誘導胚胎幹細胞為胰腺細胞的方法

2023-05-15 08:44:01 1

專利名稱：誘導胚胎幹細胞為胰腺細胞的方法
誘導胚胎幹細胞為胰腺細胞的方法發明背景1、 發明領域本發明一般地涉及一種誘導胚胎幹細胞的方法。特別地，本發明涉及 誘導胚胎幹細胞為胰腺細胞的方法，以及具有此用途的試劑盒。2、 現有技術描述糖尿病作為最常見的代謝失調性疾病，影響著世界上4-5%的人群。據 估計，到2010年，糖尿病患者的數量會超過三億五千萬。I型糖尿病是由 於胰島中的e細胞遭受自身免疫破壞所致。所以許多研究小組都在尋找各 種方式試圖來替換這些被破壞的產胰島素的細胞。目前，胰島細胞移植是 除了注射胰島素外唯一有效的可治癒I型糖尿病的方法(SempP,Madsen OD, Mandrup-Poulsen T. Islet and stem cell transplantation for treating diabetes. BMJ 2001;322:29-32)。但是，由於可移植的供體胰島嚴重短缺，導致該方法無法廣泛應用。由胚胎幹(ES)細胞獲得功能性的P細胞被認為能解決可移植的胰島 不足的問題。ES細胞已經被證明能夠分化成胰島樣的集落，特別是胰腺P 細胞(Soria B, Roche E, Bema G， et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162;Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394;Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 2001;50(8):1691-169.)。 Soria等通過一種"細胞捕獲"的方案首次成功 地誘導胚胎幹細胞分化成胰腺e細胞。(Soria B, Roche E， Berna G， et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162)。不過，
這種方法比較複雜，且需要一些遺傳操作。Lumelsky等(Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394)設計了一種誘導ES細胞分化為產胰島素的胰島樣結 構的"五步法"，此法無需遺傳操作。Hori等(HoriY,RulifsonIC，TsaiBC, et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99(25):16105-16110)和Blyszczuk等(Blyszczuk P， Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003)通過添加生長抑制劑LY294002或過表達基因 pax4來改進Lumelsky的"五步法"。但是，所有的這些誘導方案在某些方 面都是複雜的，周期很長。Hansson等(Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A2003;100(3):998-1003)，在使用了 "五步法"後發現ES細胞在培養中可 能通過吸收培養基中的胰島素而使結果出現假陽性。因此，尋找能夠方便 快捷地誘導ES細胞分化成胰腺e細胞的特異性誘導因子十分必要。某些因子已經被報導可以促進確定的內胚層分化。TGF-P超家族的成 員之一，激活蛋白A(activinA)，在原腸胚形成中對內胚層和中胚層的形 成起關鍵性作用。高濃度下它主要誘導內胚層形成(Kumar M, Jordan N, Melton DA, et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122; Hill CS. TGF-(3 signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;ll(5):533-540)。全反式視黃酸(All-trans retinoic acid， RA)是 一種充分表徵的信號分子，在脊椎動物的神經外胚層和中胚層前後模式的 形成中起重要作用(Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. IntRev Cytol 2001;209:1-77)。目前的證據顯示RA也參 與調節胚胎內胚層分化模式，特別是在胰芽形成過程中，並且它也能增強 胰腺P細胞和INS-1細胞系中胰島素的表達(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreaticdevelopment. Current Biology 2002;12(14): 1215-1220; Bl腿entrath J， Neye H， Verspohl EJ. Effects of retinoids and thiazolidinediones on proliferation, insulin release, insulin mRNA, GLUT2 transporter protein and mRNA of INS-l cells. Cell BiochemFunct 2001;19:159-169)。還證明了在爪蟾中激活 蛋白A和RA聯合作用可以使本來應該發育成外胚層的區域分化成可以 表達胰島素的胰腺細胞(Moriya N, Komazaki S， Takahashi S， et al. In vitro pancreas formation from Xenopus ectoderm treated with activin and retinoic acid. Develop Growth Differ 2000;42:593-602)。發明內容本發明的一個目的是提供一種誘導胚胎幹細胞為胰腺細胞的方法。本發明的另一個目的是提供一種能用於誘導胚胎幹細胞為胰腺細胞的試劑合rm. o為達到所述目的，本發明通過了提供一種誘導胚胎幹細胞的方法，包括以下順序的步驟在細胞培養基中培養胚胎幹細胞以形成胚體； 利用激活蛋白A孵育胚體；和利用全反式視黃酸(RA)孵育胚體以使其發育為產胰島素的前體細胞。在一方面，當胚胎幹細胞來源於小鼠時，本方法中使用的培養基是含有約10。/。胎牛血清的DMEM。在另一種情形，當胚胎幹細胞來源於人時， 所述培養基是CDM。在一方面，所述激活蛋白A的濃度約為50-300 ng/ml培養基，所述 RA的濃度可為約1 X 10_7-1 X 10—5mol/L培養基。在一個實施方案中，所述方法進一步包括以下步驟在用激活蛋白A 孵育胚體前，在包被Metrigel的培養基中孵育胚體。在一方面，所述Metrigel 在培養基中的質量百分含量約為1%。在另一個實施方案中，用激活蛋白A孵育胚體20小時到4天，再在 不含激活蛋白A的培養基中繼續培養6-8小時，然後再利用RA孵育20 小時到4天以使其發育為產胰島素的前體細胞。在另一個實施方案中，所述方法進一步包括以下步驟在含有成熟因
子的培養基中培養由此生成的產胰島素的前體細胞以使其擴增。在一個實施方案中，所述成熟因子是濃度為8-12ng/ml的bFGF。在另一個實施方案中，所述方法進一步包括以下步驟在含有N2添 加劑、B27添加齊U、層粘連蛋白(Laminin)和煙醯胺的培養基中孵育此擴 增了的產胰島素的前體細胞以使其發育為產胰島素的細胞。在一方面，所 述培養基是含N2添加劑(1:100，可從Gibco購買)，B27添加劑(1:50, 可從Gibco購買)，l嗎/ml的層粘連蛋白，10ng/ml的bFGF ，胰島素-運鐵蛋白-硒-A (1:100，可從Gibco購買)，以及10 mmol/L煙醯胺的 DMEM/F12或CDM培養基。本發明進一步提供一種誘導胚胎幹細胞分化的試劑盒。 在一個實施方案中，所述試劑盒包括激活蛋白A和RA。在另一個實 施方案中，所述試劑盒進一步包括Metrigd。在再一個實施方案中，所述試劑盒進一步包括血清和/或一級培養基。在一方面，Metrigel被包被在所 述一級培養基上。在另一方面，單獨提供MetrigeL在另一方面，所述一級培養基含有成熟因子，例如bFGF。在另一個實施方案中，所述試劑盒 進一步包括一種含有bFGF的二級培養基。


圖1A為在本發明中提供的能誘導ES細胞向胰島素陽性細胞分化的三步培養法。圖1B為小鼠ES-R1細胞形成EB細胞集落的照片。圖1C為在三步培養法的第二步中的胰腺前體細胞呈現上皮樣結構的 照片。圖1D-圖1E為在三步培養法的第三步出現的細胞集落樣結構的照片。 圖2A為RT-PCR檢測在第二步末由激活蛋白A或RA分別誘導的分化細胞標誌基因的表達情況。圖2B為RT-PCR檢測在第二步末由激活蛋白A和RA共同誘導的分化細胞標誌基因的表達情況。圖2C為RT-PCR檢測在第三步末分化細胞標誌基因的表達情況。圖3A為三步培養法得到的細胞被胰島素一抗染色的免疫組化檢測結果。
圖3B為三步培養法得到的細胞被C-肽一抗染色的免疫組化檢測結果。圖3C為未經激活蛋白A和RA誘導的細胞的胰島素二氨基聯苯胺四 鹽酸鹽(DAB)染色檢測結果(200X)。圖3D為經激活蛋白A和RA誘導的細胞的胰島素DAB染色檢測結 果(200X)。圖3E和圖3G為由三步培養法誘導的轉染了 EGFP報告基因的ES-R1 細胞的EGFP表達情況，其中E、 G分別代表不同的結構(200X)。圖3F和圖3H為由三步培養法誘導的轉染了 EGFP報告基因的ES-R1 細胞被胰島素一抗染色的免疫組化分析結果，其中F、 H分別代表不同的 結構(200X)。圖31為由ELISA檢測的胰島素釋放結果。圖4A為被移植了分化細胞的糖尿病小鼠(n-9)和被移植了 PBS的糖尿 病小鼠(n-12)存活率的比較。圖4B為被移植了分化細胞的糖尿病小鼠(『5)和被移植了 PBS的糖尿 病小鼠(『3)血液葡萄糖水平的分析。圖5A為被移植了 PBS的小鼠胰島素表達的免疫組化分析結果(200X)。圖5B為被移植了分化細胞的小鼠胰島素表達的免疫組化分析(200X)。圖6為人胚胎千(hES)細胞的誘導方法流程。 圖7A為由CDM作用/RA方法誘導的hES的標誌基因的表達情況。 圖7B為僅由CDM培養的對照hES的標誌基因的表達情況。 圖8A-D為最終誘導的hES細胞表達C-肽和Pdxl的照片(400X)。 圖8E-H為最終誘導的hES細胞表達胰高血糖素和C-肽的照片。 圖8I-L為最終誘導的hES細胞表達澱粉酶和C-肽的照片(400X)。 圖8M-P為最終誘導的hES細胞表達C-肽和促生長素抑制素的照片。 圖9A為懸浮和貼壁培養獲得的末端分化細胞胰島素分泌量的比較。 圖9B為懸浮和貼壁培養獲得的末端分化細胞C-肽釋放量的比較。 圖10A為移植了被誘導細胞的糖尿病裸鼠和移植了 PBS小鼠，以及 移植了未經誘導細胞的小鼠的血液葡萄糖水平的比較。
圖10B為被操作小鼠腹膜內葡萄糖耐量測試結果。圖11A為被誘導細胞中人C-肽表達的照片(400X)。 圖11B為人核特異性抗體的染色結果，顯示了 C-肽陽性細胞來源於人 ES細胞(400X)。優選實施方案詳述預先的研究顯示，胚胎幹細胞能夠被特異性誘導分化成胰腺(3細胞(Blyszczuk P, Czyz J， Kania G， et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003; Hansson M, Tonning A， Frandsen U， et al. Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004; 53:2603-2609)。但是， 絕大多數誘導方案都需要大約一個月才能獲得胰島素陽性的細胞。本發明 提供了一種新的三步培養法，它是基於激活蛋白A、 RA和其它一些成熟 因子例如matrigel、煙醯胺(nicotinamide)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的聯合作用。在該三步培養法的第三步末，這些被誘導的細胞形 成小的胰島樣的集落結構並表達胰腺P細胞的標誌基因，包括/mw^、 ; 血7、 g/w^、 &/7和/7" ， 並且還能通過移植拯救經STZ處理的糖尿病 小鼠。三種因子，如激活蛋白A,RA和matrigd，在我們的胰腺(3細胞實驗誘 導方案中起了十分重要的作用。激活蛋白A對早期確定的內胚層的發育十 分重要。它是二硫鍵穩定的蛋白，屬於TGF-(3超家族。它與細胞表面受體 的結合能誘導許多基因的表達，包括m/;c/7和goosecoW，這對早期內胚層 的發育很重要(Kumar M, Jordan N， Melton DA， et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122; Hill CS. TGF-卩signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;11(5):533-540)。 Kubo等報 導激活蛋白A能夠誘導ES細胞分化成為確定的內胚層細胞(Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development 2004; 131:1651 -1662 )。 另夕卜， 激活蛋白A在培養的人胰島中促進胰島素的分泌(Florio P, Luisi S,Marchetti P， et al. Activin A stimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets. J Endocrinol Invest 2000;23(4):231-234)，並在患糖尿病的 新生小鼠的P細胞發育中調控分化和P細胞的再生(Lei L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and Betacellulin Effect on Regeneration of Pancreatic B-Cells in Neonatal Streptozotocin-Treated Rats, Diabetes 2004; 53:608-615)。激活蛋白 A的這些功能的聯合能夠解釋它如何在我們的系統中起作用。第二，近期 已經證明RA除了具有誘導外胚層和中胚層發育的功能，在早期胎胰發育 中也是一個重要的信號分子(Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. Int Rev Cytol 2001 ;209:1 -77 )。在斑馬魚的發育中， PA信號上調能夠誘導胰臟和肝臟內胚層前端的顯著擴增。相反地，用 BMS493抑制RA，能夠抑制胚胎內胚層向胰腺的早期分化(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development. Current Biology 2002;12(14):1215-1220)。 而且，Micalle傳報導，在小鼠胚胎幹細胞分化的第四天加入RA能誘導p血7 陽性的內胚層形成(Micallef SJ， Janes ME， Knezevic K, et al. Retinoic Acid Induces Pdxl-Positive Endoderm in Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004 Dec 7 [Epub ahead of print])。對於胰腺的成熟，RA在 內分泌和導管細胞分化中的作用主要是通過旁分泌以及上調P血7基因實 !見的(Tulachan SS, Doi R, Kawaguchi Y, et al. All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrine cells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas. Diabetes 2003; 52(l):76-84)。在背胰的發 育中RA被發現通過抑制外分泌部分分化而促進內分泌部分發育(Chen Y, Pan FC, B認des N, et al. Retinoic acid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrine at the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus. Developmental Biology 2004; 271:144—160)。 因 此，很顯然RA能促進胰腺前體細胞和內分泌細胞的發育。在激活蛋白A 誘導ES細胞向內胚層分化的過程中，RA可以進一步促進內胚層向胰腺前 體的特化。在用激活蛋白A和RA誘導後，分化的胚胎幹細胞可以表達許 多胰腺前體細胞的標誌基因，例如pdxl、 hnf3 a和hnf4P 。這些數據顯示， 激活蛋白A和RA的聯合作用能夠誘導胚胎幹細胞向早期胰腺細胞的分 化。本發明的結果也表明同時使用激活蛋白A和RA進行誘導比只用其中
之一更為有效。已經證明matrigel在胰腺的體外分化和成熟中起著很重要的 胞外基質的作用。Matrigel是一種包括層粘連蛋白在內的胞外基質和一些 生長因子例如FGF和TGF-P的混合物，對胰腺祖細胞的遷移、三維囊狀結 構的形成和胰島芽突出有重要作用(Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, et al. Characterization of Endocrine Progenitor Cells and Critical Factors for Their Differentiation in Human Adult Pancreatic Cell Culture. Diabetes 2003; 52:2007-2015)。 Gittes GK等也證明matrigel中最主要的成分之一，層粘連 蛋白，參與了小鼠胚胎胰導管系的選擇(Jiang FX, Cram DS, DeAizpuma HJ, et al. Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic betacells. Diabetes 1999; 48:722-730; Crisera CA， Kadison AS， Breslow GD, et al. Expression and role of laminin-1 in mouse pancreatic organogenesis. Diabetes 2000;49:936-944)。而且，培養在matrigd上的人胰腺導管上皮細胞能夠形 成胰島素陽性的胰島樣集落結構(Bomer-Weir S, TanejaM， Weir GC， et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:7999-8004)。本發明證明matrigel在誘導中對於小的 胰島樣集落結構形成是必需的。如果ES細胞單獨培養在層粘連蛋白或者明 膠(gelatin)上，細胞集落不能很好的形成。在此後的例舉性實施例中進一 步顯示分化的細胞在matrigd上生長得比在層粘連蛋白或明膠上好。這些說 明，matrigd能比層粘連蛋白或明膠提供更多的誘導因子。本發明提供了一種新的、能在短期內誘導ES細胞向功能性的產胰島素 的細胞分化的三步培養法，此方法基於激活蛋白A、 RA以及任選地其它 成熟因子的組合。結果顯示TGF-P和RA信號對於胰腺p細胞的發育和成熟 是很關鍵的。胰島素陽性細胞還能進一步表達一些特徵性的胰腺P細胞標 志基因，例如^m/^/、 p血八g/wf2、 /z打^和W/。而且，利用攜帶位於胰 島素啟動子下遊的EGFP的報告基因的載體，本發明能夠降低假陽性率， 從而真實地誘導ES細胞分化為產胰島素的細胞。此外，如下述實施例所證 明的，當被移植到腎包囊部位下時本發明還能夠拯救鏈脲菌素(STZ)誘 導的糖尿病小鼠。此處描述的誘導系統為研究胰腺e細胞的形成和分化機 制提供了一種新的體外誘導模型，同時為I型糖尿病的移植治療提供了一種 潛在的產胰島素的細胞的來源。到此已對本發明進行了概括的描述，通過參考下面的實施例將更便於
對其內容的理解。這些實施例的提供是為了進行例證，而不意欲限制本發 明。實施例實施例l、誘導小鼠胚胎幹細胞為胰腺細胞下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。在含20%胎牛血清(FBS)(Gibco-BRL)， 1000 U/ml白血病抑制因子 (LIF， Gibco-BRL)的Dulbecco，s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL)培養基中培養 一 個己被廣泛測試過ES細胞品系—— ES-Rl(Nagy A， Rossant J， Nagy R， et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90:8424-8428)。一、ES細胞培養和分化的條件ES細胞向胰腺P細胞分化的方法(三步培養法，參見圖1A)如下所示第一步，為誘導胚體(EB)的形成，用胰蛋白酶常規消化ES細胞並使 其懸浮在裝有無LIF的10XFBS/DMEM培養基的Petri培養皿(Alpha medical instmment)中。24至48小時後(參見圖1B)，收集EB並轉移到裝有無LIF的 10XFBS/DMEM培養基且包被了1。/。 Matrigel (BD Biosciences)的培養皿 中。兩小時後，EB開始鋪展，並在含有100ng/ml激活蛋白A (Sigma)的 10% FBS/DMEM培養基中培養24小時。然後，再將EB轉入10。/。 FBS/DMEM中培養6-8小時作為間歇時間。間歇過後，再用含有10—6MRA (Sigma)的10。/。FBS/DMEM培養基繼續培養分化的EB細胞24小時。第二步，為了引起產胰島素的前體細胞的擴增，用含有10ng/mlbFGF (Sigma)的10。/。FBS/DMEM培養基培養分化的EB細胞3-5天，在此期間， 大部分的細胞呈現上皮樣結構(參見圖1C)。第三步，為引起產胰島素的細胞的成熟，在第二步中擴增的細胞被轉 入含有N2增補劑(l:100,Gibco-BRL)， B27增補劑(l:50 Gibco-BRL)，l (ig/ml 層粘連蛋白(Sigma)， 10 ng/ml bFGF (Sigma)和10 mM菸鹼胺(Sigma)的 DMEM/F12培養基(Gibco-BRL)中繼續培養3-5天(Lunielsky N, BIondel 0, Laeng P， et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394)。用尼康 相差顯微鏡(TS-100)觀察細胞的形態。結果顯示被培養的細胞形成集落結構(參見圖1D和圖l E)。二、用RT-PCR檢測分化的細胞中基因的表達情況用Catrimox-14 RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取由第二步或第三步得到 被激活蛋白A和RA共同誘導的，沒有被激活蛋白A和RA誘導的，或僅被 其中之一誘導的細胞的總RNA。用MMLV逆轉錄酶(Promega)將RNA逆轉 錄為cDNA。利用PCR緩衝液中Ex Taq聚合酶(TaKaRa)體系完成PCR反 應。循環條件如下在94。C反應5分鐘，之後循環35個周期(在94。C變性 50秒，在56-58。C退火30秒，在72。C延長40秒)，最後再在72。C培養4分 鍾。利用Prime Premier 5.0設計pdxl， glut2, isll, P-肌動蛋白等的PCR引物。 PCR引物的序列(有義鏈和反義鏈分別顯示)如下JCGCC44GG:rcTa4JGGrCC f2S卵W (序列號2》(序號1) 和序列號3) 和(序歹U號5)和 號6),'g/w,2.' GGL47X^47TCGCCTG04ra4( 序 歹ij 7TCC7TrGG7TrCrG04爿Cr f29處p)(序列號8);爿7TrGCC4CC7^GCC4C4GC4CC( 序歹U/^ac^:CCr044CCCrX4GGCC4v4CCGrGX4 (序歹ij號11)和號 7) 和號 9) 和^C4CGrCCCC4rCT0^4G (序列號 13) 和結果如圖2A-圖2C所示，圖2A的第一行顯示第二步末得到的只用激活 蛋白A誘導的細胞主要表達hnf3p和pdx-1;第二行顯示第二步末得到的只 用RA誘導的細胞只表達hnfip。圖2B表明，第二步末得到的用激活蛋白A 和RA雙因子誘導的細胞表達標誌基因pdx-l,hnf3p， insulinl和hnf4a;圖 2C表明在第三歩末，激活蛋白A和RA雙因子誘導的細胞主要表達insulinI, pdx-l， isll, glut2禾P hnf3(3 (第三泳道"+ ")。 圖2A—圖2C中，-RT表示 沒有逆轉錄的陰性對照，空白表示在陰性對照中僅使用水；圖2C中，第一 泳道"胰腺"為成熟小鼠胰腺細胞陽性對照；第二泳道的符號"一"表示 在第三步末沒有用激活蛋白A和RA誘導的小鼠ES-R1細胞；符號"+ " 表示在第三步末有用激活蛋白A和RA雙因子誘導的小鼠ES-R1細胞。這些細胞不表達其它胰島內分泌細胞(非P細胞)的標誌，如胰高血 糖素或促生長素抑制素。該結果表明TGF-(3和RA信號可能對胰腺P細胞 的發育和成熟具有特異性。並發現誘導過程對激活蛋白A和RA的具有嚴 格的依賴性，如果缺少二者其一則幾乎沒有小細胞集落的形成，且被誘導 的細胞不表達或僅微弱表達胰島素，pdxl, isll， glut2和hnf3卩(參見圖2C 中第二泳道)。此外，我們還發現如果用層粘連蛋白或明膠代替matrigel來 鋪被培養皿，在第三步沒有小細胞集落形成。三、 免疫組化分析為了證明誘導的胰島素陽性細胞還能夠表達C-肽，對其進行了免疫組 化分析將由第三步得到的被誘導細胞用4%多聚甲醛固定，PBS洗三遍 後用10%正常山羊或兔血清室溫孵育20分鐘。棄山羊血清，分別加胰島素 一抗(兔多克隆IgG， 1:200， Santa Cruz)或C-肽 一抗(Linco)4。C過夜培養 細胞。接著進一步用羅丹明綴合山羊抗兔二抗IgG，FITC綴合兔抗山羊二抗 IgG(l:200， SantaCmz)或生物素綴合IgG(工作溶液，SantaCruz)孵育。利用 DAB作為以生物素綴合IgG作為二抗時的反應底物。用奧林帕斯相差顯微 鏡(Olympus IX-71)捕獲圖像。結果表明細胞既表達胰島素，又表達C-肽(圖3A和圖3B)。利用DTZ染色(Shiroi A, Yoshikawa M， Yokota H, et al. Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by Zinc-Chelating Dithizone. STEM CELLS 2002;20(4):284-292)來檢測由該三步培養法發育 而來的細胞或沒有經過激活蛋白A和RA誘導發育而來的細胞(對照組)。 結果表明經三步處理出現了的DTZ陽性細胞集落(洋紅色)(圖3D)，而對 照組中無DTZ陽性細胞集落(圖3C)。這表明由此得到的細胞集落含有胰 島素陽性的細胞。四、 EGFP報告基因的構建以及ES細胞的轉染
有證據表明ES細胞後代能夠吸收來源於培養基中的胰島素而被胰島素抗體染色為陽性(Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC， et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. ProcNatlAcadSciUSA 2002;99(25):16105-16110)。為確定胰島素確實是 由誘導的細胞集落產生，採用EGFP報告體系來檢測胰島素的表達。用 EGFP報告載體轉染R1 ES細胞，其中含有一個被胰島素啟動子驅動的綠 色螢光蛋白質cDNA。利用G418篩選已接入此載體的ES細胞，並利用激活 蛋白A和RA對其進行誘導。具體方法如下構建人胰島素啟動子接EGFP 的載體。將一個從pFOXCAT-362 hlns(Odagiri H, Wang JH, and German MS. Function of the Human Insulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 19%;271(4):1909—1915)切下 0.4 kb的含人胰島素啟動子的Xba I和Hind III片段與CMV啟動子己被 AseI和HindIII切除的pCMV-EGFPN3載體(BD Biosciences)連接。將此 具有新黴素抗性的載體通過電穿孔轉染到ES Rl細胞品系中，並用250 jig/mlGW8(Gibco-BRL)篩選陽性ES克隆。篩選出的小鼠ES-Rl陽性克隆 首先通過激活蛋白A和RA雙因子刺激，利用EGFP對得到的小細胞集落進 行檢測。EGFP結果如圖3E和圖3G所示，在得到的小的細胞集落中可以檢 測到EGFP的表達。另外其表達模式同胰島素表達相吻合(圖3F和圖3H， 按照第三步的免疫組化分析方法進行檢測)。這些數據表明激活蛋白A和 RA以及其它成熟的因子的聯合作用，能夠誘導ES細胞向胰腺細胞的分化。五、ELISA檢測胰島素的分泌量為了進一步測試誘導後的細胞的胰島素分泌量是否能夠對葡萄糖具 有依賴性，使用了兩種濃度(5.5mM和27.7mM)的葡萄糖。用含有2.5 mM 葡萄糖的Krebs-Ringer緩衝液(pH 7.4)在37。C來預孵育細胞90分鐘。為誘導 胰島素的釋放，再用含27.7mM葡萄糖的Krebs-Ringer緩衝液在37^孵育15 分鐘(樣品A)。將另一組細胞先用含2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer緩衝液 在37。C預孵育90分鐘，為誘導胰島素的釋放，再用含5.5 mM葡萄糖的 Krebs-Ringer緩衝液在37。C孵育15分鐘(樣品B，作為對照)。收集被調節 的培養基。用Rat/Mouse Insulin ELISA試劑盒(CRYSTAL CHEM INC)檢 測兩份培養基樣品的胰島素分泌量。細胞總蛋白量用BCATM Protein Assay試劑盒(PIERCE)測定。結果表明細胞在高葡萄糖濃度中胰島素的分泌量 比低葡萄糖濃度時高五倍左右(參見圖31，圖3I中胰島素的含量單位為ng胰 島素/mg細胞總蛋白；柱A為經27.7mM葡萄糖處理後的胰島素分泌水平， 比柱B (經5.5mM葡萄糖處理的)高近5倍)。該結果表明ES來源的胰島素 陽性細胞進行的胰島素分泌也能夠受葡萄糖濃度的調控。六、產胰島素的細胞向小鼠腎包囊下的移植為了測試ES細胞來源的胰島素陽性細胞是否能夠逆轉糖尿病小鼠，將 分化細胞移植到STZ誘發的糖尿病小鼠的左側腎包囊中(i^9)D具體方法如下在細胞或PBS移植前，向6到8周的129隻公鼠腹腔內注射50mg/kg劑量 的鏈脲菌素(STZ, Sigma)，連續注射5天，以誘導的實驗糖尿病的形成。 當被STZ處理的小鼠血液葡萄糖濃度高於13.9mM時，向小鼠左側腎包囊中 移植lxl06個產胰島素的細胞。向對照組(n=12)進行PBS處理。用 GlucoTREND2 (Roche)從被剪斷的尾巴中測量血液葡萄糖濃度。取經過手 術的腎臟進行冰凍切片，並對腎包囊中被移植細胞的胰島素表達進行免疫 組化分析。結果表明被分化細胞處理的糖尿病小鼠(11=9)存活時間較長， 其存活率達到70。/。，而移植了PBS的糖尿病小鼠(r^12，實線)存活率為25% (圖4A)。並且存活的小鼠能夠將體重維持在正常水平。約兩周後，被進行 細胞移植的糖尿病小鼠的血液葡萄糖恢復到正常水平(低於13.9 mM); 相反，進行了PBS移植的小鼠(n=3)的血液葡萄糖持續維持較高水平 (〉13.9mM)(圖4B)。此外，將進行了細胞移植的左腎切除後，小鼠的血液 葡萄糖上升至14mM。利用胰島素一抗沒有在注射了PBS的左腎中檢測到 胰島素陽性細胞(圖5A);而只在被分化細胞處理的STZ-糖尿病小鼠腎臟 中檢測到胰島素陽性細胞(圖5B)。這些結果表明來源於ES細胞的胰島素 陽性的細胞可以逆轉糖尿病小鼠。實施例2、誘導人胚胎幹細胞為胰腺細胞本發明使用了人ES細胞品系，H1或H9。 (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al, Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998;282:1145-1147.)。這些細胞的培養溫度為37。C 。 培養體系為化學組份確定的培養基(CDM: 50%IMDM (Gibco)， 50%F12 (Gibco),單硫甘油(sigma) 450umol/L,胰島素-運鐵蛋白-硒-A (ITS， Gibco),清蛋白片段V (Sigma) 5mg/ml)。簡要地，hES細胞被轉入 CDM進行分化。然後用激活蛋白A和RA誘導hES細胞向胰腺前體細胞 的分化。在此基礎上，利用在mES誘導方法中描述的胰島培養條件進一步 成熟hES來源的胰腺P細胞。為進行分化，實驗流程設計如下第一步，將hES細胞傳代到被1。/。 Matrigd (B&D Biosciences)包被的組 織培養皿(Nunc)上。然後，用改良的CDM (11)替換上述培養基。此改良 的CDM含有50% IMDM(Gibco)和50。/。F12 NUT-MIX (Gibco),並添加胰 島素-運鐵蛋白-硒-A(l:100， Gibco)， 450 pM的單硫甘油(sigma)和5 mg/ml 的清蛋白片段V(Sigma)。兩天後，以含50ng/ml激活蛋白A (Sigma)的 CDM培養基對這些細胞誘導4天。第二步，激活蛋白A誘導4天後，將細胞轉移到含有10—SMRA(Sigma) 的CDM中，再誘導4天。第三步，將培養基從CDM變換為改良的胰島成熟培養基(12): DMEM/F12 (Gibco),胰島素-運鐵蛋白-硒-A(l:100， Gibco)和2 mg/ml清蛋 白片段V(Sigma)以及10ng/mlbFGF。細胞在此培養基中培養3天。之後， 再轉入含DMEM/F12 (Gibco),胰島素-運鐵蛋白-硒-A(l:100, Gibco)和2 mg/ml清蛋白片段V (Sigma)以及10 mM菸鹼胺(Sigma)。並在此培養基 中培養2天。然後再利用0.5 mg/ml的分散酶(Gibco)消化這些細胞，並將其 轉移到超級低依附培養皿(Costar)中放置5天，以形成懸浮培養液從而實現胰島的成熟。二 、分化細胞中基因表達的RT-PCR分析。根據實施例l第二部分描述的方法，利用RT-PCR檢測了促生長素抑制 素(SST), Glut2,澱粉酶(Amy), Soxl7, Hnf4a, pdx-l，胰島素(INS), Hb9,葡 糖激酶(GCK)， IFABP等在分化細胞和對照組細胞中(培養在不含激活蛋白 A和RA誘導的CDM中)的表達。在此，分化細胞是指依照此三歩培養法 獲得的成熟(3細胞。對照組細胞指被激活蛋白A和RA其中之一誘導的細 胞。PCR引物序列(有義和反義分別顯示)如下ga/^/.' GTC4rrG^04GG^rG"CC4(7( 序歹!j號 15) 和 GrG7TCCZ4CCCCC^rGrG 口WZ^ (序列號16);mjc/7: C4GT04Ca4CC4(^4GCC4G^CC (序列號17) 和 CC4C04C7TGCCC4GC4rC7Tp"&」(序列號18)/p血/: 爿CC4X4(7CrC4C( CGTGa4^4 (序歹ij號19) 和 r04rGTGTCrCTCC GTC^Grr P06^; ,(序列號20);/;/xW.' CC7^404rGCCC04CrrC^4CrCCC C序列號21) 和/w/4a.' ^rC4044(7GC4CC^(XTC^C (序列號23) 和 rGTCrTTG7rC4CC4CGC4CT(797*」(序列號24),'嚴島# : 04GGCC4rC44GC4CCMrC4C (序列號25) 和 GGCrGCGrCr4GrrGC4GT^ f373Z^ (序列號26》g/w/2' GCZ4CCG4C4GCC7^rrCT^ (序列號 27) 和 OL4G7rC4Cr04C47UX4G (267—,(序列號28);澱粉朦 fa^y人CTG^CA4C7TOL^GC4yL4 (序歹U號29)和 Z4C4GC4rCC4C4L4X47^C04 (35幼p,(序列號30),-促全長7素^/劍,素(5OT> G^rGCrGrCCTGCCGCCrCC (序列號31)和 rGCC47]4GCC(7GGr7TG^ (序列號32);5w屍入'7TGCC04^4CCG7^a^4Ga4(序列號 33) 和,驀i錄,素(t CG人」GGC4a4CCC4crc4Gra4 (序列號35)和 ^uc4JrGGC04CcrcrrcrG卩o幼^ (序列號36);曹薪激艨「Gd」.'JGGO^rGC7TGCC04CTC (序列號37)和 C4CTGG(XTCrrG4rGGG2Y3756p」(序列號38).結果如圖7A和圖7B所示，表明分化的ES細胞能夠表達成熟e細胞的 標誌基因如胰島素,p血-人葡糖激酶和g/^2 (圖7A)。相反，對照組基本 上不表達任何標誌基因(圖7B)。三、免疫組化分析。用4%多聚甲醛固定被誘導細胞，PBS洗三遍後，在含有0.3% tritonX-100 (Sigma)和10。/。正常血清的PBS中，室溫孵育細胞40分鐘。然後 再用山羊抗人soxl7抗體(1:40， R&D SYSTEMS) —抗，小鼠抗人胰島素單 克隆抗體(1:100, CHEMICON) —抗，兔抗人C-肽抗體(l:200, Linco) —
抗，胰高血糖素(山羊多克隆IgG, 1:200, SantaCmz) —抗，pdxl (山羊多 克隆IgG, 1:200, Santa Cmz) 一抗，澱粉酶(兔多克隆IgG， 1:500， Sigma) 一抗，ngn3 (山羊多克隆IgG, 1:200, Santa Cmz) —抗或促生長素抑制素(山 羊多克隆IgG， 1:200, Santa Cruz)—抗在4。C過夜孵育，並進一步分別用下 列二抗孵育TRITC-綴合山羊抗兔IgG， HTC-綴合兔抗山羊IgG， FITC -綴合山羊抗鼠IgG， FITC -綴合驢抗山羊IgG或TRITC-綴合驢抗兔IgG (1:200，全部購自Jackson ImmunoResearch, INC.)。利用DAPI (Sigma)染 色檢測細胞核。用奧林帕斯相差顯微鏡(Olympus IX-71)捕獲圖像。用 Image-Pro Plus軟體(Media Cybernetics)計算了C-肽陽性細胞的百分數。結果表明這些細胞能夠表達胰腺P細胞基因，例如C-肽,pdx-l等(圖8)。四、產胰島素的細胞向腎包囊下的移植為了證明ES細胞來源的胰島素陽性細胞是否能夠在體內環境下行使 正常的功能，將分化細胞移植到STZ誘發的糖尿病小鼠的左側腎包囊中 (n=12)。具體方法如下所有的動物操作都經過北京大學教育動物護理與使用委員會的批准。 在細胞或PBS移植前，向4到6周的BALB/c公裸鼠腹腔內注射40 mg/kg劑量 的鏈脲菌素(STZ, Sigma)，連續注射5天，以誘導實驗糖尿病的形成。當被STZ處理的小鼠己發展患有糖尿病時，將大約ixioMs秀導細胞移植到左 腎包囊中。無激活蛋白A和RA誘導的PBS或細胞作為實驗對照使用。過 夜禁食後，利用i.g.葡萄糖(2.5 gkg—M本重)進行了糖耐性測試。利用 GlucoTREND2 (Roche)從剪斷的尾巴中測定血液葡萄糖水平。取經過手術 的腎臟進行冰凍切片，並利用免疫組化分析確定被移植了細胞的腎包囊中 C-肽的表達。利用小鼠抗人核單克隆抗體(1:30, CHEMICON)檢測到了 hES來源的細胞。用奧林帕斯相差顯微鏡(Olympus IX-71)捕獲圖像。結 果顯示注射了PBS的腎臟中沒有發現胰島素陽性細胞；此移植小鼠的結果 顯示在圖11A和11B中。移植了人ES來源的分化細胞能夠表達C-肽(圖 IIA)。 C-肽陽性細胞能通過對人核特異性抗體被染色，說明這些細胞來源 於人ES細胞(圖11B)。人胚胎幹(hES)細胞向胰腺P細胞的實驗誘導為I型糖尿病的移植治 療提供了一種潛在的來源。本發明提供的三步培養法能夠誘導hES分化為
功能性的產胰島素的細胞。這種基於將hES培養在化學成分確定的培養基(CDM)及激活蛋白A，全反式視黃酸(RA)和其它成熟因子(參見圖 6)中的方法模擬了體內胰腺發育的信號傳導。通過RT-PCR檢測發現，hES 來源的細胞表達胰腺P細胞標誌基因，例如pdxl,胰島素，葡糖激酶和 glut2 (參見圖7)。這些細胞為C-肽，pdxl，胰高血糖素，促生長素抑制素或 澱粉酶陽性，且C-肽陽性排除了胰島素是通過免疫組化檢測方法被吸收的 可能性(參見圖8)。為了進一步分析誘導後細胞的胰島素分泌是否是葡萄 糖依賴型，使用了兩種濃度P.5mM和2"mM)的葡萄糖。用Krebs-Ringer 緩衝液在37。C來預孵育細胞90分鐘後，用含有2.5 mM葡萄糖的 Krebs-Ringer緩衝液在37。C來預孵育15分鐘。為誘導胰島素的釋放，再用 27.5mM葡萄糖孵育細胞15分鐘。收集各自的被調節的培養基。用Rat/Mouse InsulinELISA試劑盒(Linco)檢測兩份培養基樣品的胰島素分泌量。細胞 內C-肽濃度由Human C-肽ELISA試劑盒(Linco)測定。細胞總蛋白量用 BCATM Protein Assay試劑盒(P正RCE)檢測。結果表明在懸浮培養中被誘導的細胞在高葡萄糖水平培養基中分泌胰島素的量與在低葡萄糖水平培 養基中相比提高了200% (圖9A)。而且，懸浮培養產生的細胞細胞內C-肽含量也增加了 (圖9B)。然而，由貼壁培養培養獲得的細胞的胰島素分 泌量不響應葡萄糖的刺激(圖9A， B)。這些數據表明與貼壁培養相比， 懸浮培養引起了胰島樣細胞更高效的成熟。為了研究被誘導的細胞是否能夠在體內具有功能性，我們向糖尿病裸 鼠的腎包囊下移植了分化細胞。30%的移植了被誘導細胞的小鼠的血液葡 萄糖在近6周內維持在正常水平(<13.9 mM)(圖10A)。糖耐受性檢測顯 示這30。/。的血液葡萄糖被逆轉了的裸鼠，與被進行了對照操作的小鼠相比， 還獲得了改善了的葡萄糖調控能力(圖10B)。移植後一個月，在被移植了 由此三步培養法誘導的細胞的腎包囊中檢測到了C-肽陽性細胞。利用人核 特異性抗體對這些細胞進行染色，結果顯示這些C-肽陽性細胞來源於被注 射的hES細胞(圖11A和11B)。這些結果清楚地顯示hES細胞來源的產胰島素的細胞不僅能夠存活； 而且它們還能體內逆轉30。/。的STZ誘導的糖尿病小鼠。此發現為人類胰島 細胞的發育機制的研究提供了一個新的體外模型，並且這些hES來源的產 胰島素的細胞可在未來的對I型糖尿病移植治療中被利用。
權利要求
1、一種誘導胚胎幹細胞方法，包括以下順序的步驟在細胞培養基中培養胚胎幹細胞以形成胚體；利用激活蛋白A孵育所述胚體；和利用RA孵育所述胚體，使其發育為產胰島素的前體細胞。
2、 權利要求1的方法，其中當胚胎幹細胞來源於小鼠時，所述培養基為含有約10%胎牛血清的DMEM;當胚胎幹細胞來源於人時，所 述培養基為CDM。
3、 權利要求1的方法，其中所述激活蛋白A的濃度為約50-300ng/ml 培養基；所述RA的濃度為約1X10—7-lX10—Smol/L培養基。
4、 權利要求3的方法，進一步包括以下步驟在細胞培養基中培養 胚胎幹細胞以形成胚體的步驟前，用Metrigd包被用於容納培養基的 培養容器。
5、 權利要求4的方法，其中所述metrigel在培養基中的質量百分比大 約為1%。
6、 權利要求5的方法，其中所述胚體與激活蛋白A —起孵育20小 時到4天，再在不含激活蛋白A的培養基中培養6-8小時，然後用 RA孵育20小時到4天，使其發育為產胰島素的前體細胞。
7、 權利要求6的方法，進一步包括以下步驟在含有成熟因子的培 養基中孵育獲得的產胰島素的前體細胞，以擴增產胰島素的前體細 胞。
8、 權利要求7的方法，其中所述成熟因子包括bFGF。
9、 權利要求8的方法，其中所述bFGF的濃度為8-12ng/ml。
10、 權利要求9的方法，進一步包括以下步驟在含有N2增補劑、 B27增補劑、層粘連蛋白和煙醯胺的培養基中孵育所述擴增了的產胰 島素的前體細胞以使其發育為產胰島素的細胞。
11、 權利要求10的方法，其中所述培養基為在含有N2增補劑、B27 增補劑、lpg/ml的層粘連蛋白，10ng/ml的bFGF，胰島素-運鐵蛋白-硒-A(l:100)和10mmol/L的煙醯胺的DMEM/F12或CDM。
12、 一種誘導胚胎幹細胞的試劑盒，包括激活蛋白A和RA。
13、 權利要求12的試劑盒，進一步包括Metrigel。
14、 權利要求13的試劑盒，進一步包括一種一級培養基。
15、 權利要求14的試劑盒，進一步包括血清。
全文摘要
本發明提供一種簡單的能誘導胚胎幹細胞分化為產胰島素的細胞的三步培養法，此三步培養法是建立在激活蛋白A，全反式視黃酸和任選地其它成熟因子的聯合誘導基礎上的。本發明還提供了用於誘導胚胎幹細胞分化為產胰島素的細胞的試劑盒。
文檔編號C12N5/00GK101160390SQ200680012473
公開日2008年4月9日 申請日期2006年4月14日 優先權日2005年4月15日
發明者丁明孝, 候玲玲, 豔 時, 湯富酬, 衛 蔣, 鄧宏魁 申請人:北京大學