一種新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的製備與應用的製作方法

2023-05-22 03:44:26 2

一種新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的製備與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於白喉毒素分子（DT）效應基團DT390與腫瘤轉移靶向性多肽TMTP1的三個重複序列的可靶向高轉移腫瘤的新型重組融合蛋白及其製備方法，它是由白喉毒素蛋白效應基團、具有靶向高轉移腫瘤導向肽TMTP1的三個重複串聯序列和融合的His表達標籤組成，其中DT390是白喉毒素第1-390個胺基酸。所述高轉移腫瘤靶向的可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1是在大腸桿菌BL21中用37℃誘導方法實現可溶性表達，並用針對His標籤的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解後獲得純的DT390-triTMTP1蛋白。該融合蛋白可通過更大程度上達到靶向性殺滅腫瘤細胞的治療目的，對正常細胞無明顯影響，而對於有高轉移潛能的腫瘤細胞，包括前列腺癌和胃癌，有顯著的抑制增殖和誘導凋亡的效應，對受試的所有腫瘤動物模型均具顯著的治療作用，並可有效抑制腫瘤轉移，且對動物無明顯的治療相關毒性，並為後繼其他分子治療提供一種新的設計模式。
【專利說明】—種新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的製備與應用
【技術領域】[0001]本發明涉及一種新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl的製備與應用，其技術特徵在於:構建白喉毒素分子(DT)效應基團DT390與腫瘤轉移靶向性多肽TMTPl的三個重複序列串聯(即GG/VKK湖GGGGSyVKK湖GGGGSyVKK湖)的重組原核表達載體，並進行重組蛋白的製備、表達、純化與復性。經體內外實驗證實該新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl可作為抗腫瘤藥物，能選擇性殺傷腫瘤細胞，有效地抑制腫瘤的生長與轉移，且對正常細胞和組織沒有明顯的毒副作用。本
【發明內容】
屬於醫藥生物【技術領域】。
[0002]
【背景技術】
[0003]惡性腫瘤嚴重威脅廣大人民的健康與生命，全球每年癌症新發病例約有1000萬例，因癌症導致死亡的病例約700萬。而轉移是腫瘤細胞播散的早期事件，是導致惡性腫瘤難以根治和高死亡率的重要原因。有效控制腫瘤轉移就意味著顯著改善腫瘤患者的生存期。臨床上治療惡性腫瘤的常規方法主要包括手術，化療，放療等。手術是早期惡性腫瘤患者的首選治療手段，化療是最常用的輔助治療手段，能發揮清除手術殘餘病灶或轉移灶的作用。化療與手術聯用，能較好的控制多種類型惡性腫瘤。但是，化療藥物會引起明顯的全身性毒副作用和患者的不良反應，且多療程的重複化療容易引起腫瘤細胞的耐藥性，抵抗化療藥物的作用。隨著全球老齡化社會的到來以及腫瘤發病率的不斷上升，降低惡性腫瘤傳統的治療方法復發率，提高腫瘤治療的有效率是目前對治療惡性腫瘤的迫切要求。臨床上迫切需要研發一些藥物針對常規治療效果不理想的難治性腫瘤(高轉移性腫瘤，耐藥性腫瘤)。靶向治療藥物應運而生，其目的是提高病灶局部的藥物濃度，減少藥物毒副反應，降低用藥劑量，使藥物能安全有效的發揮作用。
[0004]分子靶向治療作為近年來的一項新興技術，引起腫瘤界的極大關注。目前放療和化療等常規輔助腫瘤在殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也有不同程度的損傷，從而引起腫瘤治療毒副作用，嚴重者可影響治療進行、甚至危及患者生命，因此應用多肽進行腫瘤靶向性生物治療是目前腫瘤生物治療發展的方向。在臨床上，大多數化療藥物並不是優先在腫瘤病灶濃聚。有研究表明，到達腫瘤灶的化療藥物的總量只佔正常組織的5%~10%，同時化療藥物的毒副作用常常限制了化療藥物的最佳使用量，最終導致化療不完全、早期復發和化療耐藥。迄今，已有許多優化方法被使用來提高化療藥物的選擇毒性，如化療藥物的包被，單克隆抗體或腫瘤特異性受體/肽配體的導向等等。目前分子靶向診治的手段主要有兩類:單克隆抗體和祀向性多肽(Homing peptide)。祀向性多肽(homing peptide)是目前
認為比較理想的一種腫瘤診斷和靶向性治療的載體，較單克隆抗體而言，其優點為:4血漿清除速度快、高親和力、高特異性良好的組織穿透性，能被腫瘤細胞攝取；3易於化學合成和低免疫原性的特點。近十餘年，國內外研究者應用肽庫技術針對不同的靶點進行不同的腫瘤靶向肽篩選，例如Arap W等對乳腺癌荷瘤小鼠進行肽庫篩選後獲得一系列與腫瘤血管特異性結合的短肽，其中的RGD序列被證實可與整合素結合，可特異性靶向多種腫瘤。在巨大的醫療需求的推動下，利用導向肽製備用於腫瘤診斷、治療的造影劑、藥物和製備基因治療載體製劑將有可能在數年內正式上市成為臨床治療藥物，成為腫瘤現有治療體系的一個不可缺少的組成部分，為腫瘤問題的最終解決帶來了新的希望。Arap W利用RGD序列與阿黴素交聯後應用於荷瘤小鼠，發現藥物的抗腫瘤療效顯著增加而毒性作用明顯減少。新近對新多肽SP94與脂質體阿黴素交聯後應用於肝癌重度聯合免疫缺陷荷瘤小鼠的研究發現，優化藥物釋放系統增加腫瘤細胞的凋亡和降低腫瘤血管生成，從而顯著增加抗瘤效應。
[0005]免疫毒素是蛋白毒素分子(植物毒素、細菌毒素、真菌毒素、動物毒素等)與來自免疫系統的靶向分子(單克隆抗體、免疫球蛋白、生長因子等)通過化學連接或者基因工程技術偶聯形成的融合毒素。近年來，隨著基因工程技術的發展，一般都是採用該技術構建毒素分子與靶向分子的融合基因，然後再表達和純化融合蛋白。常用的毒素分子通常來自細菌毒素的白喉毒素(DT)或假單胞菌外毒素(PE)。靶向性融合毒素為惡性腫瘤患者提供了一種令人鼓舞的全新治療方法。尤其是一些對放療，化療等傳統治療效果不理想的患者，應用靶向性融合毒素治療的意義更為深遠。靶向性融合毒素治療策略很簡單:攜帶了毒素蛋白的靶向分子能識別並結合腫瘤細胞，然後進入細胞內，由毒素蛋白發揮毒性殺死細胞。多種不同的靶向分子都能用於製備靶向性融合毒素，如能識別腫瘤細胞表面特異性表位的抗體分子，或者能夠識別並結合腫瘤細胞表面特殊受體的配體分子等。發揮細胞毒性作用的毒素分子通常來源於細菌(如白喉毒素DT或假單胞菌外毒素)或植物(如蓖麻毒素或相思豆毒素)。這些毒素通過不同作用機制抑制細胞蛋白質合成，引起細胞死亡。蓖麻毒素通過切斷核糖體，而白喉毒素和假單胞菌外毒素通過發揮ADP-核糖基化活性抑制細胞蛋內白質合成，最終導致細胞凋亡。因為融合毒素分子只能進入表面具有導向分子識別和結合受體的細胞。所以理論上這種靶向融合毒素能選擇性的最大程度殺傷腫瘤細胞，同時降低治療的副反應。
[0006]白喉毒素是一種毒性十分強大的細胞毒素。天然的白喉毒素分子能廣譜殺傷真核細胞，通過其天然受體結合域(R區)與哺乳類動物細胞表面的肝素結合表皮生長因子受體結合，經過胞吞作用，被運輸到酸性吞噬小泡，進行PH值依賴性的構型改變,酶活性域(C區)被剪切並釋放到胞內。胞內的酶活性域通過催化延長因子2的ADP核糖基化，弓丨起蛋白合成受到阻斷，細胞凋亡。近年來，靶向性融合毒素的開發和應用都發展迅速。通過基因工程技術將能選擇性靶向到惡性腫瘤細胞表面的配體取代白喉毒素天然受體結合域(R區)，產生大量截短或重組的白喉毒素融合蛋白。這些融合毒素代表一類新型的細胞毒性藥物。與化療藥物不同，白喉毒素類融合毒素通過靶向分子引起受體介導的內吞，選擇性的進入毒素敏感細胞內，引起靶細胞凋亡。迄今為止，基於白喉毒素的融合毒素主要包括:DT508-MSF，DT486-1L-2, DT390-GM-CSF，DT390-1L3，DT388-GM-CSF，DT388-1L-3，DT385-VEGF，以及DT388與μ PA的融合。這些融合毒素中，nT388_IL3在臨床試驗中取得了一些比較好的效果，然而只有DT389-1L2重組融合毒素(地尼白介素2)被美國FDA批准上市，用於治療成人皮膚T細胞淋巴瘤。
[0007]採用基因工程技術連接配體和毒素的策略不僅克服了化學連接方法的缺點，還展示了其如高精確度，更強的穩定性等優點。生產的白喉毒素類融合毒素已被用於腫瘤，傳染病，血液病的治療，部分藥物取得了很好的臨床療效。在毒素與配體之間增加一個連接物，通過更好的受體、配體間相互作用促使融合毒素髮揮更好的效應，與血清半衰期長的配體結合能使小分子量分子的半衰期延長，根據選擇性靶向腫瘤細胞表面高表達分子的策略製備的免疫毒素副作用小甚至沒有副作用，且對周圍正常組織顯示更好的安全性。
[0008]過去的幾十年中，學者們通過培養的細胞，動物模型，以及臨床病人研發了大量抗各種各樣惡性腫瘤的免疫毒素。其中，由生長因子或Fv片段作為導向分子構成的小分子融合毒素的效應最好。免疫毒素在體內外實驗中都顯示了良好的生物效應，但實際上，到目前為止，僅僅適用於實驗研究以及臨床上體外應用。Woo JH等人製備的雙價抗人T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv (MCHTl)將白喉毒素與兩個串聯的單鏈抗體sFv融合表達，結果顯示二價重組毒素的結合力是一價的七倍，而殺傷力增強至十倍。今後的臨床應用中可以將免疫毒素與多價的靶向分子聯用，以克服免疫毒素的低腫瘤滲透性，非特異性毒性和免疫原性等問題。研製開發出的靶向性抗腫瘤新型生物製劑，可有效彌補目前基因治療靶向性的不足；同時減輕對正常組織的毒副作用，從根本上改善基因治療的安全性問題，對高效、安全的靶向性治療藥物的研發具有指導意義，可望推動惡性腫瘤分子靶向治療的發展與進程。

【發明內容】

[0009]基於以上技術背景和重大的醫療需求，本發明將公開一種基於白喉毒素分子(DT)效應基團DT390與腫瘤轉移靶向性多肽TMTPl的三個重複序列串聯的可溶性融合蛋白及其製備方法，通過該方案獲得的可溶性融合蛋白具有高效靶向抑制高轉移潛能腫瘤生長與增殖、可有效抑制其轉移等明顯優勢，而對正常的細胞或組織沒有明顯的毒副作用，可以彌補目前腫瘤治療領域的不足之處，為將來腫瘤轉移的生物靶向治療提供新的選擇。
[0010]本發明的技術方案是:一種靶向高轉移潛能可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl，其特徵是:它是由白喉毒素蛋白效應基團、具有靶向高轉移腫瘤的導向肽TMTPl的三個重複序列和融合的His表達標籤組成；其中DT390是白喉毒素`第1-390個胺基酸。
[0011 ] 所述的DT390包含白喉毒素的催化區(酶活化區，第1-193位胺基酸)、跨膜轉運區(第205-379胺基酸);所述的具有靶向高轉移腫瘤的導向肽TMTPl是該可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的His表達標籤是該可溶性融合蛋白的氨基末端。
[0012]所述靶向高轉移腫瘤的可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl是在大腸桿菌BL21(DE3) plysS中用37°C誘導方法實現可溶性表達，並用針對His標籤的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解後獲得純的DT390-triTMTPl蛋白。
[0013]與現有的免疫毒素相比，本發明達到了以下效果:
I本可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl構建包含白喉毒素的第1_390位胺基酸及具有靶向高轉移腫瘤的導向肽TMTPl的三個重複序列，在理論上既保留了白喉毒素的殺傷效應，同時又發揮了腫瘤轉移導向肽TMTPl靶向效應。由於這種全新的設計，使這一新的構建體可更大程度上實現靶向性殺滅腫瘤細胞，達到抑制腫瘤細胞生長和轉移目的。此外，本發明也將為後繼其他分子治療提供一種新的設計模式。
[0014]2體外實驗結果表明，該可溶性融合蛋白對於有高轉移潛能的腫瘤細胞，包括前列腺癌和胃癌，有顯著的抑制增殖和誘導凋亡的效應，而對正常細胞無明顯影響。
[0015]3對腫瘤動物模型的體內模型研究證實，通過腹腔注射的用藥途徑，該可溶性融合蛋白對受試的所有腫瘤動物模型均具顯著的治療作用，並可有效抑制腫瘤轉移，且對動物無明顯的治療相關毒性。
[0016]4製備出腫瘤導向肽與白喉毒素的融合蛋白，作為一種有效的抗腫瘤的生物治療製劑，由於其既具有白喉毒素高效細胞毒性，又能在高轉移腫瘤細胞處富集，因此該新型可溶性融合蛋白具備臨床開發應用的前景， 比如在高轉移的晚期卵巢癌和胃癌等患者，作為一種新的生物治療策略。
[0017]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1、融合蛋白DT390-triTMTPl的構建示意圖；
圖2、融合蛋白DT390-triTMTPl的三維模擬圖；
圖3、融合蛋白DT390-triTMTPl的純化的電泳圖；
圖4、融合蛋白DT390-triTMTPl抑制腫瘤細胞的增殖；
圖5、融合蛋白DT390-triTMTPl誘導腫瘤細胞凋亡；
圖6、融合蛋白DT390-triTMTPl體內抗腫瘤生長作用；
圖7、融合蛋白DT390-triTMTPl體內對腫瘤轉移的抑制作用；
圖8、融合蛋白DT390-triTMTPl在裸鼠體內各臟器的分布
【具體實施方式】:
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0018]依照本發明的技術方案製備的三個重複序列的具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTPl與白喉毒素蛋白效應基團DT390融合蛋白，應用基因克隆技術，構建了三個重複序列的具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTPl與白喉毒素蛋白效應基團DT390的融合基因，並在大腸桿菌中獲得聞效表達。
[0019]實現本發明的三個重複序列的具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTPl與白喉毒素蛋白效應基團DT390融合蛋白的製備方法，按以下步驟製備:
(一)DT390-triTMTPl基因片段的獲得:
在DT390-triTMTPl引物兩端分別設計了限制性酶切位點Ndel和Xhol，以便定向克隆。並在下遊引物上設計了一段編碼三個TMTPl的序列。用上述引物從含有白喉毒素全長序列的質粒中PCR擴增，獲得DT390與TMTPl融合的基因片段，簡稱DT390_triTMTPl片段
1.PCR擴增目的基因:
根據白喉毒素第1-390位胺基酸序列，採用引物設計軟體Oligo 6.0，設計特異性擴增TMTPl-triDT390引物，在5』端分別加上Nde I和Xho I的酶切位點序列，引物序列為:上遊:5』 - CAT ATG GGC GCT GAT GAT GTT GTT G -3』
下遊:5』- CTC GAG ATT ATT GAC GCA CCA CGT TAG AAC CAC CAC CAC CTT GAC GCACCA CGT TTG AAC CAC CAC CAC CTT GAC GCA CCA CGT TAC CAC C -3』
以我室保存含白喉毒素的質粒作為模板:
PCR反應體系(50 μ I)
Taq 酶 IOXbuffer5 μ I
MgCl2 (25mM)3 μ I
dNTP (IOmM)I μ I
【權利要求】
1.一種新型靶向高轉移腫瘤的可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl的製備與應用，其特徵是:它是由白喉毒素蛋白效應基團、靶向高轉移腫瘤導向肽TMTPl的三個重複序列和融合的His表達標籤組成；其中DT390是白喉毒素第1-390個胺基酸。
2.根據權利要求1所述的一種新型靶向高轉移潛能可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl，其特徵是:所述的DT390包含白喉毒素的催化區(酶活化區，第1-193位胺基酸)、跨膜轉運區(第205-379胺基酸)；所述的可靶向高轉移腫瘤導向肽TMTPl是該可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的His表達標籤是該可溶性融合蛋白的氨基末端。
3.所述高轉移腫瘤靶向可溶性融合蛋白DT390-triTMTPl是在大腸桿菌BL21(DE3)PlysS中用37°C誘導方法實現可溶性表達，並用針對His標籤的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解後獲得純的DT390-triTMTPl蛋白。
4.DT390-triTMTPl的胺基酸序列:
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIGSLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAffAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLGGNVVRQGGGGSNVVRQGGGGSNVVRQ DT390-triTMTPl的核酸序列:
ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAACTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTcACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGaGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGGGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCgatAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGATGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTGGAGGAAACGTGGTGCGTCAAGGAGGAGGAGGATCAAACGTGGTGCGTCAAGGTGGTGGTGGTTCTAACGTGGTGCGTCAATAA。
5.權利要求1所述的新型重組可溶性融合蛋白在體外抑制腫瘤的增殖能力及誘導腫瘤細胞凋亡中的應用。
6.權利要求1所述的新型重組可溶性融合蛋白在抗腫瘤生長及抑制腫瘤轉移中的用途。
【文檔編號】C07K19/00GK103694357SQ201210365834
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年9月27日 優先權日:2012年9月27日
【發明者】馬丁, 王世宣, 盧運萍, 奚玲, 馬湘一 申請人:深圳市奧尼克斯基因技術有限公司