一種液體即用型抗凝血酶Ⅲ活性測定試劑的製作方法

2023-05-15 21:07:11 1

本發明屬於生物學檢測技術領域，具體涉及一種液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑及相應的試劑盒。

背景技術：

凝血過程是一個多因子參與的調控的過程。在血管受損傷時，機體通過內外途徑激活凝血過程，最終凝血酶被激活，凝血酶將纖維蛋白原分解變成纖維蛋白，產生凝血。抗凝血酶ⅲ是凝血過程中的一個調控因子。抗凝血酶ⅲ可和參與凝血過程的多個因子結合，並抑制這些凝血因子的活性，例如fxa，fixa，fxia，fiia。但是在沒有肝素存在的條件下抗凝血酶ⅲ和fxa，fiia結合的速度很慢，在肝素存在的條件下，肝素和抗凝血酶ⅲ結合形成複合物，改變抗凝血酶ⅲ了的構象，大大提高抗凝血酶ⅲ和凝血因子的結合速度，這種結合速度可增加1000倍。凝血酶ⅲ主要由肝臟合成，是分子量約為60000da蛋白質。正常抗凝血酶ⅲ的血漿濃度為20～30mg/dl，活性為80％～130％。在血漿中承擔著70％的抗凝血酶活性，抗凝血酶ⅲ在維持血液生理性凝血與抗凝血平衡中起著重要的作用。

血液中抗凝血酶ⅲ的含量或者活性降低，大大增加血栓形成的風險，容易導致靜脈血栓或者肺栓塞症。引起血液中抗凝血酶ⅲ的含量或者活性降低的原因很多。抗凝血酶ⅲ的含量或者活性低既有遺傳性的也有獲得性的。先天性遺傳引起的血液中抗凝血酶ⅲ缺乏又分為i型和ii型，i型抗凝血酶ⅲ缺乏的特徵是抗凝血酶ⅲ合成的降低，血液中抗凝血酶ⅲ總量下降。ii型抗凝血酶ⅲ缺乏的特徵是抗凝血酶ⅲ合成正常，血液中抗凝血酶ⅲ總量是正常的但由於部分抗凝血酶ⅲ功能喪失，表現出抗凝血酶ⅲ缺乏。獲得性的抗凝血酶ⅲ含量或者活性低的原因有多種，包括肝病引起的抗凝血酶ⅲ合成減少，腎病引起的抗凝血酶ⅲ流失，使用肝素等藥物引起的抗凝血酶ⅲ損失，以及彌散性血管內凝血引起的抗凝血酶ⅲ消耗。無論是遺傳性的還是獲得性的抗凝血酶ⅲ缺失症都給患者帶來血栓的風險，給他們的健康和生命帶來難以預測的威脅。抗凝血酶ⅲ活性的檢測在先天性抗凝血酶ⅲ缺陷或異常的臨床診斷具有非常重要的意義。

目前測定抗凝血酶ⅲ的方法主要有免疫學分析方法、凝固法和發色底物法。免疫學分析方法利用抗原抗體結合的原理通過單向放射免疫擴散法、免疫比濁法以及酶聯免疫吸附法測定樣本中at-ⅲ的濃度。這種方法比較特異和靈敏，但是操作繁瑣、耗時，而且無法測定ii型抗凝血酶ⅲ缺乏。凝固法是通過血漿凝固時間來測定樣本中at-ⅲ活性，由於受影響的因素較多，因此特異性，準確度較差。而且操作繁瑣。底物發色法測定血漿中抗凝血酶ⅲ含量的方法由於靈敏度高、準確性好、檢測時間短等特點，且能夠適用於多種自動化分析儀器，目前，臨床上已被廣泛應用。底物發色法是在過量的凝血酶和肝素存在下，血漿中的抗凝血酶ⅲ與凝血酶形成1：1的複合物從而抑制凝血酶的活性，剰餘的沒有和抗凝血酶ⅲ形成複合物的凝血酶作用於凝血酶特異發色底物，將底物裂解產生4-硝基苯胺(4-nitroaniline，pna)顯色基團，4-硝基苯胺量和405nm處吸光度的變化呈正相關，而產生的4-硝基苯胺的量是和中抗凝血酶ⅲ的活性成反比。因此，利用測量405nm處吸光度的變化，可計算出血漿中抗凝血酶ⅲ的活性水平。

在血漿中除了抗凝血酶ⅲ對凝血酶的活性具有抑制作用外，還有其它因子，例如肝素輔助因子ii，對凝血酶具有抑制作用。大約70％的凝血酶抑制活性是由抗凝血酶ⅲ引起。因此基於凝血酶的底物發色法不能準確地反映血漿中抗凝血酶ⅲ的真實水平。雖然通過離子強度，肝素濃度的優化，以及利用牛凝血酶取代人凝血酶可降低肝素輔助因子ii對抗凝血酶ⅲ檢測的影響，但不能完全去除肝素輔助因子ii對檢測的影響。肝素輔助因子ii對fxa沒有抑制作用，用fxa替代凝血酶可克服了上述抗凝血酶ⅲ檢測方法的缺點，更能準確的反映血漿中抗凝血酶ⅲ的真實水平(thrombosisandhemostasia,1991，69(3)：231-235)。中國專利cn106153612a公開了一種基於fxa的抗凝血酶ⅲ的檢測試劑，該試劑在4℃相對穩定，但是在25℃下只能放置5天，對儲存和運輸的要求很高，保管稍有不慎就會導致試劑失活，極大地影響檢測結果。目前市場上基於fxa的抗凝血酶ⅲ的檢測試劑多使用凍乾粉製劑，然而凍乾粉試劑需要冰凍乾燥工序，生產起來比較複雜，而且在使用時需要復溶，由於冰凍乾燥過程中，各瓶冰凍效果的差異，以及復溶過程中，加樣量的不同，都會導致凍乾粉製劑瓶間差，批間差很大。

技術實現要素：

本發明針對現有技術不足，通過對條件的優化，篩選不同的保護劑建立了穩定的液體即用型抗凝血酶ⅲ檢測試劑。具有穩定性好，靈敏度高，特異性好，批間差小以及使用方便等諸多優點。

本發明具體技術方案如下：

一種液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑，包括試劑1和試劑2，所述試劑1包括fxa、肝素、緩衝液和保護劑；所述試劑2包括fxa的發色底物和甘露醇，所述保護劑包括牛血清白蛋白、peg6000和甘露醇。

優選的，所述保護劑為質量體積百分比為0.1％-5％的牛血清白蛋白，0.1％-5％聚乙二醇6000和1％-10％甘露醇。更優選1％的牛血清白蛋白，1％聚乙二醇6000和5％甘露醇。

本發明所述緩衝液優選ph為6.5-9.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，三羥甲基氨基甲烷-咪唑緩衝液或者咪唑-鹽酸緩衝液。優選緩衝液的選工作濃度為0.01-0.3mol/l。

本發明所述xa因子的發色底物選自bz-ile-glu-gly-arg-pna、suc-ile-glu(gamma-pip)-gly-arg-pna·hcl、n-α-z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl、z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl中的一種或幾種。優選n-α-z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl。優選工作濃度為0.6mmol/l-1.5mmol/l。

為了保證試劑1緩衝溶液中的離子強度，可以選擇添加無機鹽如氯化鉀、氯化鈣或氯化鈉中的一種或幾種，優選選工作濃度為0.01-0.25mol/l。

本發明所述fxa選自人、牛、豬fxa中的任意一種，優選牛fxa。優選工作濃度為0.1-5u/ml。

本發明所述試劑1和試劑2還可以含有防腐劑，如疊氮鈉或者proclin300，優選工作濃度質量體積百分比為0.02-0.5％，更優選0.05％。

本發明所述液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑可作為檢測試劑用於製備檢測抗凝血酶ⅲ活性檢測試劑盒。

本發明所述液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑可製備相應的檢測試劑盒，包括盒體和裝有上述試劑的試劑瓶，試劑瓶放置於所述盒體內。試劑盒分別包含試劑1和試劑2。該試劑盒檢測待測樣品中抗凝血酶ⅲ活性時，將待測樣品與試劑1混合併孵育，再加入試劑2混合併孵育後，讀取待測樣品中發色底物的信號強度；最後通過計算信號強度並和已知濃度標準品的標準曲線比對得到血液中抗凝血酶活性。

本發明所述液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑在使用時，採用發色底物法，將待測樣品與上述抗凝血酶活性活性檢測試劑混合併孵育後，檢測發色底物的信號強度；而產生的吸光度信號是和樣品中抗凝血酶ⅲ的活性成反比的。最後通過計算信號強度並和標準曲線比對獲得待測樣品中抗凝血酶ⅲ的活性。

本發明優點：

本發明所述的液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑，試劑1和試劑2均為液體，開瓶即用，無需復溶，使用方便，具有良好的穩定性，能夠在37℃具有相對長期的穩定性，在存儲和運輸不容易失去活性。

本發明所述的液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑相較於凍乾粉劑製備過程簡便，成本相對較低，液態試劑克服凍乾粉試劑復溶過程或凍乾乾燥過程帶來的缺陷，可保證所有成份構成均一的懸浮溶液，灌裝時不會使成份或濃度發生變化，不存在凍乾粉製劑瓶間差，批間差的問題。具有很高的臨床應用價值。

附圖說明

圖1為本發明實施例2的標準曲線。

圖2為本發明實施例3的線性回歸曲線。

具體實施方式

在本發明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。

下面結合具體實施例並參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，該實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。

在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。下述實例中所用的材料、試劑、裝置、儀器、設備等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

下面結合具體實施例對本發明進一步說明。

實施例1試劑1和試劑2的製備

保護劑的配製：使用ph8.1的20mmol/l的三羥甲基氨基甲烷緩衝液，配製不同組分的保護劑，向保護劑中加入防腐劑，防腐劑為工作濃度為0.05％的疊氮鈉。

保護劑1：2％bsa，10％蔗糖，2％peg6000，10％甘露醇。

保護劑2：2％bsa，10％蔗糖，2％peg6000。

保護劑3：2％bsa，2％peg6000，10％甘露醇。

保護劑4：10％蔗糖，2％peg6000，10％甘露醇。

試劑1的配製：稱取tris2.428g、氯化鈉1.02g、加入900ml純淨水，充分溶解，調ph至8.1，加入fxa(購自sigma公司)，緩慢混勻，至濃度為0.4u/ml，用純淨水定容終體積至1000ml，分別加入等體積的上述不同保護劑的溶液，使得fxa的終濃度為0.2u/ml。試劑2的配製：將發色底物n-α-z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl復溶，用醋酸調ph至6.5，加入甘露醇和疊氮鈉，用水調至濃度為1.5mmol/l，甘露醇濃度為5％，疊氮鈉濃度為0.05％。

保護劑篩選：將含不同保護劑的試劑1分別放置於4℃和37℃，每天取160μl試劑1樣品，加入4μl的水，加入40μl的試劑2，利用希森美康血凝儀ca1500測定其od405，結果如表1所示。

表1

結果顯示，含有保護劑1，2和4的試劑1在37℃放置1天後均不同程度上出現活性損失。保護劑3在4℃和37℃放置7天具有較好的穩定性，更能保護試劑1的活性。

實施例2標準曲線製作

按實例1的方法配製配製試劑1和試劑2。試劑1的保護劑選取保護劑3。取濃度為100％的抗凝血酶ⅲ標準品用0.9％的生理鹽水稀悉成濃度為50％和0％的標準品溶液，取4μl標準液加人160μl試劑1孵育2分鐘，加入40μl的試劑2用動力學法測定od405吸光度變化率，將od405吸光度變化率和對應的抗凝血酶ⅲ濃度採取對數線性方程做出標準曲線，如圖1所示。

實施例3線形範圍檢測

分別配製抗凝血酶ⅲ活性濃度約為20％，60％，100％和140％的樣本，用希森美康血凝儀ca1500重複檢測四次，取平均值，如表2所示，做線性回歸曲線，線性範圍為0～140％，結果圖2所示。

表2

實施例4批間差考察

連續配製3批樣品，然後對內質控品進行同時測試，結果顯示各批之間批間差很小，如表3所示。

表3

實施例5穩定性考察

以cn106153612a實施例1公開的方法配製的試劑作為對比試劑(其試劑1：ch3so2-d-leu-gly-arg-p-nitroanilide·acoh2mm，氯化鈉0.2m，聚乙二醇-80001％，試劑3：肝素2iu/ml，氯化鈉0.2m。試劑4：fxa0.5μm，氯化鈉0.2m，聚乙二醇-80001％)，以及本發明所述試劑1和試劑2分別放置於4℃和37℃，每隔7天取樣，分別對質控品2(85％)進行測定。。測試結果如表4所示。

表4

試驗結果顯示，本發明所述液體即用型抗凝血酶ⅲ活性測定試劑相比現有技術的液體試劑，在4℃和37℃具有更高的穩定性。本發明試劑在37℃可穩定28天。說明穩定性很好。