使用光尋址電位計傳感器測量細胞活性的二維傳感器的製作方法
2023-05-15 19:19:36 1
專利名稱：使用光尋址電位計傳感器測量細胞活性的二維傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種二維傳感器及使用該傳感器測量細胞活性用的測量系統。
人們正在廣泛地進行對於神經細胞的醫學研究及關於利用神經細胞作為電器件的可能性的研究。當神經細胞被刺激時，就會產生某種電位。首先，由於陰離子透明度的變化，細胞內側與外側的陰離子密度發生變化，然後，細胞膜的電位發生變化。因此，測量細胞膜的電位的二維分布，對於觀察樣品細胞或機體是有用的。測量電位的二維分布提供了一種確定活性部分及活性水平的方法。
本發明人研製出一種作為二維傳感器的集成組合電極，不必將玻璃探針或其他刺激探針插入細胞，即可同時在多個點上測量細胞的電位。這種集成組合電極包括許多排成矩陣的微電極，及其利用導電物質在玻璃板上形成的引線圖案，在其上可對樣品細胞或機體進行培養。這種集成組合電極使以比玻璃電極或其他普通手段更小的間距，對多個點上的電位變化的測量成為可能。另外，這種集成組合電極還使得對在該集成組合電極上培養的樣品細胞或機體進行長期觀察成為可能。
但是，這種集成組合電極不適合廣泛應用，因為測量電極的尺寸和間距都是固定的。換句話說，很難用一個集成組合電極測量不同的樣品。事實上，過去是通過調整電極的尺寸及間距，製造不同的集成組合電極，來適應不同的樣品。
現介紹一種二維傳感器及使用該傳感器的測量系統，它通過改進上述集成組合電極，使電極尺寸和間距可變，從而適宜於廣泛地用來測量不同樣品的細胞活性。
按本發明的二維傳感器含有包括由Si、SiO2和Si3N4製成的三層的襯底，在傳感器襯底背面Si層表面上通過汽相澱積形成的、用於形成效應電極的薄膜，以及附在傳感器正面的Si3N4層上、用來盛樣品細胞、培養基和參考電極的柵欄。當光束在該傳感器襯底的背面上照射出光斑時，就得到一種信號，該信號對應於由置於所述傳感器的柵欄上的細胞的活性引起的光斑處的電位變化。
本發明的測量細胞活性用的二維傳感器基於美國MolecularDevice Co.公司研製的光尋址電位計傳感器(LAPS)(美國專利4,758,486或4,963,815中解釋的光尋址電位計傳感器)。如圖5所示，光尋址電位計傳感器包括半導體矽襯底101、以及其上的氧化物層102和氮化物層103。作為用來測量諸如與LAPS接觸的液體的電解液的pH值的pH值傳感器，所述LAPS是人所共知的。下面參照圖5簡要地解釋一下用光尋址電位計傳感器測量電解液的pH值的原理。
利用穩壓電源105將偏置電壓加在由電解液、絕緣體和半導體組成的EIS(電解液、絕緣體和半導體)結構上。經某種頻率調製的光束照射在EIS結構的背面。於是如圖6所示，便有光電流流過。圖6I-V曲線隨電解液的pH值沿水平軸(即偏壓)偏移。因此，在加上預定的偏壓的情況下，檢測光電流I即可測出pH值。下面來考慮一下I-V曲線隨電解液的pH值偏移的原因。
當電壓加在EIS結構上時，在半導體與絕緣體之間的界面上，能帶發生翹曲。這個能帶的翹曲取決於與絕緣體接觸的電解液的pH值。在絕緣體層上，形成了矽醇基團(Si-OH)及氨基基團(Si-NH2)，它們的官能團選擇性地與氫核(H+)結合，從而，在電解液中的氫核數與結合的氫核數之間維持平衡。因此，如果電解液的pH值發生變化，則絕緣體上的電荷便發生變化；結果，能帶的翹曲便發生變化，半導體與絕緣體之間的耗盡層厚度亦發生變化。厚度的這個變化，亦即耗盡層電容的變化引起光電流的變化。光尋址電位計傳感器還利用了半導體的光電導特性，使得當光照射時電導率提高。
和光尋址電位計傳感器一樣，本發明的二維傳感器包括含有由Si，SiO2和Si3N4製成的三層的襯底，以及在Si3N4層上用汽相澱積法形成的效應電極薄膜。本發明的傳感器還包括承載樣品細胞、培養基及參照電極的柵欄。直接測量由放置在柵欄內的細胞的活性產生的電位變化的二維分布。換句話說，本發明的傳感器提供直接由與絕緣體層接觸的細胞的活性所產生的電位。相反，如前所述，先有技術的利用光尋址電位計傳感器的pH值傳感器，通過氫核與在絕緣體表面上形成的矽醇基團(Si-OH)及氨基基團(Si-NH2)的結合而在絕緣體的表面上產生電位。
本發明的傳感器改變半導體與絕緣體之間的耗盡層的厚度。從而改變耗盡層的電容。另外，被光束照射的光斑上的電導率增大。於是，從效應電極上便獲得基本上相當於光斑上電位變化的信號。
本發明的測量細胞活性用的系統包括上述的二維傳感器、以光束在二維傳感器背面上照射光斑用的光束源、在二維傳感器背面上的效應電極與正面柵欄內的參照電極之間提供直流偏置電壓用的電源、以及處理在該兩電極之間獲得的信號用的裝置。最好利用雷射束光源作為光束源。雷射束能夠容易地聚焦在小的光斑上，而且，光斑的位置亦能精確控制。該系統最好還包括維持傳感器上柵欄內該樣品細胞的培養環境用的裝置。
在最佳實施例中，該系統還包括以高頻驅動雷射器，使之發射高頻調製的雷射束的裝置，並且，所述信號處理裝置檢測在效應電極與參照電極之間流過的光電流的振幅變化。於是，如前所述，以光電流振幅變化的形式檢測出由於與絕緣體接觸的細胞的活性產生的電位變化而造成半導體與絕緣體之間耗盡層厚度(電容)的變化。
該系統最好還包括使雷射束光源發出的雷射束在二維傳感器背面預定的面積上高速掃描的裝置。這樣，在多個光斑上的細胞活性基本上是同時測量的。可以不用一個掃描的雷射束，而用包括排成矩陣的多個雷射元件的雷射矩陣。通過用分時的方法驅動多個雷射元件，可以進行速度更快的掃描。作為另一方案，該系統可以包括X-Y平臺，後者控制二維傳感器的水平位置，以改變雷射束照射在傳感器上的光斑位置。
圖1是利用本發明二維傳感器的細胞活性測量系統的框圖。
圖2A和2B表示圖1測量系統用的二維傳感器的截面圖和平面視圖。
圖3表示涉及圖1測量系統的、光電流流入其中的電路的等效電路。
圖4A和4B作為一個例子，表示測出的光電流及其振幅的變化。
圖5表示利用先有技術光尋址電位計傳感器的pH值測量系統。
圖6是一個曲線圖，表示用圖5測量電路測出的光電流對偏置電壓的特性曲線，以及該曲線的偏移。
圖1表示本發明的測量細胞活性用的測量系統的最佳實施例。該系統具有用來測量細胞活性的二維傳感器1，其上放置了樣品細胞2及其培養基。包括樣品2及培養基的二維傳感器1放置在恆溫箱3內。
如圖2A及2B所示，二維傳感器1包括由Si，SiO2及Si3N4構成的三層襯底、在襯底背面(Si面)上用汽相澱積法形成的的作為效應電極金銻合金薄膜、以及在襯底正面(Si3N4面)形成的柵欄，所述柵欄用來盛樣品細胞、培養基及參照電極。圖2A表示垂直方向上放大的截面圖。
例如，傳感器襯底的總厚度是200微米；SiO2層的厚度小於50毫微米；Si3N4層的厚度小於100毫微米。Si襯底是N-溝道型，電阻為10歐姆釐米，厚度為200微米，其背面經精心拋光。用蒸鍍法在背面形成的金銻薄膜1a變成合金以形成歐姆接觸。
在襯底另一面形成的氮化矽層(Si3N4)對細胞或其它組織樣品是非入侵性的。因此，它適宜於培養細胞或其它有機樣品。附在Si3N4表面上的柵欄1b，用來盛細胞或其他樣品，呈圓柱形，用聚碳酸脂製成。四個螺栓附在二維傳感器圓周上的四個點上，用來安裝鋁框。
在圖1中，恆溫箱部分3具有雙壁結構，保證其內部免受外部細菌的感染。溫度控制單元4根據溫度傳感器的輸出，控制加熱器和風扇單元5，使得恆溫箱部分3的樣品室3 a保持恆定溫度，例如，37±0.5℃。由95％空氣和5％CO2組成的混合氣體引入樣品室。混合氣體的管道上裝有流量計6和電磁閥7。該系統具有驅動閥門用的驅動電路7a以及控制驅動電路7a的定時器7b。恆溫箱部分3、溫度控制單元4及其他部分構成培養裝置。
該系統包括在傳感器柵欄內的參照電極(RE)與傳感器背面上的效應電極之間施加偏置電壓用的穩壓器8。上述兩電極之間的電流信號送入運算放大器9，將信號放大，並把它送到作為處理裝置的計算機。計算機包括一個16位A/D轉換器。
在傳感器的柵欄內有一個對應電極(CE)；CE和參照電極(RE)都連接到穩壓器8上。CE用來刺激傳感器的柵欄中的樣品，以測量樣品產生的感應電位。為此目的，將脈衝電壓加在CE與RE之間。這個刺激電壓(脈衝電壓)是按照計算機10來的指令由穩壓器8產生的。該系統還可以在不加任何刺激電壓的情況下，測量自產生的電位。
圖1還說明用來把雷射束髮射到二維傳感器背面去的雷射束光源11及其驅動器12。由雷射束光源11發射的雷射束被包括反射鏡和透鏡(採用倒置的顯微鏡的目鏡)的光學系統聚焦。該光束可以聚焦成直徑只有微米數量級的光斑。雷射源驅動器1 2包括用於以千赫茲數量級的高頻來調製雷射束的調製器。
該系統還包括改變雷射照射的光斑在傳感器背面上的位置的裝置；例如，可以採用X-Y平臺，在水平方向移動恆溫箱3內所裝的二維傳感器。該X-Y平臺可以以1微米的步距改變X-Y平面上照射光斑的位置。
在上述實施例中，二維傳感器1的位置可以移動，而雷射束的位置卻是固定的。但是，最好不移動二維傳感器1，而讓雷射束進行掃描。可以在光學系統中採用X-Y檢流計式反射鏡來掃描雷射束。一個替代的方案是採用由許多布置成矩陣的雷射元件的雷射器陣列。採用這個辦法時，每個雷射元件發射與傳感器背面垂直的雷射束，而雷射元件以分時的方法驅動。
如上所述，二維傳感器1的雷射照射光斑產生空穴與電子對。這樣參照電極與效應電極之間的偏壓迫使光電流流動。因為在二維傳感器的表面上形成有絕緣層(SiO2及Si3N4)，因此直流無法流動，但因如前所述，雷射束是以高頻調製的，交流卻可以流動。若Ci為絕緣層的電容，Cd是半導體與絕緣體之間的耗盡層電容，而ip是高頻調製的雷射束誘生的光電流，則光電流i可由從等效電路(圖3)推導出來的下列方程式給出i＝CixiP/(Ci+Cd)若電位是由於與絕緣層表面接觸的細胞的活性的緣故而在絕緣層的表面上產生的，則該電位在半導體和絕緣體之間的界面上造成能帶翹曲。結果，半導體與絕緣體之間的耗盡層厚度以及耗盡層的電容Cd發生某種變化。於是，檢測出的光電流也如上述方程式描述的那樣發生變化。傳感器採用N型半導體時，若在絕緣體的表面產生正電位，則光電流隨著電容Cd增大而縮小。另一方面，如果產生負電位，則光電流隨著電容Cd減小而增大。
下面將說明一個試驗例子，其中用上述測量系統檢測老鼠大腦切割樣品神經細胞的活性。取出兩天年齡的SD鼠的大腦；大腦可見區域的一部分切割成5毫米厚的樣品。將該樣品放在二維傳感器的柵欄內培養。為了提高黏性，傳感器表面的氮化矽層用聚賴氨酸處理，並且用DF+f作為培養基。′DF′是比例為1∶1的DMEM和Nutrient Mixture(F12培養基)的混合物；′f′是5微克/毫升的胰島素、100微克/毫升的轉鐵蛋白、黃體酮20毫微重量克分子濃度(nM)、氫化可的松20nM、腐胺100微重量克分子濃度(μM)、硒20nM和胎牛犢血清5％的混合物。
上述樣品從開始培養後第7至10天便自己產生電位。圖4A及4B表示用上述測量系統檢測出的樣品的電活性。圖4A表示以48千赫茲數位化後的光電流；圖4B表示每10毫秒處理一次圖4A所示電流而得的平均值波形。這些圖形說明，光電流的振幅在144.8至145.2秒之間的時間間隔內減小。因此，可以假定，神經細胞的活性在絕緣體表面產生了正電位。當雷射照射光斑的位置改變時，在樣品的其他部分，也觀察到光電流振幅減小的這種情況。
如前所述，本發明的二維傳感器採用光尋址電位計傳感器結構，該結構包括Si，SiO2及Si3N4層，在Si3N4層上的柵欄內可以培養樣品。通過用調製的雷射束在傳感器的背面照射出光斑而在該光斑檢測出細胞活性造成的電位變化。因此，光束光斑的大小和位置，即分別對應測量電極的大小與位置。這樣，將雷射束聚焦，並使雷射束相對於傳感器運動，則測量電極的大小與位置就很容易改變。
權利要求
1.一種測量細胞活性用的二維傳感器，其特徵在於傳感器包括包括Si層、SiO2層及Si3N4層的傳感器襯底，包括在傳感器襯底背面Si層上用汽相澱積法形成的薄膜的效應電極；以及在傳感器襯底正面Si3N4層上設置的，用來盛樣品細胞、培養基及參照電極的柵欄，當光束在傳感器襯底背面上照射出光斑時，即從效應電極獲得信號，而該信號大體上相當於光束所照射的光斑上電位的變化。
2.測量細胞活性用的測量系統，其特徵在於該系統包括二維傳感器，它包括包括Si層、SiO2層及Si3N4層的傳感器襯底，包括在傳感器襯底背面Si層上用汽相澱積法形成的薄膜的效應電極，以及在傳感器襯底正面Si3N4層上設置的，用來盛樣品細胞、培養基及參照電極的柵欄，用於以用雷射束在傳感器襯底背面上照射出光斑的雷射源，用於在傳感器襯底背面上的效應電極與傳感器襯底正面上柵欄內的參照電極之間加直流偏壓的直流電源，處理在效應電極和參照電極之間的信號用的裝置。
3.權利要求1提出的測量系統，其特徵在於該系統還包括維持在傳感器襯底上設置的柵欄內培養細胞的環境用的裝置。
4.權利要求2提出的測量系統，其特徵在於該系統還包括用於以高頻驅動雷射束光源，使雷射源發出高頻調製的雷射束的裝置，其中，所述處理裝置檢測出在效應電極與參照電極之間流動的光電流振幅的變化。
5.權利要求2提出的測量系統，其特徵在於該系統還包括用於使由雷射束光源發出的雷射束在傳感器襯底背面預定的面積內掃描的裝置。
6.權利要求2提出的測量系統，其特徵在於該系統還包括雷射器陣列，後者包括多個排列成矩陣的雷射元件，每個雷射元件發射出與傳感器襯底背面垂直的雷射束。
7.權利要求2提出的測量系統，其特徵在於該系統還包括X-Y平臺，後者控制二維傳感器的水平位置，以改變雷射照射光斑在傳感器襯底上的位置。
全文摘要
二維傳感器包括Si、SiO
文檔編號G01R19/00GK1156825SQ9610820
公開日1997年8月13日 申請日期1996年6月19日 優先權日1995年6月20日
發明者杉原宏和, 竹谷誠, 龜井明仁, 巖崎裕 申請人:松下電器產業株式會社