雙重檢測生物傳感晶片及其製備方法和dna檢測方法
2023-05-22 05:31:46
雙重檢測生物傳感晶片及其製備方法和dna檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種雙重檢測生物傳感晶片，包括襯底，以及設置於襯底上三電極體系，三電極體系包括生物傳感電極、輔助電極和參比電極，所述生物傳感電極為納米金電極，納米金電極包括設置於襯底上的透明導電基底，該透明導電基底表面上設有若干規則排布的納米金顆粒。本發明的雙重檢測生物傳感晶片，將三電極體系中的工作電極採用納米金電極，納米金顆粒的電極結構能進行局域表面等離子的光學生物檢測；而透明導電基底本身也是N型半導體，實現電化學生物檢測的同時，其透明特性也不會影響光學檢測的進行。
【專利說明】雙重檢測生物傳感晶片及其製備方法和DNA檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物電子電化學和光學傳感【技術領域】，具體涉及一種聯合電極表面電化學信號和局域表面等離子體共振的雙重檢測生物傳感晶片及其製備方法和檢測方法。
【背景技術】
[0002]局域表面等離子體共振(LSPR,Localised Surface Plasmon Resonance)是金屬納米顆粒或者不連續的金屬納米結構被入射光激發後，其內部自由電子的協同震蕩產生局域表面等離子體共振，金屬納米結構表面的局域電磁場被極大增強，展現強烈的表面等離子體共振吸收。生物傳感晶片利用納米顆粒表面修飾特定捕獲探針，檢測物質與捕獲探針的雜交/親和結合會改變傳感器的檢測平面上納米顆粒本身的震動頻率，從而使得傳感器對入射光產生的吸收峰發生改變，變化的大小程度與檢測物質的濃度呈正相關。
[0003]在電化學檢測中，比如有酶催化體系主要用於安培型或伏安型電化學傳感器，利用循環伏安法進行核酸或蛋白分析，操作簡便、直觀，靈敏度高，常用於蛋白或核酸定量或定性分析。在酶催化放大電化學傳感器中，常以標記的辣根過氧化物酶(HRP)催化相關底物反應電信號，在電極表面放大檢測信號。差分脈衝伏安法具有靈敏度高、分辨能力強、選擇性強等特點，在分析領域得到廣泛的應用。在定量檢測方面，常常比分子或院子吸收光譜、大部分色譜方法靈敏。
[0004]但目前，為滿足不同靶物質定量或定性檢測要求，需要同時進行光學生物檢測和電化學生物檢測等多種檢測才能確定待測物的準確信息；而實施中則需分別製備上述特定檢測的電化學或光學傳感晶片，每一種傳感晶片只能實現單一種類檢測，導致檢測過程需要分次重複，耗時、成本高；需要分別製備對應的單一傳感晶片，過程繁瑣。
【發明內容】
[0005]本發明實施例的目的在於提供一種高靈敏度、製備簡單、成本低的聯合電極表面電化學信號和局域表面等離子體共振的雙重檢測生物傳感晶片，以及其製備方法和檢測方法。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下:
[0007]—種雙重檢測生物傳感晶片，包括襯底，以及設置於所述襯底上三電極體系，所述三電極體系包括生物傳感電極、輔助電極和參比電極，所述生物傳感電極為納米金電極，所述納米金電極包括設置於所述襯底上的透明導電基底，該透明導電基底表面上設有若干規則排布的納米金顆粒。
[0008]本發明的雙重檢測生物傳感晶片，將三電極體系中的工作電極採用納米金電極，納米金顆粒的電極結構能進行局域表面等離子的光學生物檢測；並且納米金電極包括透明導電基體，而透明導電基體本身是選用N型半導體；同時能滿足實現電化學生物檢測和光學生物檢測，並且同時結合LSPR與電化學的檢測結果，可以減少樣品檢測中的假陽性結果，整體檢測結果更加精確。
[0009]本發明進一步還提出一種雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，包括如下步驟:
[0010]製備納米金電極；
[0011]以所述納米金電極作為工作電極，與輔助電極和參比電極組裝成三電極體系。
[0012]採用本發明上述製備方法，採用在透明導電基底上形成納米金顆粒製成納米金電極，再將納米金電極用於三電極模板中的工作電極，即可同時實現光學和電化學的檢測。
[0013]本發明還提出一種基於雙重檢測生物傳感晶片的DNA檢測方法，包括如下步驟:
[0014]獲取待測DNA;
[0015]將待測DNA添加至雙重檢測生物傳感晶片的工作電極上；
[0016]檢測加樣後的雙重檢測生物晶片在400nm?800nm光波長內的吸收光譜，以及用差分脈衝伏安法測定雙重檢測生物晶片的電流峰譜。
[0017]本發明的基於雙重檢測生物傳感晶片的DNA檢測方法，相比現有的單一檢測的方式，可以同時進行光學和電化學生物檢測，耗時短，且能避免分次檢測的結果偏差，更加提高了檢測的精確性和靈敏度；並且同時結合LSPR與電化學的檢測結果，可以減少樣品檢測中的假陽性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中:
[0019]圖1為本發明實施例雙重檢測生物傳感晶片的結構示意圖；
[0020]圖2為本發明實施例納米金電極製備過程中壓印板與透明導電基底壓合示意圖；
[0021]圖3為圖2中壓印後抗蝕層表面生成納米級尺寸凹槽的結構示意圖；
[0022]圖4為圖3中抗蝕層表面沉積保護層後的結構示意圖；
[0023]圖5為圖4中抗蝕層被等離子蝕刻後的結構示意圖；
[0024]圖6為圖5中保護層和透明導電基底裸露表面生成Au膜後的結構示意圖；
[0025]圖7為圖6中去除殘留抗蝕層後獲得的納米金電極結構示意圖；
[0026]圖8為本發明實施例雙重檢測生物傳感晶片進行雙重檢測的示意圖。
【具體實施方式】
[0027]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0028]本發明實例提供了一種聯合電極表面電化學信號和局域表面等離子體共振的雙重檢測生物傳感晶片，參見圖1，其包括襯底I，該襯底I的表面上設置有納米金電極2、以及輔助電極3和參比電極4組成的三電極體系；
[0029]其中納米金電極2包括一設於襯底I上的透明導電基底21，該透明導電基底21表面上設有納米金顆粒；納米金顆粒尺寸大小為納米級，本發明中優選採用20?80nm。且進一步地，在本發明中納米金顆粒的數量可以有若干，整體規則、有序、均勻分布排列，可以提高LSPR傳感器對界面變化檢測的靈感度。
[0030]在本發明中，上述襯底I在實施中採用玻璃即可，基於其功能和電極襯底的效果用石英、亞克力等透明度和強度較好的材料進行也可以，實施中也可以採用PCB。
[0031]並且為了使本發明中的三電極體系相比現有的標準三電極能夠具備微量檢測的功能，其中參比電極4用標準Ag/AgCl電極；輔助電極3用鉬黑電極、也可以使用在研究介質中保持惰性的金屬材料如N1、W、Pb等，保證輔助電極3上的電流密度，使其在測量過程中基本上不被極化。
[0032]鑑於傳統的傳統的三電極體積龐大，化學試劑消耗較大，製備工藝繁瑣，僅適於大量檢測，因此在本發明中上述三電極體系採用絲網印刷方法進行製作，採用絲網印刷電極製備三電極，本身絲網印刷技術具有如下特點:1、適用於各種材質，如S1、PVC、PC、PET、PU等材料均可使用；2、可以在基底表面印刷各種圖案，設計十分靈活；3、印刷過程易實現自動化；4、重現性好；5、成本低廉；因此，絲網印刷技術能夠大批量生產重現性好的生物傳感器，而且製備的三電極體系可以用於非常微量的標樣檢測。
[0033]本發明採用將現有電化學生物檢測晶片中的工作電極用能夠進行局域表面等離子共振光學生物檢測的納米金電極2進行；其中納米金電極2中的採用透明導電基底21 ；實施中該透明導電基底優選為ITO即氧化銦錫，本身是一種N型半導體材料，具有良好的導電性、透明性和黏附性等獨特性能，在本發明中將其進行加工形成厚度為納米級的玻璃膜的形式固設於襯底I上，然後在透明導電基底21表面上蝕刻形成納米金顆粒結構，能進行局域表面等離子的光學生物檢測，而且由於ITO本身又是導體，本發明中將其作為工作電極的基底，那麼便可以用於電化學生物檢測，其材質和導電的整體性能可以最優地滿足本發明中進行電化學檢測中的導電性能，以及作為光學檢測中基底的條件。當然，該透明導電基底21除了上述ITO薄膜或者薄片之外，還可以採用同等性質的AZO(鋁摻雜的氧化鋅)、FTO(SnO2:F)、PET-1TO等透明導電薄膜及玻璃進行替換，皆可。為了使得ITO基底能夠較好地接入檢測，納米金電極2還包括與ITO基底連接的導電接口 22，更加便於電連接後進行檢測。
[0034]當然，進一步地，本發明的雙重檢測生物傳感晶片，其納米金電極2上固定有靶向設計DNA探針，通過該DNA探針與待測的DNA特異性結合引起檢測中光譜或者電信號的差異，從而得出待測DNA的定量和定性結果。
[0035]本發明進一步提出上述雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，包括如下步驟:
[0036]S10，製備納米金電極；
[0037]S20，組裝雙重檢測生物傳感晶片；
[0038]S30，在納米金電極上固定DNA探針；
[0039]其中在本發明上述步驟中，步驟SlO為製備納米金電極，其具體實施中可以採用如下步驟進行，具體可以參見圖2-7所示的示意圖:
[0040]S11，獲取一 ITO玻璃211，並將其表面進行清洗、乾燥後備用；
[0041]S12，在ITO玻璃211表面塗布一抗蝕層212 ；
[0042]S13，在抗蝕層212的表面上生成納米級尺寸的凹槽214 ；
[0043]S14,在抗蝕層212的非凹槽表面沉積一保護層215 ；
[0044]S15，將沉積有保護層215的ITO玻璃211進行等離子蝕刻，除去位於凹槽214部位的抗蝕層212，並使位於該凹槽214部位的ITO玻璃211表面裸露；
[0045]S16，在步驟S15所製備的ITO玻璃211的裸露表面生成納米級厚度的Au膜216 ；
[0046]S17，再用氧氣等離子體處理，除去殘餘的抗蝕層212，即得到ITO-納米金電極。
[0047]其中上述步驟S13中，抗蝕層212表面納米級尺寸凹槽214的形成在本發明中採用納米壓印技術進行，其具體實施中可以選用一壓印板213，該壓印板213的壓印面上具有若干規則排布的尺寸為納米級的凸模型213a，將壓印板213的壓印面與抗蝕層212壓合，那麼便能在抗蝕層212表面上形成與上述納米級的凸模型213a適配的凹槽214。當然，本發明納米壓印實施中，鑑於檢測的需要，凸模型213a和凹槽214的形狀可以根據檢測的需求進行設計，當然一般為了檢測光譜的譜帶更加優良，形狀優選規則幾何形狀。
[0048]在完成上述納米金電極後，這一納米金電極其表面的納米金可以直接用於局域表面等離子光學生物檢測，進一步為了滿足能夠同時進行電化學檢測的功能，進一步採用步驟S20組裝雙重檢測生物傳感晶片，在步驟S20中採用將SlO所製備的納米金電極安裝在三電極模板上。
[0049]在組裝完成雙重檢測生物晶片之後，為了能使其正常工作並進行檢測，需要在步驟SlO完成的納米金電極上固定DNA探針；其中DNA探針可以通過現有常規技術固定在金電極表面，但是在本發明中為了使探針的特異性，採用本發明如下定向錨定技術進行DNA探針的固定，包括:
[0050]S31，電極活化:將所得的納米金電極分別用HNO3溶液、丙酮和純水清洗，乾燥；[0051 ] S32，形成羥基單分子層:室溫下，將納米金電極用巰基乙酸溶液浸泡處理後，清洗乾燥，則納米金電極上形成羥基單分子層；
[0052]S33，將具有羥基單分子層的納米金電極於含有偶聯劑和單鏈的DNA探針的MES (pH優選6.5)溶液中浸泡處理；
[0053]S34,清洗、乾燥,低溫保存備用。
[0054]其中，步驟S31中因為納米金電極的表面極易發生鈍化，導致表面納米金顆粒的的結合力以及活性下降，因此本發明在使用時先將納米金電極用硝酸溶液進行清洗，將其表面的鈍化膜、有機物、無機物等去除，進行極化，使其電極達到能產生較好的電勢。
[0055]步驟S32和步驟S33中採用巰基乙酸對納米金電極進行處理，並在偶聯劑偶聯劑(EDAC，或者EDAC與NHS混合)作用下，使金電極表面形成自由-OH基團，自由-OH基團與探針DNA5』 -端磷酸基團通過共價鍵結合，將DNA探針的5』 -端定向錨定在金電極表面，避免了 DNA探針非特異性吸附。
[0056]並進一步在上述步驟S33中的DNA探針包括捕獲探針和二茂鐵標記的特異DNA雜交指示信號探針，捕獲探針設計本身與待測樣品中靶DNA的雜交，使待測樣品中靶DNA序列能結合在DNA探針上，那麼便實現檢測；而在捕獲探針之外，本發明DNA探針還包括用於雜交檢測的信號探針，該信號探針與雙鏈DNA中靶DNA序列的另一互補鏈為互補設計，檢測時捕獲探針和二茂鐵標記的特異DNA雜交指示信號探針分別與雙鏈DNA中的靶序列、以及靶序列互補序列互補識別，形成類似於脫氧核糖核苷酸單鏈「三文治」包夾結構，信號探針上標記有標記物根據標記物釋放的信號，根據反應中信號變化便可實現檢測樣品的目的。上述實施方式中DNA探針為根據已知的特異性基因進行設計，如果檢測中待測DNA樣品能與這一 DNA探針進行結合，那麼便可以認定待測的DNA即為該DNA探針所屬的靶序列類型；如果檢測中無法結合，那麼說明待測DNA的類型與DNA探針所述的靶序列類型不匹配，那麼可以更換DNA探針，重複檢測過程，直至能得出待測DNA的類型為止。
[0057]並且，本發明採用上述二茂鐵分子標記的信號探針進行電化學生物檢測，因為二茂鐵本身是一類具有夾心型結構的富電子化合物，在適當的電勢條件下，二茂鐵分子向電極表面轉移電子的效率有其餘電極表面距離遠近的影響，當距離靠近時，二茂鐵分子中的Fe(II)氧化為Fe(III)的電子轉移效率高，可獲得較高的氧化還原峰電流；當距離拉開時，其電子轉移效率降低，相應的峰電流減弱。因此，充分利用二茂鐵分子電子轉移效率對距離的依賴性和分子識別元件與目標物結合前後的構象變化，可實現對不同目標物的檢測。二茂鐵在鄰近雜交效應的研究中，對目標DNA檢測的線性範圍可達lfM。因此採用二茂鐵作為信號探針的電信號檢測指示劑，使本發明中檢測的結果，還能大大提高檢測靈敏度和準確度。
[0058]當然，需要指出的是，本發明上述製備的ITO-納米金電極其本身的納米金材質，容易被氧化和鈍化，因此在上述製備中進行清洗後乾燥時，需要在氮氣提供的保護氣氛氛圍下進行乾燥，避免其被氧化等。當然出於相同的目的，氮氣也可以採用同樣具有保護作用惰性等氣體替換皆可。並且在本發明中，上述步驟S30進行DNA探針固定在S20組裝成三電極之後進行；如果組裝直接進行使用，那麼DNA探針固定步驟也可在步驟S20組裝之前進行。
[0059]採用本發明上述製備方法，採用在ITO玻璃基材上形成納米金顆粒製成納米金電極，再將納米金電極用於三電極模板中的工作電極，即可同時實現光學和電化學的檢測。並且納米金電極採用納米壓印技術，在ITO玻璃基材上形成具有規則、有序、均勻排列或者分布的的納米金顆粒結構，提高LSPR傳感器對界面變化檢測的靈感度。
[0060]同時，進一步為了保證測量的準確，本發明採用定向錨定將DNA探針固定在納米金電極表面，避免了 DNA探針非特異性吸附，進一步提升了測量的準確性。
[0061]基於本發明上述雙重檢測生物晶片，本發明提出一種基於該雙重檢測生物晶片的DNA檢測方法，參考如下步驟進行:
[0062]S100,獲取待測DNA樣品；
[0063]S200，將待測DNA樣品添加至工作電極上，靜置後衝洗乾燥；
[0064]S300,雙重檢測，參見圖8所示:
[0065]用紫外分光光度計對雙重檢測生物晶片在400nm?800nm光波長內測量吸收光譜；
[0066]用差分脈衝伏安法測定雙重檢測生物晶片的電流峰譜。
[0067]在上述檢測過程中屬於樣品測試，在實施過程中可以再相同的條件下以相同的雙重檢測生物晶片不添加樣品作為對照組進行對比參考，或者將上述步驟S200之前，未添加待測DNA樣品時的雙重檢測生物晶片進行吸收光譜和電流峰譜檢測，將檢測的吸收光譜和電流峰譜作為未加樣的對照。
[0068]為了使本發明上述方法更加清楚並易於理解，以下通過實施例進行舉例說明:
[0069]實施例1
[0070]S11，選用厚度為1mm、直徑為Icm的ITO圓形玻璃基材，分別用氨水、乙醇和蒸餾水超聲清洗3分鐘，用氮氣吹乾；
[0071]在這一步驟中，採用將ITO玻璃基材為了電極組裝及電極製備方便，選擇為圓形；當然也可以根據所需用其他的規則或者不規則的形狀替換均可，並不僅僅限定於圓形形狀。
[0072]S12，在步驟Sll清洗後的ITO圓形玻璃基材上塗布單層壓印抗蝕劑如樹脂等，在ITO圓形玻璃基材上形成一樹脂層；
[0073]S13，獲取一壓印板，該壓印板的壓印面具有納米級的凸模型；將該壓印板的壓印面朝向樹脂層與ITO圓形玻璃基材壓合之後，再取掉壓印板，則在抗蝕層的表面上形成與凸模型適配的凹槽；
[0074]凹槽的形狀，在本發明中為了保證檢測中光譜的精確性，該凹槽的形狀優選為規則形狀，其尺寸大小為納米級；這些凹槽的數量為若干個，整體在抗蝕層表面上均勻、有序、規則的排列，可以提高LSPR傳感測量中對界面變化檢測的靈感度。
[0075]S14，將壓印有上述納米級凹槽的ITO圓形玻璃基材斜置45度，在樹脂層表面沉積一層20nm的金屬鉻(Cr)層；並且由於抗蝕層表面存在上述納米級凹槽，那麼金屬鉻(Cr)層沉積於樹脂層非凹槽的表面部位，凹槽部中則不會沉積上金屬鉻(Cr)層；該金屬鉻(Cr)層作為保護層，防止步驟S15中的等離子蝕刻導致樹脂層整體被蝕刻，而不能形成特定的納米金顆粒結構。
[0076]S15,將沉積有金屬鉻(Cr)層的ITO圓形玻璃基材置於洗膠機中，使用氧氣等離子體進行衝洗、刻蝕；那麼在衝洗、蝕刻的處理中，非凹槽表面具有金屬鉻(Cr)層保護，則這一部分的抗蝕層不會被蝕刻去除，而由於凹槽內表面沒有上述金屬鉻(Cr)層的沉積，那麼位於凹槽部分的樹脂層會被蝕刻去除，使ITO圓形玻璃基材相對於凹槽部位的裸露；
[0077]S16，在步驟S15所形成的ITO圓形玻璃基材的表面裸露部位上進行電子束蒸鍍，將20nm Au顆粒均勻蒸鍍，使ITO圓形玻璃基材的表面裸露部位生成一層Au膜；
[0078]S17，當然由於採用蒸鍍的方式進行，那麼在殘留的抗蝕層表面上也會生成Au膜；那麼再用氧氣等離子體處理，除去殘餘的樹脂層整體除去，那麼便能在ITO圓形玻璃基材表面形成均勻、有序、規則排列的納米金顆粒；即為本發明納米金電極。
[0079]進一步採用本發明上述雙重檢測生物傳感晶片進行檢測，需要先固定探針後再添加待測DNA樣品進行檢測，步驟示例如下:
[0080]S31，電極活化:將所製得的納米金電極分別用HN03(1:1)溶液、丙酮和純水超聲清洗2分鐘後，氮氣吹乾；
[0081]S32，室溫下，將ITO-納米金電極在40mmol/L的巰基乙酸溶液中浸泡6小時，用超純水衝洗電極2分鐘，氮氣吹乾，使ITO-納米金電極上形成羥基單分子層；
[0082]S33,步驟S32所得電極浸泡在40mmol/L MES (包含lmg/ml EDAC和lmg/ml單鏈DNA探針)pH = 6.5的DNA固定緩衝液中，25°C處理24小時；
[0083]其中在這一步驟中單鏈DNA探針採用根據人HIV病毒基因組設計捕獲探針和信號探針:
[0084]捕獲探針TCATTGATGGTCTCTTTTAACA-SH(5』-3』)；
[0085]信號探針[Fe]C [Fe] G [Fe] C [Fe] GCTTA [Fe] C [Fe] G [Fe] C [Fe] G (EO) 3TTTGCATGGCTGCTTGATGTC(5』-3』)；
[0086]S34，將步驟S33獲得的電極用40mmol/L MES pH = 6.5清洗3遍，去除游離未固定的單鏈DNA探針分子，氮氣吹乾，低溫保存備用；
[0087]本發明上述納米金電極固定好DNA探針之後,初步僅能實現納米金顆粒的局域表面等離子共振的光學檢測，為了使其還能在電化學檢測中實現其功能，那麼將納米金電極作為工作電極安裝於三電極模板上，輔助電極選擇鉬，參比電極為Ag/AgCl電極，共同組成三電極體系，組裝成本發明雙重檢測生物傳感晶片。
[0088]採用上述組裝成雙重檢測生物傳感晶片進行檢測的步驟參考下述步驟進行:
[0089]S100，取I μ I待測DNA樣品(這一實施例1中含有本發明所篩選的把金銀序列HIV target-sequence)；
[0090]在這一步驟中DNA待測溶液作為樣品，可以採用現有的試劑盒從待測的細菌、組織細胞等提取。
[0091]S200，採用本發明中的雙重檢測生物傳感晶片進行檢測時，分兩組進行；
[0092]實驗組:取上述步驟SlOO中的待測DNA樣品，滴加至雙重檢測生物傳感晶片的工作電極上，室溫靜置I小時；使用washing buffer衝洗電極後，並用氮氣流乾燥；
[0093]對照組:在雙重檢測生物傳感晶片的工作電極上滴加不含上述目標HIVtarget-sequence的溶液(在這裡可以是緩衝液、或者是其他DNA溶液)；
[0094]S300，參見圖X所示，進行LSPR和CV雙重傳感晶片雙重檢測；分別使用紫外分光光度計對實驗組和對照組的工作電極在400nm?800nm光波長內測量其吸收光譜；觀察此時光譜與空白對照(不含有HIV target-sequence)的LSPR的光譜吸收峰的變化；
[0095]並且使用差分脈衝伏安法測定實驗組和對照組的電流峰。
[0096]採用上述實施例1的檢測方式，在LSPR的光譜吸收峰的結果對比中，實驗組的吸收峰相機對照組的吸收峰發生了向右移動，則表明DNA與LSPR傳感器表面固定的探針發生互補配對結合，即表明所檢測樣品中含有該檢測探針所對應的靶序列。
[0097]而在對照組測量中LSPR的光譜吸收峰若吸收峰未出現移動，則表明DNA與LSPR傳感器表面固定的探針沒有特異性結合，即表明所檢測樣品中沒有含有該DNA探針所對應的靶序列；當然在測量過程過中也偶爾出現實驗組的吸收峰相比對照組向左移動，則是因為被固定的DNA探針在檢測或者洗脫的過程中脫落，因此導致峰譜向左移動，那麼需要重新按照上述S31?S34進行探針固定，然後進行檢測。當然，在本發明檢測過程中，為了避免單次檢測中的偶發情形對檢測的結果產生偏差，因此上述檢測過程中可以測試的實驗組可以做2?3個重複，那麼良好的重複性結果更加有助於檢測結果的準確分析。
[0098]同時在電化學檢測結果中，實驗組在0.2?0.4V之間可以檢測到一個明顯的氧化還原峰，而對照組相比無該氧化還原峰。因為在實驗組中捕獲探針、目標DNA、信號探針三者相互結合使得信號探針上的二茂鐵分子能貼近電極表面，此時使用電化學工作站用差分脈衝伏安法對工作電極進行檢測時，由於二茂鐵分子的電化學性質，該電極在0.2?0.4V之間可以檢測到一個明顯的氧化還原峰。而若存在的目標DNA不能與捕獲探針和信號探針，則二茂鐵分子無法被固定在電極產生電化學反應，工作站也無法檢測到氧化還原峰。
[0099]整體上採用本發明同時結合LSPR與電化學的檢測結果，可以減少樣品檢測中的假陽性，對檢測中質量控制起到了非常重要的作用。
[0100]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包括在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種雙重檢測生物傳感晶片，包括襯底，以及設置於所述襯底上三電極體系，所述三電極體系包括生物傳感電極、輔助電極和參比電極，其特徵在於，所述生物傳感電極為納米金電極，所述納米金電極包括設置於所述襯底上的透明導電基底，該透明導電基底表面上設有若干規則排布的納米金顆粒。
2.如權利要求1所述的雙重檢測生物傳感晶片，其特徵在於，所述納米金電極上固定有DNA探針。
3.如權利要求2所述的雙重檢測生物傳感晶片，其特徵在於，所述DNA探針包括與待測靶DNA鏈互補的DNA捕獲探針、以及與靶DNA鏈的互補鏈互補並標記有二茂鐵的信號探針。
4.如權利要求1至3任一項所述的雙重檢測生物傳感晶片，其特徵在於，所述納米金顆粒的尺寸為20?80nm。
5.一種權利要求1至4任一項所述的雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: 製備納米金電極； 以所述納米金電極作為工作電極，與輔助電極和參比電極組裝成三電極體系。
6.如權利要求5所述的雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，其特徵在於，所述製備納米金電極包括如下步驟: 獲取透明導電基底； 在所述透明導電基底表面形成抗蝕層； 獲取壓印板，該壓印板的壓印面具有納米級尺寸的凸模型； 將所述壓印板與設有抗蝕層的透明導電基底壓合，使抗蝕層表面形成與凸模型適配的凹槽； 在所述抗蝕層的非凹槽表面形成保護層； 將具有所述保護層和抗蝕層的透明導電基底進行等離子刻蝕處理，使位於凹槽部分的抗蝕層被刻蝕去除以及位於凹槽部的透明導電基底表面裸露； 在所述位於凹槽部的透明導電基底的裸露表面上生成Au膜； 除去所述透明導電基底殘留的抗蝕層。
7.如權利要求6所述的雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，其特徵在於，在所述位於凹槽部的透明導電基底的裸露表面上生成Au膜步驟中，採用電子束蒸鍍方式生成所述Au膜。
8.如權利要求5至7任一項所述的雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，其特徵在於， 在以所述納米金電極作為工作電極，與輔助電極和參比電極組裝成三電極體系步驟之後，還包括在所述納米金電極上固定DNA探針步驟； 或 在製備所述納米金電極步驟之後，組裝成三電極體系的步驟之前還包括在所述納米金電極上固定DNA探針步驟。
9.如權利要求8所述的雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，其特徵在於，在所述納米金電極上固定DNA探針包括: 將所述納米金電極進行活化處理； 將活化處理後的所述納米金電極用巰基乙酸溶液浸泡處理； 將巰基乙酸處理後的所述納米金電極置於含有偶聯劑和DNA探針的MES溶液浸泡處理，使DNA探針與所述納米金電極結合。
10.如權利要求9所述的雙重檢測生物傳感晶片的製備方法，其特徵在於，所述偶聯劑為EDAC或EDAC與NHS兩種組合。
11.一種基於權利要求1至4任一項所述的雙重檢測生物傳感晶片的DNA檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟: 獲取待測DNA ； 將待測DNA添加至雙重檢測生物傳感晶片的工作電極上； 檢測加樣後的雙重檢測生物晶片在400nm?800nm光波長內的吸收光譜，以及用差分脈衝伏安法測定雙重檢測生物晶片的電流峰譜。
【文檔編號】C12Q1/68GK104280365SQ201410329297
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】李科錚, 吳宇亮, 於洪宇 申請人:深圳威芯華創科技有限公司