一種家禽飼養用免疫增強劑的製作方法
2023-05-21 22:08:01
專利名稱：一種家禽飼養用免疫增強劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於增強家禽免疫力的中藥複方製劑。
背景技術：
免疫增強劑是一類通過提高和促進動物體非特異性或特異性免疫功能來增強機體免疫應答、調節免疫功能，以達到防治疾病目的的物質。近年來，一些家禽由病毒感染所引發的免疫抑制日趨嚴重，呈擴散蔓延趨勢，因多 以亞臨床感染的形式出現而易被忽視。在我國雞群中免疫抑制性病毒的二重或多重感染存在一定的普遍性，降低雞群的免疫力，使一些過去容易控制的疾病變得難以控制。這些免疫抑制性病毒主要包括雞馬立克氏病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性貧血病毒、禽網狀內皮組織增生症病毒和禽白血病病毒等。在我國雞群中，免疫抑制性病毒的二重及多重感染具有普遍性。單一的免疫抑制性病毒感染往往不表現明顯的臨床症狀，使機體的免疫狀態受到抑制但不很嚴重，但當有兩種或兩種以上病毒同時感染同一個體時，則會使機體處於嚴重的免疫抑制狀態。崔治中等對從全國各地隨機收集到的疑似IBDV感染的60多個法氏囊樣品進行檢查發現，有相當高比例的樣品中分別存在著對雞馬立克氏病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性貧血病毒、禽網狀內皮組織增生症病毒不同組合的二重感染和多重感染，其中5個樣品中同時存在著以上4種病毒的感染。免疫抑制性病毒的二重或多重感染，因為共感染病毒間的相互協同作用而使機體處於嚴重的免疫抑制狀態，對新城疫(ND)等的疫苗接種不能產生足夠的保護性免疫應答，所以儘管在我國雞群中對ND採取高強度免疫，仍不能有效控制ND的流行，使一些病原難以從我國雞群中清除。另外，病毒的二重或多重感染可能引起病毒間基因發生重組，從而為產生新的病毒創造了條件。第三，處於免疫抑制狀態的雞群，感染細菌性疾病的機率明顯增加，並對細菌具有多重耐藥性。排除雞群免疫抑制，提高雞群疫苗免疫成功率，增加雞群抗病力已是目前養雞生產中急需解決的問題。隨著生物科學技術的迅猛發展和中藥免疫藥理學研究的不斷深入，具有我國傳統特色的中醫藥在畜禽疫病防治中顯示了無可比擬的優勢，中藥不僅可以促進疫苗的免疫效果(如王關林報導莪朮多糖對雛雞抗氧化能力和免疫功能的影響等)，還在預防和治療病毒性和細菌性疾病及排除免疫抑制方面均有明顯的作用(如劉家國報導中藥製劑抑制大腸桿菌生長和繁殖及陳德坤報導中藥提高對新城疫病毒的保護率等)。尤其是有關調節畜禽機體抵抗力的中藥，已顯示出了強大的生命力。補益類中藥一般都有增強機體免疫功能的作用，而對正常細胞毒副作用不明顯，是良好的生物反應調節劑。但這些研究尚屬初步，總的來說仍處於探索階段，存在一些缺陷。如許多研究都是只停留在對一般性指標粗淺的觀察上，過分重視對單味藥物的藥效研究，忽視機體免疫是複雜的作用過程和運用中醫理論進行中藥複方調節免疫的探索。如果能利用中藥複方作用多樣性的特點，開發出激發免疫效果的有效方劑，那麼不僅在中醫藥調節免疫方面將產生突破性進展，而且對於深入闡明中醫辯證施治及整體觀理論乃至促進中醫藥理論的發展都具有重要意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種家禽飼養用免疫增強劑，能夠對家禽尤其是雞的免疫力產生優良的促進作用，對機體黏膜免疫功能的影響尤為明顯。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案如下。一種家禽飼養用免疫增強劑，其按重量份數比包含黃芪30-45、女貞子30-40、黨參20-30、紅花8-12、白朮10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首烏10-15、麥冬10-12、當歸15-20、茯苓 15-20，刺五加 10-15。作為本發明的一種優選技術方案，上述家禽飼養用免疫增強劑按重量份數比包含黃芪38、女貞子35、黨參25、紅花10、白朮12，肉桂11、熟地 18、何首烏13、麥冬11、當歸17、茯苓18，刺五加12。作為本發明的一種優選技術方案，上述家禽飼養用免疫增強劑按重量份數比包含黃芪32、女貞子40、黨參21、紅花8、白朮15，肉桂10、熟地20、何首烏15、麥冬12、當歸15、茯苓20，刺五加10。作為本發明的一種優選技術方案，上述家禽飼養用免疫增強劑按重量份數比包含黃芪44、女貞子31、黨參29、紅花12、白朮11，肉桂12、熟地15、何首烏11、麥冬10、當歸20、茯苓15，刺五加15。作為本發明的一種優選技術方案，上述家禽飼養用免疫增強劑按重量份數比包含黃芪35、女貞子37、黨參25、紅花12、白朮12，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當歸18、茯苓18，刺五加12。作為本發明的一種優選技術方案，上述家禽飼養用免疫增強劑按重量份數比包含黃芪38、女貞子35、黨參29、紅花10、白朮10，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當歸18、茯苓15，刺五加10。採用上述技術方案所產生的有益效果在於①本發明按照〃扶正固本，補氣健脾，活血化淤〃的中獸醫理論，篩選出了提高禽類免疫力的免疫增強劑；試驗顯示(具體的試驗方法詳見下文)本發明的產品對雞T淋巴細胞亞群分類、淋巴細胞增殖、淋巴因子、漿細胞及其分泌SIgA含量、血細胞吞噬能力等均具有一定的促進作用，對家禽尤其是雞的免疫力具有優良的促進作用，對機體黏膜免疫功能的影響尤為明顯。②本發明的免疫增強劑能夠提高吞噬細胞能力0.26 (0D)、溶菌酶分泌水平13ii g/ml、腸道和氣管SIgA分泌水平0. 2以上(0D)、脾淋巴細胞誘生因子分泌水平3 (OD)(上述數值均為與空白對照相比的增高值)；雛雞飼餵本發明的本發明免疫增強劑5d後，環磷酸銨所引起的免疫抑制被排除，細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫功能恢復正常。③對本發明藥品的驗證試驗一、材料與方法I.材料I. I.本發明免疫增強劑的製備配方I (本發明配方)本課題組篩選黃芪38、女貞子35、黨參25、紅花10、白朮12，肉桂11、熟地18、何首烏13、麥冬11、當歸17、茯苓18，刺五加12，共12種市銷中藥組方，80目粉碎，在20-30°C、相對溼度70%左右的環境中存放。配方2 (對比配方)本課題組篩選野菊花10、黃芪25、山豆根20、桔梗15、車前子10、板藍根10、牛黃5、甘草5，共8種市銷中藥組方，80目粉碎，在20-30 V、相對溼度70%左右的環境中存放。I. 2傳染性法氏囊病毒(IBDV)製備將採用自然發生傳染性法氏囊病病雞法氏囊和脾臟按照李銀聚介紹的方法處理，製成IBD野毒。將其接種雞胚，測定IBD野毒的EID5Q。I. 3疫苗增效劑(中成藥)由河北省神康獸藥有限公司生產。I. 4環磷酸胺邯鄲市醫院惠贈。I. 5^3+、CT4+和⑶/單克隆抗體購於石家莊開創生化試劑銷售公司I. 610%犢牛血清購於石家莊生創生化試劑銷售公司 I. 7黃芪多糖購於重慶泰通動物藥業有限公司。I. 8葡萄糖試劑盒購於上海復星長徵醫學科學有限公司I. 9膽鹼酯酶試劑盒購於中生北控生物科技股份有限公司
I. 10飼料購於石家莊市正大集團2試驗設計2. I本發明免疫增強劑配方的篩選從石家莊市某雞場購I日齡雛雞80隻，雌雄各半。隨機將80隻I日齡肉雞分成I、II、III、IV共4組，每組20隻。試驗期間，每組隔離飼養，雞隻自由採食相同日糧，自由飲水，給予24h光照。20日齡時，按0. 1%劑量分別給III、IV組肉雞日糧中添加本發明的免疫增強劑或對比配方的中藥(見表1)，連用5天。然後給採用點眼、滴鼻、肌注方法給II、III、IV組肉雞用500 EID50 IBDV進行攻毒。攻毒前I天和攻毒後5天每組隨機選擇5隻雞，各採血5ml，按血漿糖皮質激素試劑盒說明書的要求進行處理，然後進行檢測；結果參見表I。2. 2本發明免疫增強劑劑量的篩選研究從石家莊市某雞場購I日齡雛雞120隻，雌雄各半。在7日齡進行2羽份新支120凍幹苗點眼；分別在10日齡、17日齡進行2羽份傳染性法氏囊疫苗滴嘴。按常規方法餵養和管理。隨機將120隻I日齡肉雞分成I、II、III、IV、VI、V共6組，每組20隻。I組作為正常對照組；II組作為免疫抑制對照組，只進行肌肉注射環磷酸胺；III、IV、V、VI組肉雞自7日齡至12日齡，向日糧中添加本發明的免疫增強劑或者疫苗增效劑(中成藥，由河北省神康獸藥有限公司生產)，同時於10日齡時腹部肌肉注射環磷酸胺80mg/kg體重，連用5天；試驗期為21d。於21日齡，每組隨機抽取5隻雛雞，空腹稱量體重後，無菌取其法氏囊，生理鹽水衝洗，無菌濾紙吸乾表面水分後稱重，並計算法氏囊免疫指數(法氏囊免疫指數=法氏囊/體重比)；結果參見表2。2. 3本發明免疫增強劑對機體免疫機能影響2. 3. I本發明免疫增強劑對T淋巴細胞亞群分類影響從河北某雞場購I日齡AA肉雞60隻，雌雄各半，隨機將其分為I、11二組，每組30隻。按AA肉雞飼養管理標準進行管理和常規免疫外，於20日齡時II組按0. lg/kg體重/天向雞飼料中添加本發明的免疫增強齊U，連用5天。I組作為對照組，除不添加中藥外，其它條件與均I組相同。25日齡時，每組隨機選擇5隻雞，從雞的心臟採血各5ml，製成抗凝血，將抗凝血按常規方法分離出淋巴細胞後，按說明加入ra3+、CD:和⑶/單克隆抗體，應用流式細胞儀檢測外周血液ra3+、CD:和⑶/比例；結果參見表3。
2. 3. 2.本發明免疫增強劑對脾淋巴細胞誘生因子的影響從石家莊市某雞場購I日齡雛雞200隻，雌雄各半。隨機將200隻I日齡肉雞分成I、II、III、IV四組，每組50隻。試驗期間，每組隔離飼養，雞隻自由採食相同日糧，自由飲水，給予24h光照。各組嚴格隔離飼養。3日齡時，按使用說明給III組肉雞日糧中添加黃芪多糖；按0. 1%劑量分別給IV組肉雞日糧中添加本發明的免疫增強劑，連用5天。6日齡時，給II、III、IV組雞經口人工感染IBDV。8日齡、15日齡時，每組隨機選擇5隻雞，無菌採取脾臟，製成單細胞懸液(IXlO6個/ml)。加入100 u L RPMI-1640培養液(含10%犢牛血清、20 u g/mLConA和青、鏈黴素各100U/mL)，將細胞置於40°C、5% CO2飽和溼度培養箱培養42h。最後收集細胞培養液於3000r/min離心20min，吸取上清液，參照試劑盒說明書測定上清液中的IL-2含量；結果參見表4。2. 3. 3本發明免疫增強劑對腸道和氣管SigA分泌量的影響從石家莊市某雞場購I日齡雛雞90隻，雌雄各半。在7日齡進行2羽份新支120凍幹苗點眼；分別在10日齡、17日齡進行2羽份傳染性法氏囊疫苗滴嘴。按常規方法餵養和管理。隨機將90隻I日齡肉雞分成I、II二組，每組30隻。I組作為正常對照組；II組作為用藥對照組，自8日齡至13日齡按黃芪多糖使用說明給雞飲水；111組自8日齡至13日齡，按0. 1%的劑量向其日糧中添 加本發明免疫增強劑。其他條件均相同。分別於14、21日齡，每組隨機抽取5隻雛雞，屠宰後，收集雞氣管液、腸液，然後利用間接ELISAL法檢測其IgA抗體；結果參見表5。2.4.本發明免疫增強劑對肉雞巨噬細胞吞噬功能和血清溶菌酶影響2.4. I中藥對細胞無毒濃度的測定無菌操作取9-10日齡健康雞胚，置滅菌培養皿中除去頭、爪、內臟,並剪成塊,用Hanks』液充分衝洗後移入廣口瓶中，加入約4倍量的
0.25%的胰酶，調節pH值到7-7. 8，振蕩混勻後置37°C水浴中感作40min，每Imin輕搖一次。消化液過濾後加入營養液，用7. 5%NaHC03調pH到7. 2-7. 4。分裝於細胞培養瓶中，置37°C溫箱中培養24h-48h細胞長成單層。將維持液中的中藥濃度分別調製成Iml相當於
0.017g、0. 025g、0. 033g、0. 066g生藥，然後接種於生長良好的細胞單層上，每個稀釋度接種二瓶細胞，以不加藥液的正常細胞作對照。連續觀察6d，以出現細胞退變的最小稀釋倍數作為該藥對細胞的無毒濃度，即為試驗中藥藥液濃度；結果參見表6。2. 4. 2中性紅吞噬試驗參照崔東安測定小鼠吞噬細胞功能的方法，利用96孔酶標板，設I、II、III、IV、V、VI6個組，每組8個孔。III、IV、V、VI為試驗組，分別加入細胞培養用PAP至中藥濃度為100 u g/ml、200 u g/ml、400 u g/ml ; I、II 二組為對照組，I組加入等體積的RPMI1640液，作為空白對照；II組加入細胞培養用PAP至黃芪多糖濃度為200 ii g/ml。在37°C 5% CO2感作48h後，棄上清液，用PBS清洗二次，加入0. 075%中性紅溶液100 u L，培養2h，棄上清液，用PBS清洗三次，加入120 u L酸性異丙醇，搖勻溶解後，於595nm處檢測吸光度值；結果參見表7。2. 4. 3血清溶菌酶水平測定將120隻I日齡健康艾維茵肉雞隨機分為試驗組和對照組，自7日齡至14日齡，III、IV、V、VI三組肉雞分別按0. 06%,0. 08%,0. 1%、0. 14%的劑量
向試驗組肉仔雞日糧中添加本發明的免疫增強劑，自15日齡後常規飼養。I組作為正常對照組，除不餵本發明免疫增強劑物外，其它均和對照組相同。II組作為藥物處理對照組，該組肉雞按黃芪多糖使用說明使用(按0. 01%向日糧中添加);試驗期為28d。17日齡時，對每組肉雞進行心臟採血，常溫下保持30min，經離心分離出血清後，按溶菌酶測定試劑盒的說明書測定其含量；結果參見表8。
2.5.本發明免疫增強劑對環磷酸胺致免疫低下肉雞的免疫影響2. 5. I免疫器官指數的測定從石家莊市某雞場購I日齡雛雞80隻，雌雄各半。在7日齡進行2羽份新支120凍幹苗點眼；分別在10日齡、17日齡進行2羽份傳染性法氏囊疫苗滴嘴。按常規方法餵養和管理。隨機將80隻I日齡肉雞分成I、II、III、IV共4組，每組20隻。I組作為正常對照組；II組作為免疫抑制對照組，只進行肌肉注射環磷酸胺JII組肉雞自7日齡至12日齡，按0. 1%的劑量向其日糧中添加本發明免疫增強劑；IV組肉雞自7日齡至12日齡，按0. 1%的劑量向日 糧中添加本發明免疫增強劑，同時於10日齡時肌肉注射環磷酸胺；試驗期為21d。分別於14、21日齡，每組隨機抽取5隻雛雞，無菌取其法氏囊、胸腺和脾臟，生理鹽水衝洗，用無菌濾紙吸乾表面水分後稱重，並計算法氏囊、胸腺及脾臟免疫器官管指數；結果參見表9。2. 5. 2脾臟淋巴細胞轉化率的測定將上述稱量完畢的脾臟除去外膜，用生理鹽水衝洗數次，加平衡鹽水，剪刀剪碎，200目銅網過濾，分離單個脾細胞。分離的脾臟淋巴細胞樣品用含10%小牛血清的DMEM培養基重懸，調整細胞數為IXlO6Ail ;取脾細胞懸液50iil，加入IOiil標記抗體，混勻，4°C孵育40min ;加入PBS，8000rpm，5min洗滌細胞3次；細胞沉澱中加入200 ill I %多聚甲醛4°C過夜。應用流式細胞儀檢測各組脾細胞中⑶/、⑶/構成比情況；結果參見表10。2. 5. 3ND抗體水平的測定在上述測定免疫器官指數的試驗過程中，屠宰雞之前，對每隻雞進行心臟採血5ml，待析出血清後，利用微量血凝抑制法測定其ND抗體水平；結果參見表11。2. 5. 4氣管和腸道IgA抗體的檢測在上述測定免疫器官指數的試驗過程中，屠宰雞時收集雞氣管液、腸液，然後利用間接ELISAL法檢測其SIgA抗體；結果參見表12。3.本發明免疫增強劑對肉雞血液指標和飼料轉化率影響將7日齡AA肉雞60隻隨機分成I、II兩組，每組30隻。II組按0. 5%的劑量向飼料中添加本發明的免疫增強劑，連用14天，I組為空白對照組。其它條件兩組均相同。將7日齡AA肉雞60隻隨機分成I、II兩組，每組30隻。I組按0. 1%的劑量向飼料中添加本發明的免疫增強劑，連用14天，II組為空白對照組。給藥後第15天，每組隨機選擇5隻肉雞，空腹稱重；心臟採血10mL，靜置20min,於3000r / min離心IOmin製備血清。屠宰後,立即剖殺,取十二指腸食糜3_5g。整個過程中記錄肉雞米食量。3. I血清膽鹼酯酶(CHE)檢測按照血清膽鹼酯酶試劑盒說明書，將上述處理血清利用比色法檢測肉雞血清膽鹼酯酶含量；結果參見表13。3. 2血糖檢測將上述處理血清採用試劑盒並結合全自動生化分析儀測定葡萄糖濃度；結果參見表13。3. 3.澱粉酶檢測按I :51的食糜水質量比，稱取0. 5g食糜，加入4°C雙蒸水後，迅速轉入玻璃勻漿器中，勻漿管置於400ml燒杯內，其中放有冰水，溫度保持在4°C以下，勻漿30s。在4°C條件下再用冰凍離心機離心,於12000r/min離心15min。取部分上清液,採用碘一澱粉比色法測定；結果參見表13。3. 4飼料轉化率測定飼料轉化率為肉雞平均體重與整個試驗過程中肉雞平均採食量的比值；結果參見表13。4.本發明免疫增強劑生物安全性試驗
4. I小白鼠急性中毒試驗河北醫科大學提供的小白鼠40隻，雌、雄各半，體重在18-22g之間，平均體重19. 5g。要求飼養室的室溫為(23±1)°C，相對溼度為(55±5)%，12h光照。按霍恩氏法共分五個劑量級，每級為一個試驗組，共5組；另設對照組一個。給藥途徑和方法採取一次性灌胃法，即將本發明免疫增強劑添加劑按改良寇氏法進行劑量分級稱取，向各分級劑量加入生理鹽水配成混懸液，用注射器吸混懸液，將混懸液緩緩灌入小白鼠胃內。灌藥後，每隔30min檢查一次小白鼠活動情況；灌藥2h後，每2h檢查一次；灌藥12h後,每日上、下午各檢查一次。檢查要點為小白鼠的精神狀態、飲欲、食慾、排便有無異常，是否有中毒或死亡現象；試驗結束後及時剖檢小白鼠，對其臟器組織進行H. E染色、光鏡觀察；於第7天統計LD5tl ;結果參見表14。4. 2小白鼠亞慢性中毒試驗隨機篩選同批次小白鼠10隻分為二組，一組為試驗組，另一組為對照組。將本發明免疫增強劑添加劑按小白鼠飼料量的10% (肉雞用量的10倍)添加於鼠飼料中，混合均勻後製成餅狀自然風乾；對照組的小白鼠飼料中不添加本發明免疫增強劑添加劑。其它條件均相同，連續飼餵60天，進行詳盡觀察，判斷有無慢性中毒現象，同時剖檢試驗鼠，並對臟器組織進行a E染色、光鏡觀察。試驗開始和結束時均稱重，並求其平均值。二、試驗結果I.不同配方免疫增強劑防治肉雞腹水症候群的研究表I本發明免疫增強劑對肉雞血漿糖皮質激素濃度影響
權利要求
1.一種家禽飼養用免疫增強劑，其特徵在於按重量份數比包含黃芪30-45、女貞子30-40、黨參20-30、紅花8-12、白朮10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首烏10-15、麥冬10-12、當歸 15-20、茯苓 15-20，刺五加 10-15。
2.根據權利要求I所述的家禽飼養用免疫增強劑，其特徵在於按重量份數比包含黃芪38、女貞子35、黨參25、紅花10、白朮12，肉桂11、熟地18、何首烏13、麥冬11、當歸17、茯苓18，刺五加12。
3.根據權利要求I所述的家禽飼養用免疫增強劑，其特徵在於按重量份數比包含黃芪32、女貞子40、黨參21、紅花8、白朮15，肉桂10、熟地20、何首烏15、麥冬12、當歸15、茯苓20，刺五加10。
4.根據權利要求I所述的家禽飼養用免疫增強劑，其特徵在於按重量份數比包含黃芪44、女貞子31、黨參29、紅花12、白朮11，肉桂12、熟地15、何首烏11、麥冬10、當歸20、獲茶15,刺五加15。
5.根據權利要求I所述的家禽飼養用免疫增強劑，其特徵在於按重量份數比包含黃芪35、女貞子37、黨參25、紅花12、白朮12，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當歸18、茯苓18，刺五加12。
6.根據權利要求I所述的家禽飼養用免疫增強劑，其特徵在於按重量份數比包含黃芪38、女貞子35、黨參29、紅花10、白朮10，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當歸18、獲茶15,刺五加10。
全文摘要
本發明公開了一種家禽飼養用免疫增強劑，其按重量份數比包含黃芪30-45、女貞子30-40、黨參20-30、紅花8-12、白朮10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首烏10-15、麥冬10-12、當歸15-20、茯苓15-20，刺五加10-15。本發明能夠對家禽尤其是雞的免疫力產生優良的促進作用，對機體黏膜免疫功能的影響尤為明顯。
文檔編號A61P37/04GK102716327SQ20121023072
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者張永英, 張登榮, 強慧芹, 王斌, 石玉祥, 裴豔濤, 趙兵令, 趙洪明, 鍾翠紅 申請人:河北工程大學