一種外切酶保護螢光定量pcr檢測壬基酚的方法

2023-05-21 12:59:01 2

專利名稱：：一種外切酶保護螢光定量pcr檢測壬基酚的方法
技術領域：
：本發明涉及環境雌激素檢測領域，尤其涉及一種外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法。
背景技術：
：壬基酚(nonylphenol，NP)是內分泌幹擾物質(EndocrineDisruptingChemicals,EDCs)中的一種。Staples和Banat等分別於l999年和2000年(Chemosphere)研究證明，壬基酚在環境中性質穩定，不易降解，易於通過生物鏈富集，由於其穩定的化學性質及在環境中超痕量級，使其檢測尤為困難。目前壬基酚的檢測方法主要是色譜法。但是用色譜法不僅昂貴費時，而且分析過程繁瑣冗長。近年來，隨著生物技術的發展產生了許多壬基酚的生物檢測方法，如免疫生物技術、晶片技術、酵母雙雜交技術及慧星試驗等。生物檢測技術靈敏、快速、經濟，特別適用於基層大量樣本的篩選。生物檢測中，PCR檢測技術由於其靈敏度高，簡單易行，受到了廣泛關注。SYBRGreenI螢光定量PCR是近年來出現的具有高靈敏度的定量PCR方法。NP作為雌激素受體(Estrogenreceptor)的配體，通過細胞膜，與位於細胞質中的雌激素結合，形成配體-受體複合物，進一步與結合DNA複合後，形成PCR擴增的模板。傳統的酶切保護分析方法僅用核酸外切酶ExoIII酶切後直接通過瓊脂糖凝膠電泳來分析結合DNA，靈敏度低，將它與PCR連用，容易導致較高的假陽性率。本發明在傳統酶切保護基礎上，進一步利用SI酶完全切除ExoIII酶切後留下的單鏈，使游離的DNA不能被擴增，結合SYBRGreenI螢光定量PCR技術進行檢測。在進行螢光定量PCR擴增時，只有因結合壬基酚-雌激素受體而受到保護的DNA被擴增，而不含配體的樣本因不會誘導雌激素與DNA結合而導致DNA完全酶切，PCR結果為陰性。
發明內容本發明的目的是提供一種靈敏、經濟、快速的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法。本發明通過外切酶保護技術與螢光定量PCR技術相結合，在進行螢光定量PCR擴增時，只有因結合壬基酚-雌激素受體而受到保護的DNA被擴增，而不含配體的樣本因不會誘導雌激素與DNA結合而導致DNA被外切酶完全消解，PCR結果為陰性，用於檢測環境中的壬基酚。本發明所提供的的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，包括如下步驟(l)含受體細胞溶質的提取取經過一個月壬基酚暴露餵養後的金魚，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取出肝臟，用0.15mol/L冰上預冷的KCl溶液洗去肝臟外血液，再用滅過菌的濾紙吸乾表面水分，按照肝臟m:緩衝液v二l:4比例加入冰上預冷的HEDG緩衝液於玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液於12000g離心20min，收集上清。再於16000g離心1小時，小心吸取上清，即為含有受體的細胞溶質，分裝後於-8(TC保存備用。4(2)結合DNA的製備將pUC19質粒稀釋50倍作為模板，常規PCR方法擴增製得結合DNA。產物於1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用PCR產物快速純化試劑盒純化回收。(3)受體-配體結合將lg/L的壬基酚按10倍比稀釋為0.lg/L-lng/L，各取10iU，加入上述提取的細胞溶質250iU，於2(TC振蕩溫育2h。(4)受體-配體-結合DNA複合物的製備從上述每管中取出20ii1於1.5mlEP管中，加入lygpoly(dl.dC)於2(TC溫育15min後，再加入2y1結合DNA，繼續20。C溫育15min，此時溶液中為受體配體DNA複合物。(5)外切酶消解按照6:1:3體積比例向複合物中加入ExoIIIbuffer和HEDG緩衝液，混勻後37"溫育15min。每20y1再加入ExoIIIIOOU，混勻後於37"溫育15min。取出5iU酶切產物，加入Sl量為50U的15iUSl混合液，37t:溫育30min。再加入1y1S1停止液，7(TC滅活10min。得到螢光定量PCR的模板。(6)螢光定量PCR擴增每20iU體系中包含有SYBRGreenIMastermixlOiU，濃度為10ymol/L的引物RlliU，濃度為10iimol/L的引物R21iU，模板2.5y1，滅菌雙蒸水5.5iU。螢光定量PCR循環步驟94t:預變性5min，94"C變性30s，55"C退火30s，72t:延伸lmin，循環40次。最後在72。C延伸5min。(7)建立螢光定量PCR檢測壬基酚標準曲線；(8)根據標準曲線，經線性回歸分析，得到壬基酚濃度與Ct值關係，進行不同濃度壬基酚的檢測。步驟(2)所述的結合DNA製備過程中，引物鹼基序列為上坊t引物Fl:步驟(5)所述的外切酶消解，Sl停止液含0.3mol/LTris鹼，1.35mol/LEDTA。步驟(6)所述的螢光定量PCR擴增體系，每20iU體系中所包含MgC^濃度為2iimol/L。步驟(6)所述的螢光定量PCR擴增過程中，引物鹼基序列為上遊引物R1:5'TCGACGCTCAAGTCAGAG3，；下遊引物R2:5，TAGCACCGCCTACATACC3，。本發明用特徵性引物合成結合DNA，與從魚肝臟中提取的壬基酚受體及不同濃度的壬基酚結合形成複合物後，經核酸外切酶III和S1核酸酶消解，使游離的DNA不能被擴增。酶切後的產物作為模板，進行螢光定量PCR擴增，得到加入壬基酚濃度與起始模板拷貝數的回歸方程，結合定量DNA標準曲線，經線性回歸分析，得到壬基酚濃度與Ct值關係。將外切酶保護與螢光定量PCR方法結合，製備螢光定量PCR模板時，經核酸外切酶III和Sl核酸酶消解，使游離的DNA不能被擴增，從而提高PCR檢測準確度及靈敏度。與現有方法相比，本發明具有靈敏度高，檢出限低的特點，可用於快速檢測大批量樣本中的壬基酚含量。圖1是實施例1的受體-配體複合物的SPR動力學曲線；圖2是實施例1不同濃度壬基酚的受體-配體複合物SPR響應曲線；圖3是實施例1標準模板螢光定量PCR擴增曲線；；圖4是實施例1標準模板螢光定量PCR模板濃度-Ct值關係曲線；圖5是實施例1不同濃度壬基酚誘導結合DNA的螢光定量PCR擴增曲線圖；圖6是實施例1壬基酚濃度的對數與Ct值關係曲線；具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例1—、壬基酚受體的提取及受體-配體複合物的製備1、含壬基酚受體的細胞溶質的提取取體長、重量相近的金魚首先經5%生理鹽水溶液消毒後，用經過3天自然脫氯的自來水在實驗室馴養一星期。馴養過程中每天餵食一次，用砂頭曝氣。一星期後開始加入壬基酚，使水中壬基酚濃度為0.01mg/L，餵養過程中採用靜態換液法，每24小時更換一次。馴養一個月後，取出金魚，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取其肝臟，用0.15mo1/L冰上預冷的KC1溶液洗去肝臟外血液，再用滅菌的濾紙吸乾表面水分，按照m(肝臟)<緩衝液)=1:4比例加入HEDG緩衝液(冰上預冷)於玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液於12000g離心20min，收集上清。再於16000g離心1小時，小心吸取上清，即為含有受體的細胞溶質，分裝後於-8(TC保存備用。2、壬基酚受體-壬基酚複合物的製備及純化將lg/L的壬基酚按10倍比稀釋為0.1g/L-lng/L，各取10iU，加入上述提取的細胞溶質250iU，於2(TC振蕩溫育2h。當配體受體反應結束後，加入0.2ml60X的HAP混勻，冰浴30min，每10min混勻一次，以便HAP充分吸附受體蛋白，經3500g，4t:離心lmin，棄上清。沉澱顆粒加入lml含0.05XT-80的HEDG緩衝液，混合洗滌，同樣條件下離心15min。重複3次，最後一次棄上清後，加入0.4ml0.2mol/L的磷酸緩衝液，間歇振蕩三次，再離心15min，取上清。此時溶液中為較純的配體受體複合物。受體配體純化效果用垂直板電泳鑑定。3、受體-配體複合情況鑑定採用SPR定性鑑定雌激素受體蛋白與壬基酚結合情況。表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance,簡稱SPR)技術由於具有免標記、實時在線檢測、高靈敏度、非破壞性及高選擇性等優點。鑑定結果見附圖l、2，隨著加入壬基酚配體濃度的增加，受體-配體複合物的SPR響應強度增強。在加入壬基酚標準溶液濃度為10-810-2g/L範圍內，壬基酚配體濃度與受體-配體複合物的SPR響應強度之間有較好的線性關係。說明在此範圍內壬基酚與雌激素受體結合度很好。二、受體-配體-結合DNA複合物的製備及外切酶消解1、結合DNA的製備將pUC19質粒稀釋50倍作為模板，常規PCR方法擴增製得結合DNA。利用primerpremier5.0引物設計軟體設計含有反應元件(下劃線部分)的上下遊引物。引物序列如下上遊引物F1:5'CGGAGTTCCGTGAGAAGAGGATAACGCAGGAAAGAACATG3'下遊引物F2:5'CTCTTCTCACGCAACTCCGGTCAGGCAACTATGGATGAAC3'。產物於1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用PCR產物快速純化試劑盒純化回收。2、受體-配體-結合DNA複合物的製備從上述每管中取出20iU於1.5mlEP管中，加入1ygpoly(dl.dC)於20。C溫育15min後，再加入2iU結合DNA，繼續2(TC溫育15min，此時溶液中為受體-配體-DNA複合物。3、外切酶消解取12iU受體-配體複合物，加入2ii1ExoIIIbuffer,6iUHEDG緩衝液，使其體積為20ii1，混勻後37。C溫育15min。再加入ExoIIIIOOU，混勻後於37。C溫育15min。取出5ii1酶切產物，加入15ii1S1混合液(50U)，37"溫育30min。再加入1y1S1停止液(0.3mol/LTris鹼，1.35mol/LEDTA)，7(TC滅活10min。得到螢光定量PCR的模板。三、螢光定量PCR檢測壬基酚標準曲線的建立1、定量標準曲線以不同稀釋度的標準模板進行螢光定量PCR擴增。螢光定量PCR擴增條件每20ii1體系中包含有SYBRGreenIMastermix10yl(MgCl2最佳濃度為2ymol/L)，引物Rl(10iimol/L)liU，引物R2(10iimol/L)liU，模板2.5iU，滅菌雙蒸水5.5iU。螢光定量PCR循環步驟94。C預變性5min，94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，循環40次。最後在72t:延伸5min。用Ct值與其對應的不同定量模板的對數擬合作圖，其中橫坐標代表不同定量模板起始拷貝數，縱坐標代表Ct值，得出一條定量標準曲線，見附圖3、4及表1。在103-108COpieS/iU範圍內，Ct值與起始模板濃度的對數之間有很好的線性關係。兩者關係式為y(Ct)=-3.008x(模板初始拷貝值的對數)+28.855，相關係數R2=0.99120。表1標準曲線的不同定量模板起始拷貝數與Ct值7tableseeoriginaldocumentpage82、不同濃度壬基酚誘導結合DNA的SYBRGreenI螢光定量PCR檢測以不同濃度的壬基酚與雌激素受體-結合DNA製備的複合物，經過酶切保護處理，作為螢光定量PCR模板，進行擴增。根據標準曲線，將不同濃度的壬基酚對應的Ct值轉化成初始拷貝數，得出壬基酚劑量-效應關係為y(壬基酚濃度的對數)二1.6455x(標準DNA拷貝數的對數)+9.523。受體-NP-結合DNA複合物中，加入壬基酚濃度在10-810-2g/L範圍時，壬基酚濃度與結合DNA含量之間具有很好的線性關係。結合標準曲線和壬基酚與Q值劑量-效應關係，得到Ct值和加入壬基酚濃度的關係y(Ct)=-1.828x(壬基酚濃度對數值)+11.447，R2=0.99523。見附圖5、6及表2。表2不同濃度壬基酚誘導的複合物模板起始拷貝數與Ct值tableseeoriginaldocumentpage9權利要求一種外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，包括如下步驟(1)含受體細胞溶質的提取取經過一個月壬基酚暴露餵養後的金魚，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取出肝臟，用0.15mol/L冰上預冷的KCl溶液洗去肝臟外血液，再用滅過菌的濾紙吸乾表面水分，按照肝臟m∶緩衝液v＝1∶4比例加入冰上預冷的HEDG緩衝液於玻璃勻漿器中勻漿；勻漿液於12000g離心20min，收集上清。再於16000g離心1小時，小心吸取上清，即為含有受體的細胞溶質，分裝後於-80℃保存備用；(2)結合DNA的製備將pUC19質粒稀釋50倍作為模板，常規PCR方法擴增製得結合DNA；產物於1％瓊脂糖凝膠電泳分離，用PCR產物快速純化試劑盒純化回收；(3)受體-配體結合將1g/L的壬基酚按10倍比稀釋為0.1g/L-1ng/L，各取10μl，加入上述提取的細胞溶質250μl，於20℃振蕩溫育2h；(4)受體-配體-結合DNA複合物的製備從上述每管中取出20μl於1.5mlEP管中，加入1μgpoly(dI.dC)於20℃溫育15min後，再加入2μl結合DNA，繼續20℃溫育15min，此時溶液中為受體配體DNA複合物；(5)外切酶消解按照6∶1∶3體積比例向複合物中加入ExoIIIbuffer和HEDG緩衝液，混勻後37℃溫育15min；每20μl再加入ExoIII100U，混勻後於37℃溫育15min；取出5μl酶切產物，加入S1量為50U的15μlS1混合液，37℃溫育30min；再加入1μlS1停止液，70℃滅活10min；得到螢光定量PCR的模板；(6)螢光定量PCR擴增每20μl體系中包含有SYBRGreenIMastermix10μl，濃度為10μmol/L的引物R11μl，濃度為10μmol/L的引物R21μl，模板2.5μl，滅菌雙蒸水5.5μl；螢光定量PCR循環步驟94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環40次；最後在72℃延伸5min；(7)建立螢光定量PCR檢測壬基酚標準曲線；(8)根據標準曲線，經線性回歸分析，得到壬基酚濃度與Ct值關係，進行不同濃度壬基酚的檢測。2.根據權利要求1所述的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，其特徵在於步驟(2)所述的結合DNA製備過程中，引物鹼基序列為上，引物F1:5'CGGAG3.根據權利要求1所述的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，其特徵在於步驟(3)所述的受體-配體結合，採用SPR定性鑑定雌激素受體蛋白與壬基酚結合情況。4.根據權利要求1所述的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，其特徵在於步驟(3)所述的受體-配體結合，加入壬基酚溶液濃度為10-810-2g/L。5.根據權利要求1所述的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，其特徵在於步驟(5)所述的外切酶消解，Sl停止液含0.3mol/LTris鹼，1.35mol/LEDTA。6.根據權利要求1所述的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，其特徵在於步驟(6)所述的螢光定量PCR擴增體系，每20iU體系中所包含MgCl2濃度為2iimo1/7.根據權利要求1所述的外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法，其特徵在於步驟(6)所述的螢光定量PCR擴增過程中，引物鹼基序列為上遊引物R1:[5'TCGACGCTCAAGTCAGAG3，；下遊引物R2:5，TAGCACCGCCTACATACC[3，。全文摘要本發明涉及一種外切酶保護螢光定量PCR檢測壬基酚的方法。本發明用特徵性引物合成結合DNA，與從魚肝臟中提取的壬基酚受體及不同濃度的壬基酚結合形成複合物後，經核酸外切酶III和S1核酸酶消解，使游離的DNA不能被擴增；酶切後的產物作為模板，進行螢光定量PCR擴增，得到加入壬基酚濃度與起始模板拷貝數的回歸方程，結合定量DNA標準曲線，經線性回歸分析，得到壬基酚濃度與Ct值關係，進行不同濃度壬基酚的檢測。本發明具有靈敏度高，檢出限低的特點，可用於快速檢測大批量樣本中的壬基酚含量。文檔編號G01N21/64GK101691606SQ20091005675公開日2010年4月7日申請日期2009年8月20日優先權日2009年8月20日發明者趙曉祥,鄧琴申請人:東華大學