一種固定化酶製備人參抗癌有效成份的方法
2023-05-21 18:41:56
專利名稱：一種固定化酶製備人參抗癌有效成份的方法
技術領域：
本發明涉及由固定化工業酶製劑轉化人參二醇組皂苷製備C-K的方法，特別是涉及工業酶製劑為β-葡聚糖苷酶，纖維素酶，纖維二糖酶；所用的固定化方法為海藻酸鈣法。
背景技術：
固定化技術是指通過化學或物理的手段將游離細胞或酶定位於限定的空間區域內，使其保持活性、作用時間長、不易流失、抗毒和耐受力明顯增加，而且固液分離容易，並可反覆利用。其開始於1916年Nelson和Griffin發現蔗糖酶吸附在骨碳微粒上仍保持與游離酶同樣的活性，之後，人們不斷研究各種酶固定化技術和方法，先後實現了對過氧化氫酶等的固定化。1969年日本的千煙一郎實現了固定化醯化氨基水解酶生產L-胺基酸，成功實現了固定化酶工業應用。20世紀70年代初期我國開始研究固定化生物催化劑技術，並取得了一些可喜的成就[7]。現在固定化技術已經廣泛應用於食品、釀酒、化工、環境工程、醫藥等各個領域，但利用固定化酶技術使人參屬植物中的根、莖、葉總皂苷中含量較高的前體物質人參二醇組皂苷轉變為抗腫瘤活性成份-C-K的研究尚未見文獻報導。
研究表明C-K無論在體內、體外均具有良好的抑制癌細胞生長作用和抗轉移作用，無論對實體或流體癌細胞株均有顯著效果，如抗浸潤和轉移作用，利用多種體內外轉移模型如路易斯肺癌細胞LLC、人纖維肉瘤HT1080、小鼠黑色素瘤B16細胞的易轉移亞型B16-F10細胞等研究C-K對腫瘤細胞浸潤和轉移的影響，結果發現C-K雖不直接抑制腫瘤塊形成，但具有明顯的抗轉移作用；誘導腫瘤細胞凋亡作用，C-K在與B16-BL6和LLC兩種腫瘤細胞共同孵育時，15min後即出現在腫瘤細胞的核內，24h之內誘導出現形態學上的細胞凋亡表現；抗腫瘤血管新生作用，研究表明無毒劑量的C-K即可抑制CM-L5所致的HSE細胞的增殖和管腔形成活性，並對腫瘤誘導的心血管形成產生抑制[28]；抗致突變和預防癌變作用，C-K有抗苯並芘誘導的致突變作用，其作用具備藥理學的量效關係。此外，C-K還可降低苯並芘引起中國倉鼠肺纖維母細胞(Chinesehamster lungfibmbl～tcells CHL)的染色體畸變，說明C-K可以作為突變預防劑。
人參次生稀有皂苷-Rg3、-Rh2和C-K具有顯著的抗腫瘤活性，但作為人參、西洋參、三七等發揮藥效活性的物質基礎，它們在天然植物中的含量極低。例如-Rg3在白參中的含量僅為0.0003％，在紅參中的含量約為0.03％；而-Rh2在紅參中含量僅為0.001％，人參莖葉中的-Rh2含量較紅參高10倍，西洋參莖葉中分離得到-Rh2含量為0.001％-0.0043％。C-K在未加工的人參中並不存在，為人參皂苷的微生物代謝產物，在三七中的含量僅為0.032％。因此，如何提高這些微量次生活性皂苷的含量，是目前天然藥物領域中的研究熱點。
而就天然植物資源來說，某種植物中除少數活性成份外，大部分都是低活性成份，但這些成份往往都是生源關係相近或者結構類似。以人參中的單體皂苷為例，如-Rb、-Re、-Rg、-Rh，它們分子結構的母核是相同的，都是相對穩定的達瑪烷型四環三萜皂苷，不同的是它們在母核的特定位置上連接糖的種類、數量或連接位置不同，因此，它們所具有的抗癌作用強度也不同。-Rb1、-Rb2、-Rc、-Rd和-Re等由於支鏈上連接的糖較多，分子量大，抗癌活性不高；而-Rg3、-Rh2和-Rh1等，支鏈上連接較少的葡萄糖，但卻被證實具有較高的抗癌作用。因此，只要能把分子量較大的低活性皂苷支鏈上的糖減少或者去掉，都能得到預期的高活性皂苷。
目前常用的水解皂苷的方法有酸水解法、鹼水解法和生物轉化法。研究發現皂苷的水解方式有兩種，一種是皂苷一次完全水解，生成苷元和糖，另一種是皂苷分步水解，即部分糖先被水解，或雙皂苷中先水解一條糖鏈形成次生苷或前皂苷元。
雖然這兩種方法都可以使皂苷水解，但是它們的水解條件都十分劇烈，不易控制，而且由於在水解過程中能使皂苷元發生脫水、環合、雙鍵位移、取代基位移、構型轉化等變化，使水解的副產物增多，目標產物很難得到或含量較低。更重要的是這兩種方法從原料到反應過程均向環境中排放了大量的有機溶劑、酸和鹼等汙染物，對環境造成很大程度上的危害；而且酸和鹼對操作人員本身也會造成傷害，所以需要尋找新的轉化技術和方法，即能更有效的將低活性、高含量的植物皂苷轉化成高活性、天然含量低的單體皂苷，又能做到不給環境造成負擔，這是合理利用天然藥物資源、實行清潔生產、使中藥走向世界，建立綠色中藥產業的可行之路。
在最近發展起來的各種新技術中，尤以生物轉化技術最為引人注目。生物轉化(Biotransformation或Bioconversion)是利用生物體系將加入到反應系統中的外源有機底物某一特定部位或功能基團進行特異性的結構修飾以獲得有價值的不同化學產物的工藝。這裡的生物轉化強調的是外源底物與產物之間通過一步反應完成，其實質是一種酶的催化反應。由於植物細胞內含有催化氧化、還原、羥基化、乙醯化、酯化、葡萄糖基化、異構化、甲基化、去甲基化、環氧化等反應的酶類，因此它們具有將外源底物轉化成活性物質的能力。生物轉化的區域和立體選擇性強、反應條件溫和、操作簡便、成本較低、公害少，且能完成一些化學合成難以進行的反應，受到有機化學家、藥物化學家和微生物學家們的極大重視。生物轉化的範圍很廣，幾乎包括各種類型的化學反應，如水解、縮合、醯基轉移、氧化還原等等。因此利用生物對植物皂苷進行轉化既克服了傳統酸、鹼水解方法的缺陷，又減少了汙染物的產生，符合從末端治理向源頭控制轉化的新型現代生產模式，因而越來越受到重視，生物轉化法已成為當前的研究熱點。
發明內容為了簡單、方便、低成本、大批量的製備C-K，本發明提供了一種固定化工業酶製劑轉化(水解)人參二醇組皂苷製備C-K的方法，二醇型人參皂苷與固定化工業酶製劑重量比為1∶9-9∶1，pH值在5.0-7.0之間，水解溫度30-45℃，水解時間2h-15d。
本發明用固定化酶水解人參皂苷製備C-K的方法中，收集過程是反應產物去除固定化酶後注入到D101大孔吸附樹脂柱內，用水衝洗至無色，再用70-85％乙醇衝洗樹脂柱。將洗脫液濃縮，揮發至幹。收集的殘餘物即為C-K。
收集過程中反應產物注入到大孔吸附樹脂柱(大孔吸附樹脂型號為D101，天津農藥廠生產)內，用水衝洗至無色，洗液與母液合併，濃縮後再次用於酶水解。
本發明用固定化酶水解人參皂苷製備C-K的方法中，所用的固定化工業酶製劑β-葡聚糖苷酶，纖維素酶，纖維二糖酶。
本發明選用pH值在5.0-7.0之間，水解溫度30-45℃，水解液為水溶液。
本發明用微生物水解人參皂苷製備C-K的方法中，二醇型皂苷與固定化工業酶製劑的比例以6∶1最為經濟；一般來說，水解4d後，再延長水解時間，C-K的產量增加極少，因此，無需延長水解時間。
本發明為利用人參二醇組皂苷製備C-K提供了一種來源方便、價格低廉的固定化工業酶製劑，用該方法製備C-K工藝簡單方便、成本低、回收率高、無環境汙染問題。使用本方法製備的C-K收率≥90％。
(四)
具體實施例方式
實施例一海藻酸鈣法固定化酶轉化人參二醇組皂苷製備C-K選擇2種固定化工藝配方(見表1)分別加入1mL 20％的β-葡聚糖苷酶進行固定，蒸餾水作為對照組。加入到20mg/mL的三七莖葉皂苷溶液中，置於55℃水浴鍋中恆溫反應48h，終止反應；取出樣品用水飽和正丁醇進行等體積萃取，充分震蕩、靜置、離心，轉移至蒸發皿中揮幹；重複以上萃取過程。將得到的產物用色譜甲醇定容，以HPLC檢測C-K量。海藻酸鈣法固定化酶的結果見表2。
兩種方法中海藻酸鈣法1優於海藻酸鈣法2，由C-K量可知海藻酸鈣法1的C-K量可達到70mg/g。從交聯時間來看，第一種方法交聯5小時和16h差別不太明顯，而對於第二種方法，交聯5h效果較好。海藻酸鈉為線性高分子，Ca2+很容易與兩條分子鏈G塊作用，在兩個分子鏈間形成洞，結合Ca2+形成「蛋盒」模型，形成熱不可逆凝膠，從而將酶固定化在凝膠網絡中。若交聯時間過短則不能達到很好的凝膠效果，時間過長則交聯程度高，高分子鏈結較緻密，底物擴散阻力增加，酶活降低。同時，酶由膠囊內向外擴散，固定化時間過長，造成酶洩露並導致包埋率低。因此，交聯時間也是固定化考慮的重要因素之一。
表1 固定化方法及膠凝劑、交聯劑配方
表2 海藻酸鈣法固定化酶的結果
實施例二海藻酸鈣法最佳包酶濃度按照配方製備包酶量為不同體積分數的固定化酶；平行取三個濃度為20mg/mL、pH＝5.5的人參二醇組皂苷溶液，蒸餾水作為對照組；置於55℃水浴鍋中恆溫反應48h，終止反應；取出樣品用水飽和正丁醇進行等體積萃取，充分震蕩、靜置、離心，轉移至蒸發皿中揮幹；重複以上萃取過程。將得到的產物用色譜甲醇定容，以HPLC檢測C-K量。結果表明(表3)5％和10％包酶量時酶活最高，C-K產量最高，且明顯高於20％和30％時的C-K量。因此確定最佳包酶濃度為10％。
表3 不同包酶濃度對固定化酶影響的結果
實施例三海藻酸鈣法最佳交聯時間表4為不同交聯時間的反應結果，由固定化酶重複三次反應的結果可知，交聯時間對固定化的結果有影響，但不太明顯；交聯4h後，固定化過程可基本完成，且交聯4-6h後C-K量較高，所以固定化交聯時間4-6h即可。
表4 不同交聯時間對固定化酶影響的結果
權利要求
1.一種固定化酶製備人參抗癌有效成份的方法，包括水解、收集步驟，其特徵在於用固定化酶製劑在水溶液中轉化二醇型人參皂苷，二醇型人參皂苷與固定化工業酶製劑的重量比為1∶9-9∶1，pH值在5.0-7.0之間，水解溫度30-45℃，水解時間2h-15d。
2.按照權利要求1所述用固定化酶，其特徵在於所用的固定化酶製劑為β-葡聚糖苷酶，纖維素酶，纖維二糖酶。
3.按照權利要求1所述的一種固定化酶製備人參抗癌有效成份的方法，其特徵在於所用的固定化方法為海藻酸鈣法，固定化酶的製備過程按固定化配方以膠凝劑配方NaAlg∶水＝3∶100(w/w)；交聯劑配方為7％的CaCl2溶液，稱量樣品，並在90℃左右水浴熔融，製得膠凝劑；冷卻到40℃左右，然後與一定量的酶混合均勻；用注射器將海藻酸鈉與酶的混合液滴入交聯劑溶液中，放置於冰箱中交聯4-6h；交聯結束後濾出固定化顆粒，用蒸餾水洗淨備用。
4.按照權利要求1所述的一種固定化酶製備人參抗癌有效成份的方法，其特徵在於所述的收集過程是反應產物去除固定化酶後注入到D101大孔吸附樹脂柱內，用水衝洗至無色，再用70-85％乙醇衝洗樹脂柱，將洗脫液濃縮，揮發至幹，收集的殘餘物即為人參抗癌有效成份C-K。
全文摘要
一種固定化酶製備人參抗癌有效成份的方法，包括工業酶製劑的固定化、固定化酶的轉化(水解)工藝、轉化產物的收集步驟。其特徵在於二醇型人參皂苷分子中的糖基被固定化酶定點切除、生成目標化合物C－K[20(S)原人參二醇－20－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，人參皂苷Compound－K簡稱C－K]。本發明利用固定化工業酶製劑轉化人參二醇組皂苷製備C－K，解決了利用酸、鹼水解人參皂苷製備C－K工藝中產生汙染環境的問題。克服了現存方法中反應條件劇烈、苛刻、苷元破壞嚴重，產物收率低等缺陷。本發明中所用固定化工業酶製劑簡單方便、成本低廉、轉化效率高、可用於大批量製備C－K以滿足製備抗腫瘤治療藥物的需求。
文檔編號C12P1/00GK1899336SQ20061004711
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月4日 優先權日2006年7月4日
發明者趙餘慶, 姜彬慧, 董會娟, 韓穎, 柴瑞華 申請人:遼寧中醫藥大學