從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法
2023-05-15 04:08:21 1
專利名稱：從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種從紅葡萄酒生產原料及窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法。
背景技術：
非釀酒酵母常常是葡萄酒非接種發酵的主要參與菌群，它們的代謝與發酵作用深刻地影響著葡萄酒的成分和風味品質，在一定程度上能夠提高葡萄酒產品風味的複雜性，它不僅能夠代謝葡萄汁中的糖生成甘油、高級醇、各種揮發性化合物，還能夠產生多種胞外酶影響葡萄酒的結構與風味品質。Moreria等(2005)對葡萄汁有孢漢遜酵母0 wra/ ),季也蒙有孢漢遜酵母 (.H. guiIliermondiI)和釀酒酵母(5 cere visiae)的純種發酵及混合發酵進行了研究，發現三種菌株都具有相似乙醇產量和生產率，在混合發酵時，葡萄汁有孢汗生酵母0 wra/ )和釀酒酵母(5 ce/wisiae)皆會受季也蒙有孢汗遜酵母的影響，生長率降低。而季也蒙有孢漢遜酵母iH. guiIliermondii )具有最高的生長力，同時也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的產生者，並且不受其它菌的影響，而這些物質可賦於葡萄酒果香與花香。在純種發酵中，葡萄汁有孢汗生酵母0 生成最高量的含重硫化合物，季也蒙有孢汗遜酵母iH. guiIliermondii)和釀酒酵母(51 cerevisiae)產生相似量的甲硫醇和2-甲基四氫噻吩-3-酮。但季也蒙有孢汗遜酵母0 gui I Iiermondii )能生相對成較高量的3_甲硫基丙酸，3_甲硫基乙酸丙酷。傳統的分類鑑定主要根據《酵母菌的分類研究學》(Kreger-van Ri j，1998)第四版和Barnett等(2000)編著的《酵母菌特徵與鑑定》第三版的標準為依據。在對酵母進行鑑定前，須在形態學和生理學方面獲得大量的鑑定特徵。WL(ffallerstein Laboratory Nutrient Agar)培養基鑑定方法相對於酵母菌的常規鑑定是一種新興的、較快的鑑定方法。大量研究表明葡萄酒自然發酵過程中出現的大多數典型酵母菌都可以基於其在WL培養基上生長所形成的菌落顏色及形態進行歸類和區別，並對不同葡萄酒酵母在WL培養基上的菌落特徵進行了詳細的描述。特別是對於季也蒙有孢汗遜酵母的鑑定，在顏色形態方面有著相當詳細具體的描述，具有很好的鑑別能力，可以避免生理生化分析的大量工作，對於酵母菌鑑定工作來說，是相當簡便、快速並且十分有效和節儉的方法，由於WL培養基對菌種的生理狀態依賴程度很大，菌種處於不同的生理狀態可能會導致不同的培養結果，尤其是菌落的顏色。所以本試驗作出相應的改進。
發明內容
本發明的目的在於為了解決上述的季也蒙有孢汗遜酵母菌在WL培養基上可能會出現不同的培養結果，而導致鑑定結果失敗的現象，提供一種改進後的WL培養基即WL營養瓊脂培養基分離純化鑑定紅葡萄酒生產原料或窖泥中季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法。本發明的技術方案
一種從紅葡萄酒生產原料及窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，包括下述工藝步驟
(1)、從張裕紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌
①、在無菌條件下，取張裕紅葡萄酒生產原料或窖泥8 15g，加入5(Tl50mL濃度為O.9%的無菌生理鹽水，浸泡15 25min後搖勻，用移液槍吸取O. 05mL O. 2mL菌液，採用濃度為O. 9%的生理鹽水分別進行15 25倍、9(Γ120倍、900 1200倍的梯度稀釋，得三份待分離的稀釋菌液；
②、在超淨工作檯上，取融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基倒平板，每個平 板中注入約15 25mL，按平板中所加入的融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基的量計算，即每升融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基加入O. I IOOmg的抑制細菌的抗生素，待融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基凝固後，取①所得的三份待分離的稀釋菌液O. 05mL O. 2mL分別加入到平板上，用無菌的三角刮鏟將菌液均勻塗布於平板表面；
所述的YPD固體培養基配方糖12 20g，多價蛋白酵母膏5 10g，蛋白腖12 20g，瓊脂12 20g，水IOOOmL ;其中所述的糖為白糖、紅糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一種或兩種以上組成的混合物；
所述的抑制細囷的抗生素為青黴素、鏈黴素、氣黴素、紅黴素或慶大黴素；
③、將步驟②製備好的平板置於25°C 30°C的培養箱中培養3 5天；
④、用接種環分別挑取每個平板上出現的10-30個形態具有區別的典型酵母菌菌落至另一空白的YPD固體培養基平板劃線，將平板置於25°C 30°C的培養箱中培養3 5天；
⑤、重複步驟④直至菌落完全純化，純化菌株斜面保藏於4°C冰箱中備用；
(2)、將步驟(I)分離純化獲得的多個純的酵母菌菌株每株分別劃線接種於YPD固體培養基、YPD液體培養基和空白的WL營養瓊脂培養基平板上，27 30°C下分別培養5-7天後，按照WL營養瓊脂培養基形態學鑑定法結合《微生物分類學》的方法進行菌種鑑定，經鑑定最終獲得季也蒙有孢漢遜酵母菌；
其中所述的YPD固體培養基配方糖12 20g，多價蛋白酵母膏5 10g，蛋白腖12 20g，瓊脂12 20g，水IOOOmL ;其中所述的糖為白糖、紅糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一種或兩種以上組成的混合物；
所述的YPD液體培養基配方，以每升計算，酵母浸粉lg、葡萄糖2g、蛋白腖2g、瓊脂2g，餘量以水補足；
所述的WL營養瓊脂培養基，以每升計算，含有5. Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氫二鉀、O. 425g氯化鉀、O. 125g氯化鈣、O. 125g硫酸鎂、O. 022溴甲酚綠、17. Og瓊脂，餘量由去離子水補足。配製好的WL培養基，調節pH值為6.0，在120°C下滅菌20分鐘。同時利用上述的從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法還可同時獲得葡萄汁有孢漢遜酵母菌、釀酒酵母菌和紅酵母菌。季也蒙有孢汗遜酵母菌、葡萄汁有孢漢遜酵母菌、釀酒酵母菌和紅酵母菌，這4種酵母菌都是在葡萄酒中發現的，但在張裕紅葡萄酒的生產原料或窖泥中，對這些酵母菌的分離和純化是為了找出其中的各種菌與葡萄酒風味產生之間的直接關係。 上述最終所得的季也蒙有孢汗遜酵母菌iHanseniaspora guiIliermondii),其生長特徵在於在YPD固體培養基上3-5天菌落較大，圓形，乳白色凸起，邊緣整齊，易挑起；在YPD液體培養基生長有沉澱。在WL營養瓊脂培養基5-7天菌落中央深綠色泛白，四周淺黃色，菌落扁平，邊緣有透明環。本發明的有益效果
本發明的從紅葡萄酒生產原料及窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，由於採用WL營養瓊脂培養基並結合微生物學技術從紅葡萄酒生產原料及窖泥中分離純化出季也蒙有孢汗遜酵母菌菌株，以利於用純菌株培養出具有獨特愉快香氣風格的紅葡萄酒。進一步，本發明的從紅葡萄酒生產原料及窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，具有無雜菌汙染、菌種易保藏、操作快速簡便、產品質量穩定的特點。·
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明進一步闡述，但並不限制本發明。本發明所用的紅葡萄酒生產原料或窖泥取自山東煙臺張裕卡斯特酒莊。本發明的各實施例所用的各種實驗材料及試劑見下表
權利要求
1.一種從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，其特徵在於包括如下步驟 首先，利用YPD固體培養基從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌；所述的YPD固體培養基配方糖12 20g，多價蛋白酵母膏5 10g，蛋白腖12 20g，瓊脂 12 20g，水 IOOOmL ； 然後，將分離純化獲得的酵母菌菌株分別劃線接種於空白的WL營養瓊脂培養基平板上，27 3(TC培養5-7天後，按照WL營養瓊脂培養基形態學鑑定法結合《微生物分類學》的方法進行菌種鑑定，最終獲得季也蒙有孢漢遜酵母菌； 其中所述的WL營養瓊脂培養基，以每升計算，含有4. 5^5. 5g酵母浸粉、4. 5^5. 5g酸水解酪蛋白、45 55g葡萄糖、O. 45 O. 65g磷酸氫二鉀、O. 325 O. 525g氯化鉀、O. 10 0. 15g氯化鈣、O. 10 0· 15g硫酸鎂、0.02(T0.024g溴甲酚綠、15 19g瓊脂，餘量由去離子水補足。
2.如權利要求I所述的一種從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，其特徵在於所述的利用YPD固體培養基從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌，具體包括如下步驟 ①、在無菌條件下，取紅葡萄酒生產原料或窖泥8 15g，加入5(Tl50mL濃度為O.9%的無菌生理鹽水，浸泡15 25min後搖勻，用移液槍吸取O. 05mL O. 2mL菌液，採用濃度為O. 9%的生理鹽水分別進行15 25倍、9(Γ120倍、90(Γ1200倍的梯度稀釋，得三份待分離的稀釋菌液； ②、在超淨工作檯上，取融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基倒平板，每個平板中注入約15 25mL，按平板中所加入的融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基的量計算，即每升融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基加入O. I IOOmg的抑制細菌的抗生素，待融化後並降溫至約45飛5°C的YPD固體培養基凝固後，取①中所得的三份待分離的稀釋菌液O. 05mL O. 2mL分別加入平板上並塗布均勻； ③、將步驟②製備好的平板置於25°C 30°C的培養箱中培養3 5天； ④、用接種環分別挑取每個平板上出現的10-30個形態具有區別的典型酵母菌菌落至空白的YPD固體培養基平板上進行劃線，然後置於25°C 30°C的培養箱中培養3 5天； 所述的YPD固體培養基配方糖12 20g，多價蛋白酵母膏5 10g，蛋白腖12 20g，瓊脂 12 20g，水 IOOOmL ； ⑤、重複步驟④直至菌落完全純化，純化的菌株斜面保藏於4°C冰箱中備用。
3.如權利要求2所述的一種從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，其特徵在於所述的WL營養瓊脂培養基，以每升計算，含有5. Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氫二鉀、O. 425g氯化鉀、O. 125g氯化鈣、O.125g硫酸鎂、O. 022溴甲酚綠、17. Og瓊脂，餘量由去離子水補足。
4.如權利要求3所述的從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特徵在於所述的紅葡萄酒為張裕紅葡萄酒。
5.如權利要求4所述的從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特徵在於步驟②、④中所用的YPD固體培養基配方糖12 20g，多價蛋白酵母膏5 10g，蛋白腖12 20g，瓊脂12 20g，水1000mL。
6.如權利要求5所述的從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特徵在於步驟②、④中所用的YPD固體培養基配方中所用的糖為白糖、紅糖、葡萄糖、蔗糖、冰糖或蜂蜜中的一種或兩種以上組成的混合物。
7.如權利要求6所述的從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特徵在於步驟②中所述的抑制細菌的抗生素為青黴素、鏈黴素、氯黴素、紅黴素或慶大黴素。
8.如權利要求f7任一權利要求所述的從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌方法中所用的WL營養瓊脂培養基，其特徵在於以每升計算，含有4.5^5. 5g酵母侵粉、4. 5^5. 5g酸水解酪蛋白、45 55g葡萄糖、O. 45、. 65g磷酸氫二鉀、O.325 O. 525g氯化鉀、O. 10 0· 15g氯化鈣、O. 10 0· 15g硫酸鎂、O. 020 0· 024g溴甲酚綠、15 19g瓊脂，餘量由去離子水補足。
9.如權利要求8所述的WL營養瓊脂培養基，其特徵在於以每升計算，含有5.Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氫二鉀、O. 425g氯化鉀、O. 125g氯化鈣、O.125g硫酸鎂、O. 022溴甲酚綠、17. Og瓊脂，餘量由去離子水補足。
全文摘要
本發明公開了從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定獲得季也蒙有孢汗遜酵母菌株的方法。即包括紅葡萄生產原料及窖泥進行純化分離，及按照WL營養瓊脂培養基形態學鑑定法結合《微生物分類學》的方法進行菌種鑑定2個步驟，最終得到純化的季也蒙有孢汗遜酵母菌株。從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定獲得季也蒙有孢汗遜酵母菌株的方法，有利於用純菌株培養出具有獨特愉快香氣風格的紅葡萄酒。並且，這種從紅葡萄酒生產原料或窖泥中分離純化鑑定獲得季也蒙有孢汗遜酵母菌株的方法具有無雜菌汙染、菌種易保藏、操作快速簡便、產品質量穩定的特點。
文檔編號C12Q1/04GK102899258SQ20121038115
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者馮濤, 遊雪燕, 莊海寧, 榮志偉, 周彬耀 申請人:上海應用技術學院