石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物及其設計方法
2023-05-22 08:42:41 3
專利名稱：石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物及其設計方法
技術領域：
本發明涉及一對PCR引物(名稱為G-dloop)，尤其是涉及一種主要用於能特異地擴增大多數石斑魚類線粒體基因組高變異區(即控制區)的擴增引物。
背景技術：
由於動物線粒體DNA(mtDNA)具有結構簡單、嚴格的母系遺傳、幾乎不發生重組、進化速度快且不同區域進化速度存在差異等特點，使其在種類鑑別和分類地位的研究方面應用十分廣泛。線粒體基因組由37個編碼基因及一段主要的非編碼區(控制區)組成，不同序列區域的進化速率不同。其中進化速率最快的是控制區，它適於親緣關係較近的群體間的比較研究。
當前通過序列差異來鑑別外型上相似的魚類是一種十分便利準確的方法，其中線粒體控制區序列差異的研究，如應用於種類鑑別和分子系統進化分析等，國內外已有一些相關報導，主要有1)rnachez L，Danzamann R D.Congruence in control～region brook charr(Salvelinusfontinalis)[J].Mol Biol Evol，1993，101002～1014.
2)Zhu D，Jamieson B G M，Hugall A，et al.Sequence evolution and phylogenetic signal incontrol～region and cytochrome b sequences of rainbow fishes(Melantotaeniidae)[J].Mol BiolEvol，1994，11672～683.
3)Alex P，Kornfied I.Evolution of the mitochondrial DNA control region in the mbuna(Cichlidae)species flock of Lake Malawi，East Africa[J].J Mol Evol，1997，4570～83.
4)鄭冰蓉，等.鯉屬魚類mtDNA控制區D環區序列的變異性分析.水產學報，2002，26(4)289～294.
5)胡文革，等.新疆3種雅羅魚線粒體DNA控制區序列的差異和系統進化關係.遺傳學報，2004，31(9)970～975.
6)張燕，等.中國鱨科魚類線粒體DNA控制區結構及其系統發育分析.水生生物學報，2003，27(5)463～467.
石斑魚種間外部形態相似，為其種類鑑定帶來極大困擾。而其遺傳上也具有異常相近的親緣關係，因此只有選擇進化速度最快的線粒體基因組高變異區(即控制區或稱D-LOOP環)才能最有效進行近緣種間甚至同種不同群體間的鑑別。然而石斑魚線粒體基因組高變異區兩端序列較為特化，使用已報導的其他物種線粒體基因組高變異區擴增引物，如L15926(Kocher et al.，1989)、H16498(Meyer et al.，1990)、L16518(Meyer)等均無法對其進行有效擴增。
發明內容
本發明旨在提供一對可高效擴增大多數石斑魚類線粒體基因組高變異區的擴增引物及其設計方法。
本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物(G-dloop)由兩條單鏈寡聚核苷酸組成，其中輕鏈引物G-dloop(L)有22個鹼基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AACC，位於tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個鹼基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTG TGC，其中一個為簡併鹼基，位於12SrRNA基因3』起始端。
本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法其步驟為1)登陸Genebank搜索脊椎動物線粒體DNA細胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區，經同源比對，獲得一對擴增引物為輕鏈28-For5』-CGA ACG TTG ATA TGA AAAACC ATC GTT G-3』；重鏈16S-brh5』-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3』，其擴增範圍包括線粒體基因組中細胞色素b基因、控制區(即高變異區)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉運RNA基因和間隔區序列，擴增片段大小在4.5～5.5kb之間。
2)採用步驟1)中所述的擴增引物，通過長PCR方法擴增獲得32種石斑魚類的目的片段，片段大小在4.5～5.5kb之間，最後32種石斑魚類均擴增獲得了單一的目的DNA片段，產物大小為4.5～5.5kb，對所得的32種石斑魚類的擴增產物進行測序。
3)使用同源比對軟體Clustal X 1.83對所得序列進行比對，找出32種石斑魚類線粒體基因組細胞色素b 5』端及12S rRNA 3』端的保守序列，並利用簡併性原則，設計出石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物(G-dloop)。
本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的應用主要有種類鑑定、地理種群鑑別和種質資源評估等方面。
本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物(G-dloop)對32種石斑魚(32種石斑魚是實驗組歷時3年，於我國東南沿海海岸線採集所得32種石斑魚樣本，基本涵蓋了分布於我國近海的石斑魚類群)進行PCR擴增，均能獲得片段大小在1000～1200bp之間的特異性擴增產物，經測序及與Genbank上同源序列的比較，證實為包含線粒體基因組高變異區全序列的擴增產物。從而為我國石斑魚類的種類鑑定、地理種群鑑別和種質資源的評估提供了一個有力的工具。使用引物G-dloop的PCR擴增，最突出的優點在於可以快速地對某些難於鑑別的近緣種進行準確鑑定，此外，還可以在我國石斑魚類的地理種群鑑別和種質資源及群體遺傳多樣性評估發揮重要作用。
具體實施例方式
本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物(G-dloop)由兩條單鏈寡聚核苷酸組成，其中輕鏈引物G-dloop(L)有22個鹼基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AACC，位於tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個鹼基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTG TGC，其中一個為簡併鹼基，位於12SrRNA基因3』起始端。
上述引物對32種石斑魚進行PCR擴增，均能獲得片段大小在1000～1200bp之間的特異性擴增產物，經測序及與Genbank上同源序列的比較，證實為包含線粒體基因組高變異區全序列的擴增產物。從而為我國石斑魚類的種類鑑定、地理種群鑑別和種質資源的評估提供了一個有力的工具，通過使用引物G-dloop的PCR擴增，使得在分子水平上快速準確高效地對我國石斑魚類的種類鑑定、地理種群鑑別和種質資源評估成為現實。
本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物採用以下方法設計1)登陸Genebank，(網址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov，全稱是National Center forBiotechnology Information，該網站收錄有當今世界上所有已公開的基因序列)搜索脊椎動物線粒體DNA細胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區，經同源比對，獲得一對擴增引物為輕鏈28-For5』-CGA ACG TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3』；重鏈16S-brh5』-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3』，其擴增範圍包括線粒體基因組中細胞色素b基因、控制區(即高變異區)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉運RNA基因和間隔區序列，擴增片段大小在4.5～5.5kb之間。
上述擴增引物其主要用處在於擴增出包括所需的目的(即高變異區)序列及其前後基因序列，為高變異區引物的設計奠定基礎。
2)採用步驟1)中所述的擴增引物，通過長PCR方法擴增獲得32種石斑魚類的目的片段，片段大小在4.5～5.5kb之間，部分擴增特異性較差的種類通過降落PCR法提高其特異性，最後32種石斑魚類均擴增獲得了單一的目的DNA片段，產物大小為4.5～5.5kb，對所得的32種石斑魚類的擴增產物進行測序。所涉及的32種石斑魚類為1寶石石斑魚、2布氏石斑魚、3雙棘石斑魚、4長棘石斑魚、5赤點石斑魚、6玳瑁石斑魚、7電紋石斑魚、8鮭點石斑魚、9黑邊石斑魚、10六帶石斑魚、11吻斑石斑魚、12小點石斑魚、13斜帶石斑魚、14點帶石斑魚、15網紋石斑魚、16鑲點石斑魚、17雲紋石斑魚、18縱帶石斑魚、19褐點石斑魚、20褐石斑、21青石斑、22駝背鱸、23寬額鱸、24側牙鱸、25波紋鰓棘鱸、26橫帶九棘鱸、27紅九棘鱸、28臺灣九棘鱸、29斑點九棘鱸、30豹紋鰓棘鱸、31橫斑鰓棘鱸、32鱖魚。
長PCR方法即通過調整PCR反應條件最終獲得較長的PCR產物。所述的調整反應條件是指降低變性溫度、延長延伸時間(變性溫度從53℃可降到48℃，延伸時間可延長至3.5min)及使用雙酶系統。所述的部分擴增特異性較差即擴增產物量少，並有其他非目的片段的PCR產物存在，表現為擴增出非單一的條帶。所述的降落PCR法即在PCR反應最初幾個循環退火溫度從一個較高溫度逐漸下降，可有效抑制非特異性產物的擴增。
3)使用同源比對軟體Clustal X 1.83對所得序列進行比對，找出32種石斑魚類線粒體基因組細胞色素b的保守序列，並利用簡併性原則，設計出石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物(G-dloop)。
同源比對軟體Clustal X 1.83可在生物軟體網http//www.bio-soft.net/下載。Clustal X 1.83是用來對核酸與蛋白序列進行多序列同緣比對的軟體。由於高變異區序列正好位於細胞色素b基因和12S rRNA基因之間，因此用於設計引物的兩段保守序列分別位於高變異區的兩端，在細胞色素b 5』端及12S rRNA 3』端。簡併性原則是指一種胺基酸可由2種以上密碼子編碼，因此某個鹼基(特別是第三密碼子位置)的替換並不影響編碼胺基酸，因此對引物中存在高變異的位點使用兩個以上的不同鹼基，可克服部分模板由於發生鹼基替換而導致引物的不匹配。
以下就本發明所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的應用作進一步的說明。其應用主要有種類鑑定、地理種群鑑別和種質資源評估等方面。
(1)種類鑑定方面的應用①對32種石斑魚進行PCR擴增，得到的擴增產物片段大小在1000～1450bp，種間序列歧異度在6.1％～23.5％。
②對近緣種斜帶石斑魚與點帶石斑魚序列進行PCR擴增，得到的擴增產物片段大小在1000～1200bp，兩者之間的種間序列歧異度為8.3％。
③對近緣種雲紋石斑魚與褐石斑魚序列進行PCR擴增，得到的擴增產物片段大小在1200bp左右，兩者之間的種間序列歧異度為6.1％。
(2)地理種群鑑別方面的應用
對赤點石斑魚7個地理種群序列進行PCR擴增，得到的擴增產物片段大小在1350bp左右，不同地理種群間序列歧異度在2.3％～4.7％。
(3)種質資源評估方面的應用對斜帶石斑魚3個人工繁育群體序列進行PCR擴增，得到的擴增產物片段大小在1050～1070bp，3個種群之間的序列歧異度在1.4％～2.5％，單倍型多樣性為0.728，核苷酸多樣性為0.0105，群體間的分化係數為0.0766，說明這三個群體的多樣性水平都較高，群體間存在明顯的基因交流。
以下給出石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的應用實例。
(1)對32種石斑魚進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min，進入30個循環94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最後72℃延伸7min。得到的擴增產物片段大小在1000～1200bp，膠回收純化並測序，序列通過Genetyx軟體(可在http//www.sdc.co.jp下載)進行同源比較，種間序列歧異度在6.1％～23.5％。
所述的Genetyx軟體即可進行兩個序列間的同源比較並對序列進行分析的軟體。
(2)對近緣種斜帶石斑魚與點帶石斑魚序列進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min，進入30個循環94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最後72℃延伸7min。得到的擴增產物片段大小在1000～1200bp，膠回收純化並測序，序列進行同源比較，其種間序列歧異度為8.3％。
(3)對近緣種雲紋石斑魚與褐石斑魚序列進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min，進入30個循環94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最後72℃延伸7min。得到的擴增產物片段大小在1200bp左右，膠回收純化並測序，序列進行同源比較，其種間序列歧異度為6.1％。
(4)對赤點石斑魚7個地理種群序列進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min，進入30個循環94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最後72℃延伸7min。得到的擴增產物片段大小在1350bp左右，膠回收純化並測序，序列進行同源比較，不同地理種群間序列歧異度在2.3％～4.7％。
(5)對斜帶石斑魚3個人工繁育群體序列進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min，進入30個循環94℃變性30s，48～53℃退火45s，72℃延伸45s；最後72℃延伸7min。得到的擴增產物片段大小在1050～1070bp，膠回收純化並測序，序列進行同源比較，群體間序列歧異度在1.4％～2.5％。
以下給出本發明中所涉及的序列1.石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物(G-dloop)輕鏈引物G-dloop(L)有22個鹼基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AAC C，位於tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個鹼基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTGTGC，其中一個為簡併鹼基，位於12SrRNA基因3』起始端。
2.長PCR擴增引物為輕鏈28-For5』-CGA ACG TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3』；重鏈16S-brh5』-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3』，其擴增範圍包括線粒體基因組中細胞色素b基因、控制區(即高變異區)、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉運RNA基因和間隔區序列，擴增片段大小在4.5～5.5kb之間。
權利要求
1.石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物，其特徵在於由兩條單鏈寡聚核苷酸組成，其中輕鏈引物G-dloop(L)有22個鹼基CAG AGC GCC GGT CTT GTA AAC C，位於tRNA-Thr基因上，重鏈引物G-dloop(H)有21個鹼基GTC AGG ACC AA(A/G)CCT TTGTGC，其中一個為簡併鹼基，位於12SrRNA基因3』起始端。
2.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於其步驟為1)登陸Genebank搜索脊椎動物線粒體DNA細胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區，經同源比對，獲得一對通用引物為輕鏈28-For5』-CGA ACG TTG ATA TGA AAAACC ATC GTT G-3』；重鏈16S-brh5』-CCG GTC TGAACT CAG ATC ACG T-3』，其擴增範圍包括線粒體基因組中細胞色素b基因、控制區或高變異區、12S rRNA基因、16S rRNA基因及它們之間的轉運RNA基因和間隔區序列，擴增片段大小為4.5～5.5kb；2)採用步驟1)中所述的通用引物，通過長PCR方法擴增獲得32種石斑魚類的目的片段，片段大小為4.5～5.5kb，最後32種石斑魚類均擴增獲得了單一的目的DNA片段，產物大小為4.5～5.5kb，對所得的32種石斑魚類的擴增產物進行測序；3)使用同源比對軟體Clustal X 1.83對所得序列進行比對，找出32種石斑魚類線粒體基因組細胞色素b 5』端及12S rRNA 3』端的保守序列，並利用簡併性原則，設計出石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物。
3.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟2)中，所述的長PCR方法即通過調整PCR反應條件最終獲得較長的PCR產物。
4.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟2)中，所述的調整反應條件是指降低變性溫度、延長反應時間及使用雙酶系統，所述的延長反應時間是做梯度dT＝0.3℃，時間梯度dt＝10s。
5.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟2)中，所述的部分擴增特異性較差即擴增產物量少，並有其他非目的片段的PCR產物存在，表現為擴增出非單一的條帶。
6.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟2)中，所述的降落PCR法即在PCR反應最初幾個循環退火溫度從一個較高溫度逐漸下降，可有效抑制非特異性產物的擴增。
7.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟3)中，所述的同源比對軟體Clustal X 1.83在生物軟體網http//www.bio-soft.net/下載。
8.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟3)中，所述的保守序列的高變異區位置介於細胞色素b與12S rRNA之間。
9.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物的設計方法，其特徵在於在步驟3)中，所述的簡併性原則是指一種胺基酸由至少2種密碼子編碼。
10.如權利要求1所述的石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物在種類鑑定、地理種群鑑別和種質資源評估方面的應用。
全文摘要
石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物及其設計方法，涉及一對PCR引物(名稱為G－dloop)，提供一對可高效擴增大多數石斑魚類線粒體基因組高變異區的擴增引物及其設計方法。擴增引物由兩條單鏈寡聚核苷酸組成。登陸Genebank搜索脊椎動物線粒體DNA細胞色素b基因及16S rRNA基因序列的高保守區，經同源比對，獲得一對擴增引物，通過長PCR方法擴增獲32種石斑魚類的目的片段並進行測序。使用同源比對軟體Clustal X 1.83對所得序列進行比對，找出32種石斑魚類線粒體基因組細胞色素b5』端及12S rRNA 3』端的保守序列，並利用簡併性原則，設計出石斑魚類線粒體基因組高變異區擴增引物。
文檔編號C12Q1/68GK1900318SQ20061009393
公開日2007年1月24日 申請日期2006年6月23日 優先權日2006年6月23日
發明者丁少雄, 杜佳瑩, 王軍, 蘇永全 申請人:廈門大學