一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B及其製備方法
2023-05-21 21:11:01 1
專利名稱：：一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及中藥生物活性成分的提取製備方法，具體涉及一種5-a還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B及其製備方法。
背景技術：
：蕁麻屬植物中含有大量的木脂素類成分，從中鑑定出了13個木脂素類化合物(+)-新橄欖樹脂素、(-)-開環異落葉松脂素、異落葉松脂素、松醋醇、3,4-二香草基四氫吠喃、新橄欖樹脂素-4-0-D-葡萄糖苷、9-乙醯基-新橄欖樹脂素、9-乙醯基-新橄欖樹脂素-4-0-e-D-葡萄糖苷、9,9，-二乙醯基-新橄欖樹脂素、9，9'-二乙醯基-新橄攬樹脂素-4-0-e-D-葡萄糖苷、(-)-開環異落葉松脂素-9-0"6-D-葡萄糖苷、(-)-開環異落葉松脂素-4-o-e-D-葡萄糖苷、新橄欖樹脂素-9-0-e-D-葡萄糖苷。其結構類型主要有新橄欖樹脂素及其苷類和開環落葉松脂素、落葉松脂素及其苷類，其中新橄欖樹脂素及其苷類結構如下:,0GltiC0S69，9、-二乙醯基-新橄欖樹脂素、9-乙醯基-新橄欖樹脂素-4-0-p-D-葡萄糖苷OCH3(一)-開環異落葉松脂素-4-0-P-D-葡萄糖苷5-甲氧基開環異落葉松脂素formulaseeoriginaldocumentpage5異落葉松脂素有研究表明從大蕁麻根中分離到(+)-新橄欖樹脂素、(-)-開環異落葉松脂素、脫氫二松柏醇、異落葉松脂素、松脂醇和3，4-二香草基四氫呋喃，並檢驗了以上幾種物質體外與SBHG的親和作用，結果除松脂醇外，其餘化合物都有親合力，其中3，4-二香草基四氫呋喃的親合作用最強，濃度為250pg/ml時抑制率為95%。提示大蕁麻根中木脂素類是治療BPH的活性成分之一。本課題組曾對國產的8種蕁麻屬植物根的不同提取物進行了抗前列腺增生的生物活性篩選，結果表明滇藏蕁麻根的20%和95%乙醇提取物能顯著地抑制前列腺增生大鼠的病變組織。
發明內容本發明的目的是在前期研究的基礎上，為了進一步研究提取物抗前列腺增生的活性部位和作用機理，選取前列腺組織中一個關鍵酶一5a-還原酶為作用耙點，採用酶聯免疫(Enzyme-linkedi鵬unospecificassayELISA)的方法，建立抑制5a-還原酶體外模型，從大鼠前列腺組織中提取5a-還原酶，與底物睪酮以及供氫體NADPH共同組成了一種微量反應體系，利用酶標儀檢測雙氫睪酮(DHT)的含量，以DHT的含量來判斷蕁麻提取物是否有抑制5a-還原酶的活性。本發明從三角葉蕁麻中分離得到了蕁麻裂環木脂素苷B，該成分的結構不同於上述木脂素類成分，為一種新的裂環木脂素類成分，對抑制5a-還原酶作用研究發現具有較強活性，是一種潛在的抗前列腺增生藥物成分。上述5-a還原酶抑制劑一蕁麻裂環木脂素苷B的製備方法是以三角葉蕁麻為原料，製備步驟如下(1)將三角葉蕁麻千燥地下部分粉碎處理後，用質量濃度為95%的工業乙醇回流提取，過濾後減壓濃縮；(2)將醇提取物用50-9(TC的水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)正丁醇萃取物經大孔樹脂D101分離，採用質量濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液；(4)乙醇洗脫液用矽膠柱色譜分離純化，採用體積比為氯仿甲醇=30:1、10:1、5:1、3:1、1:l的梯度洗脫，收集洗脫液；(5)步驟(4)的洗脫液經反相矽膠柱色譜分離純化，採用體積比為甲醇水=3:7的溶液洗脫，每15-30ml收集成1份，收集第25-30份洗脫液，合併濃縮後得到蕁麻裂環木脂素苷B。採用核磁共振(NMR)等波譜技術測定其結構，蕁麻裂環木脂素苷B的波譜數據見表1。表1.蕁麻裂環木脂素苷B的'HNMR和l3CNMRtableseeoriginaldocumentpage7蕁麻裂環木脂素苷B可以用於製備抗前列腺增生藥物，將有效劑量的蕁麻裂環木脂素苷B與藥用載體混合併製成適當劑型的藥物。本發明的有益效果是原料為純天然植物根，安全易得，方法簡單易操作，不引入有毒物質，成本低廉，在抗前列腺增生藥物研究開發上具有非常重要的意義。具體實施例方式下面以具體實施例對本發明作進一步的說明，但並不影響本發明的保護範圍。實施例l三角葉蕁麻藥材採集自四川省阿巴州。從三角葉蕁麻中製備蕁麻裂環木脂苷B方法步驟如下..(1)將三角葉蕁麻乾燥地下部分粉碎處理後，用質量濃度為95%的工業乙醇回流提取，料液比(kg/1)=1:8,提取溫度9(TC，提取時間3h，提取次數3次，合併提取液，過濾後減壓濃縮至無醇味；(2)將醇提物200g用2L溫度為7(TC的熱水混懸，依次用2L的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取三次。(3)正丁醇萃取物30g經D101大孔樹脂(lkg)分離，採用質量濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液10L;(4)乙醇洗脫物濃縮至幹得5g，用矽膠柱色譜(矽膠150g)分離純化，採用體積比為氯仿甲醇=30:1、10:1、5:1、3:1、1:1梯度洗脫，，收集每個比例洗脫液1L;(5)歩驟(4)的洗脫液濃縮至幹得lg，然後經反相矽膠柱色譜(反相矽膠30g)分離純化，採用體積比為甲醇水=3:7的溶液洗脫，每25ml收集成l份，合併第25-30份洗脫液，濃縮後得到蕁麻裂環木脂素苷B90mg。實施例25-a還原酶抑制作用實驗步驟如下(1)5-a還原酶的製備雄性SD大鼠3隻，體重200il0g，大連醫科大學實驗動物中心提供，禁食不禁水過夜處死，迅速取出腹側的前列腺組織在冰臺上剪碎，用預冷的勻漿液(蔗糖0.73moH/1，氯化鈣l.91mmol'L")在玻璃勻漿器中勻槳，在4'C下以10000rpm低溫高速離心20min，取上清液再以16000rptn低溫高速離心30min，即為5a-還原酶提取物。採用lowry法測定蛋白含量，以酶提物中的總蛋白含量表示5a-還原酶提取物的含量，將提取物放入小離心管在-70'C下保存，備用。(2)5a-還原酶抑制活性測定操作分兩部分完成，即①將反應成分37。C恆溫緩衝液、睪酮、實施例l製備的蕁麻裂環木脂苷B樣品、陽性對照藥、NADPH及酶組織液依次加入96孔板內，使之微量化，設置不同反應孔和對照孔板。反應溫度為37'C(相對飽和溼度)，反應時間為60min:②採用ELISA法定量測定產物DHT，以產物的生成量大小反映酶活性的強弱。受試樣品8管中DHT的含量低於酶反應管中DHT含量時，則視為具有抑制5a-還原酶的活性。檢測方法及計算參照睪酮試劑盒(購於AdlitteramDiagnosticLaboratories公司)使用說明進行。所有實驗孔均為雙復孔操作。在已經確定的反應體系基礎上，輔酶NADPH濃度為lmmoH/1，睪酮濃度為0.5pmol，U1,結合睪酮試劑盒微量測定的特點，將整個反應體系的總量定為20(^1。酶反應體系中各組分的原始濃度分別為緩衝溶液(PBS20mmol，L-l，蔗糖O.2mol七—1，EDTANa2lmmol'L-1，pH6.8);NADPH濃度(20mmol丄")；粗酶濃度(4.3mg'mr1);睪酮濃度(2(^11101丄-1);非那雄胺(1.3腿01'!/1)。tableseeoriginaldocumentpage9從上表可以看出蕁麻裂環木脂素B能顯著抑制DHT的生成，作用比陽性藥非那雄胺稍弱一些。權利要求1、一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B，其特徵在於，其分子結構式如下2、權利要求l所述的一種5-a還原酶抑制劑一蕁麻裂環木脂素苷B的製備方法，其特徵在於，該方法是以三角葉蕁麻為原料，歩驟如下-(1)將三角葉蕁麻乾燥地下部分粉碎處理後，用質量濃度為95%的工業乙醇回流提取，過濾後減壓濃縮；(2)將醇提取物用50-90'C的水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)正丁醇萃取物經大孔樹脂D101分離，採用質量濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液；(4)乙醇洗脫液用矽膠柱色譜分離純化，採用體積比為氯仿甲醇=30:1、10:1、5:1、3:1、1:l的梯度洗脫，收集洗脫液；(5)步驟(4)的洗脫液經反相矽膠柱色譜分離純化，採用體積比為甲醇水=3:7的溶液洗脫，每15-30ml收集成1份，收集第25-30份洗脫液，合併濃縮後得到蕁麻裂環木脂素苷B。全文摘要本發明涉及中藥生物活性成分的提取製備方法，具體涉及一種5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B及其製備方法。本發明在前期研究的基礎上，從三角葉蕁麻中分離得到了蕁麻裂環木脂素苷B，該成分的結構不同於上述木脂素類成分，為一種新的裂環木脂素類成分，其分子結構式如上，上述的5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B的製備是以三角葉蕁麻為原料，5-α還原酶抑制劑-蕁麻裂環木脂素苷B對抑制5α-還原酶作用研究發現具有較強活性，是一種潛在的抗前列腺增生藥物成分。文檔編號C07H15/26GK101671380SQ200910012708公開日2010年3月17日申請日期2009年7月22日優先權日2009年7月22日發明者馮寶民,玲唐,王恵國,王永奇申請人:大連大學