，**P<0.05,與模型對照比實施例1樣品口服給藥，對人SGC-7901胃癌有抑制作用。3.實施例1樣品對5-TH3受體結合的抑制試驗表12.實施例1樣品對5-HT3受體「H]GR65630結合的抑制率(％)tableseeoriginaldocumentpage21實施例1樣品在濃度為lmg/ml時特異性結合的抑制率為34.0±4.0(%)，因此對5-HT3受體，H]GR65630結合有一定的抑制作用。顯示其有一定的對抗腫瘤化療時嘔吐的作用。4.免疫活性試驗(1)對碳粒廓清能力的影響灌胃給實施例1樣品0.83g/kg、人參提取物0.16g/kg，每日1次，連續7日，小鼠吞噬指數K值和校正吞噬活性a值均有升高，與空白對照比差異顯著(P<0.05))。見表13。表13實施例l樣品對小鼠碳粒廓清能力的影響tableseeoriginaldocumentpage21*P〈0.05'與空白對照比(2)對巨噬細胞吞噬能力的影響灌胃給實施例1樣品0.28、0.83g/kg、人參提取物0.16g/kg，每日1次，連續7日，小鼠對雞紅細胞的吞噬百分率或吞噬指數均有明顯的提高，與空白對照比，差異顯著或非常顯著(P〈0.05或P<0.01)。見表14。表14實施例l樣品對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響tableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22*P〈0.05'**P〈0.Q1，與空白對照比灌胃給實施例l樣品0.83g/kg，每日1次，連續7日，能顯著提高小鼠對碳痢廓清的能力；灌胃給實施例l樣品0.28、0.83g/kg，每日1次，連續7日，能明顯提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。上述試驗表明用本發明的質控方法進行質控生產合格的製劑質量穩定，活性成分含量可控，抗腫瘤效果顯著，完全符合製劑的要求。權利要求1、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙在柘木或柘木製劑質量控制中的應用。2、一種柘木或柘木製劑的質量控制方法，包括檢測槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙的含量。3、如權利要求2所述的質量控制方法，其特徵在於，所述槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的含量測定方法為HPLC法。4、如權利要求3所述的質量控制方法，其特徵在於，所述HPLC法為(1)色譜條件與系統適應性試驗填充劑為十八烷基矽烷基合矽膠，流動相為體積比為38:62的甲醇-水溶液或甲醇一0.3%的醋酸水溶液或甲醇一0.1%的三氟乙酸水溶液，檢測波長為257mn，理論板數按槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙計算，應不低於1000;(2)配置槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙對照品溶液；(3)供試樣品溶液製備精密稱取或量取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理，先用大孔樹脂柱純化處理，再經微孔濾膜過濾獲得；(4)測定法分別精密吸取對照品溶液與供試樣品溶液5-15ix1，注入液相色譜儀，測定，即得。5、如權利要求2至4中任一權利要求所述的質量控制方法，其特徵在於，質量控制過程還包括檢測總黃酮的含量以及山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙的含量。6、如權利要求5所述的質量控制方法，其特徵在於，所述總黃酮含量以山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙為對照，採用UV法定量測定，所述山奈酚-7-0-D-葡萄糖甙含量以HPLC法測定。7、如權利要求6所述的質量控制方法，其特徵在於，所述UV法為(1)配置山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙對照品溶液；(2)製備標準曲線；(3)供試樣品溶液製備精密稱取或量取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理製成樣品；(4)測定法在樣品溶液加AlCl3及醋酸鉀溶液前後，分別用分光光度計測定408nm波長處的吸收度，以兩者吸收度的差值從標準曲線上讀出供試品溶液中山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的重量，計算，即得。8、如權利要求6所述的質量控制方法，其特徵在於，所述HPLC法為(l)色譜條件與系統適應性試驗填充劑為十八烷基矽烷基合矽膠，流動相為體積比44:56的甲醇-水溶液或甲醇一O.3%的醋酸水溶液或甲醇一0.1%的三氟乙酸水溶液，檢測波長為265nm，理論板數按山奈酚-7-0-e_D-葡萄糖甙計算，應不低於1000;(2)配置山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙對照品溶液；(3)供試樣品製備精密稱取或量取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理，先用大孔樹脂柱純化處理，再經微孔濾膜過濾獲得；(4)測定法分別精密吸取對照品溶液與供試樣品溶液5-15nl，注入液相色譜儀，測定，即得。9、如權利要求2、3、4、6、7、8中任一權利要求所述的方法，其特徵在於，質控過程還包括用TCL法鑑別槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙和山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙。10、如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的TCL法為(1)取適量柘木粉末或提取物或製劑，經常規提取或溶解處理後，製成供試品溶液；(2)分別配置山奈酚-7-o~e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙的對照品溶液；(3)照薄層色譜法吸取上述溶液各5-10nl，分別點樣於同一矽膠G薄層板上，以體積比為5:3:3:1乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水的溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈下，檢視供試品色譜中是否在與對照品色譜的位置上，顯相同的黃綠色螢光斑點。11、柘木中分離槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的方法，包括下列步驟(1)取經水或稀醇提取的柘木提取濃縮液，過大孔樹脂柱；(2)經水洗脫後，以體積比為30%95%的乙醇溶液梯度洗脫；(3)收集30%50%乙醇流份，濃縮後，過矽膠柱，以體積比為030:10070的甲醇-乙酸乙酯溶液為洗脫劑，梯度洗脫，以TLC法為檢測手段，收集含有槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙成分的流份；(4)濃縮、乾燥步驟(3)獲得的流份，用少量甲醇溶解，用凝膠柱分離，用甲醇作為洗脫液，以TLC法為檢測手段，收集含有槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙成分的流份;(5)經反相製備液相分離精製，經反相矽膠柱先出樣的成分即為槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙。全文摘要本發明涉及槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙的新用途，公開了槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙在柘木或柘木製劑質量控制中的應用。同時，本發明還公開了新的柘木或柘木製劑質量控制方法，包括檢測槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙的含量。本發明的公開，提供了一個用於柘木或柘木製劑質量控制的全新指標-槲皮素-7-O-葡萄糖甙，很好地彌補了柘木製劑質控指標單一的缺陷，完善了柘木製劑的質控體系。文檔編號A61K36/60GK101176755SQ20061011815公開日2008年5月14日申請日期2006年11月9日優先權日2006年11月9日發明者華菊根,張園明,徐曉英,袁華梁,謝家駿申請人:上海市中藥研究所;上海雷允上科技發展有限公司