分離大豆蛋白及其生產方法
2023-05-08 06:31:26
專利名稱：分離大豆蛋白及其生產方法
技術領域：
本發明涉及一種從含有大豆蛋白的溶液中生產富含7S球蛋白級分和富含11S球蛋白級分的方法，以及由該方法製得的大豆蛋白。
背景技術：
大豆貯藏蛋白在大約pH4.5時發生沉澱，且可以相對容易的與非蛋白組分分離。這種沉澱蛋白是指大豆分離出的蛋白質，這種形式的大豆蛋白通常應用在食品工業中。根據超速離心分析法的沉降常數，大豆貯藏蛋白進一步的分為2S、7S、11S和15S球蛋白。其中，7S球蛋白和11S球蛋白是球蛋白級分的主要成分(注7S球蛋白和11S球蛋白是根據沉降方法標定的名稱，實質上，分別對應於免疫學命名系統的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)，並且它們具有不同的性質，例如粘度、凝結力、表面活性等。因此，把大豆蛋白分離成富含7S球蛋白的級分和富含11S球蛋白的級分，就能夠開始應用兩種蛋白質的性質，藉此可擴大蛋白質的工業應用。
7S球蛋白和11S球蛋白由幾個亞基構成。7S球蛋白由3個亞基，即α、α』和β亞基組成。11S球蛋白由一對酸性多肽(A)和鹼性多肽(B)組成，它們都有幾個亞基。在常規的大豆蛋白中的這些亞基的組成比例為7S球蛋白比11S球蛋白的比例約1∶2，其由通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳獲得的遷移譜帶的光密度面積比所確定。7S球蛋白和11S球蛋白的分子量和電荷狀態性質相似。特別是兩種蛋白不同在於其亞基的組成不同，從而在一定程度上它們的性質相互重疊。因此，相互混雜很少的有效分離這些球蛋白是非常不容易的。
已知的分離方法如下所述。也就是說，這些方法包括利用等電離點不同的分離方法在11S球蛋白的等電離點附近時只有7S球蛋白被提取(JP55-124457A)；利用與鈣鹽反應能力不同的分離方法通過在提純中加入小量的鈣來提取富含7S球蛋白的級分(JP-A-48-56843A)；利用在特定的pH值和離子強度下的溶解度不同的分離方法通過在pH約為1.2-4.0時氯化鈉或氯化鉀存在的條件下除去不溶的級分來製備7S球蛋白(JP49-31843A)，通過調節經過等電離點沉澱之後的漿液的pH值到5.0-5.6，同時調節氯化鈉的濃度到0.01-0.2M來分離7S球蛋白和11S球蛋白(JP58-36345A)，通過調節含有蛋白質的溶液的離子強度到0.2-0.3和pH值到4.8-5.2來去除不溶解級分，然後調節離子強度到小於0.2和pH到4.6-5.0來分離7S球蛋白(JP5-43597A)；和利用冷沉澱現象和還原劑等的方法這利用了在低溫下11S球蛋白的溶解度降低現象(意指冷沉澱現象)，在水體系pH為6.5或更高在亞硫酸化合物、穀胱甘肽化合物或半胱氨酸存在的條件下處理大豆蛋白原料，接著調節pH到5.5-7.0和溫度為22℃或更低來分離成溶解的富含7S球蛋白的級分和不溶解的富含11S球蛋白的級分(JP61-187755A)。
這些已知的分離方法巧妙地利用了由於pH、離子強度、特定鹽的存在、溫度等造成的7S球蛋白和11S球蛋白的溶解度不同。但是，這些已知的方法不適作工業規模的分離方法的問題在於，例如，完全分離需要高離心力。因此，實踐中仍有問題。例如，在JP61-187755的方法中，冷沉澱現象很大程度上取決於溫度，並且將反應混合物降溫至約5℃，這導致的實際問題在於要利用工業用的低離心力就要把大量的亞硫酸化合物等加到分離層中，同時還導致分離精確性的問題，也就是少量的11S球蛋白摻雜在可溶的級分中。
為了獲得富含7S球蛋白的蛋白質，研究了從缺損11S球蛋白的大豆中分離蛋白，例如通過育種製備富含7S球蛋白的種子(BreedingScience，46，11，1996)，還可以發現它的使用(Breeding Science，50，101，2000)和專利(US6,171,640B1)。
如上所述，已經研究和開發了用於分離富含7S球蛋白的級分和11S球蛋白的級分的方法，通過該方法可溶解級分與不溶解級分之間的相互混雜降低，通過該方法可以便利地實現工業規模的生產。
另一方面，Samoto等人報導了在源於大豆的蛋白中，有一種與作為細胞質薄膜和蛋白體或油體薄膜(油體結合蛋白)組分的極性脂類具有高親和力的蛋白質成分，其量高達工業生產大豆蛋白分離物的大約35％(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))。油體結合蛋白是主要由膜蛋白構成的蛋白質組分的通用術語，特別是那些由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定的分子量主要地為34kDa、24kDa和18kDa，並且含有大約10-12％重量的極性脂類的，其可用氯仿乙醇以2∶1混合的極性溶劑混合物提取。
常規的分離方法只關注7S和11S球蛋白，而在一般情況下沒有注意到汙染各個級分的油體結合蛋白，因為當使用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析時，油體結合蛋白不能像7S和11S球蛋白那樣確實地被確定而常常被忽視。換句話說，只用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳來確定純度通常要比實際純度高。為了獲得真正高純度的7S或11S球蛋白，應該考慮到油體結合蛋白的作用。因此，常規的分離成7S球蛋白/11S球蛋白兩個級分的分離方法，僅作為7S球蛋白和11S球蛋白之間的比例來處理級分的純度。然而，各級分與油體結合蛋白都相關，並且在許多情況下，實際的情況是純度稍低的相對粗製的級分，其蛋白組成的特點在於含有大量的油體結合蛋白。
而本發明的發明人提供了一種只需通過酸性條件下熱處理實現工業規模的7S球蛋白和11S球蛋白的分離的方法(WO02/28198A1)，作為深入研究的結果，已發現通過結合調節離子強度與在酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理，可以降低分離含有7S球蛋白的可溶解級分和含有11S球蛋白的不溶解級分的pH，從而進一步促進可溶解級分與不溶解級分的分離。
本發明提供了一種分離7S球蛋白和11S球蛋白的新的分離方法，特別是，本發明的目的之一是一種高度精確有效的分離方法，其可以以工業規模實現。本發明的另一目的是提供具有較少油體結合蛋白汙染和高純度的7S球蛋白和11S球蛋白的特點的蛋白分級。
專利文獻1JP55-124457A專利文獻2JP48-56843A專利文獻3JP49-31843A專利文獻4JP58-36345A專利文獻5JP5-43597A專利文獻6JP61-187755A專利文獻7US6,171,640B1專利文獻8WO02/28198A1非專利文獻1K.Yagasaki等，Breeding Science，46，11，1996非專利文獻2K.Yagasaki等，Breeding Science，50，101，2000非專利文獻3M.Samoto等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940，1998發明詳述本發明涉及(1)生產大豆蛋白的方法，其包括在酸性條件下熱處理含有大豆蛋白的溶液，然後在離子強度為0.02或更高和pH為4.5或更高但低於5.6的條件下將其分為可溶解級分和不可溶級分；(2)根據(1)的方法，其中含有大豆蛋白的溶液是脫脂大豆蛋白的水漿液、從該漿液獲得的脫脂大豆豆漿、酸沉大豆蛋白的漿液或大豆蛋白分離物的溶液；(3)根據(1)的方法，其中酸性條件為pH3.8-6.8；(4)根據(1)的方法，其中熱處理在30-75℃進行；(5)根據(1)的方法，其進一步包括從通過方法(1)中的分離獲得的可溶解級分中分離出7S球蛋白，其中所述7S球蛋白的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.5或更高，並且所述7S球蛋白的固體內容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的極性脂類的含量為1％重量或更低；(6)通過方法(5)獲得的7S球蛋白，其中7S球蛋白的固體內容物中肌醇六磷酸的含量為1.2％重量或更低；(7)根據方法(1)的方法，其還包括從通過方法(1)中的分離獲得的不溶解級分中分離出11S球蛋白，其中所述11S球蛋白的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.7或更高，並且所述11S球蛋白的固體內容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)在所述的11S球蛋白成分中提取的極性脂類的含量為2％重量或更低；(8)通過方法(7)獲得的11S球蛋白，其中11S球蛋白的固體內容物中肌醇六磷酸的含量為1.2％重量或更低；實施本發明的最佳方式與僅通過在酸性條件的熱處理實現7S球蛋白和11S球蛋白的工業化分離的方法(WO02/28198A1)相比，本發明方法的特點在於用於分離開含有7S球蛋白的可溶解級分和含有11S球蛋白的不溶解級分的pH可以通過結合調節離子強度與在酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理降低，從而進一步促進可溶解級分與不溶解級分的分離。上述的酸性條件優選在pH3.8-6.8，熱處理溫度優選為30-75℃，離子強度優選為0.02或更高，並且可溶解級分和不可溶級分的分離優選在pH為4.5或更高但低於5.6的條件下進行。由此可以獲得含有更少油體結合蛋白的富含7S球蛋白的可溶解級分。能夠通過在大約中性的pH(pH6.5-7.5)的水溶液中的上述的不溶解級分上施加弱的剪應力來選擇性的溶解和分離11S球蛋白並保持油體結合蛋白不溶，從而溶解或提取不溶解級分中的11S球蛋白來獲得含有更少油體結合蛋白的富含11S球蛋白的不溶解級分。
另外，在本發明中，具有肌醇六磷酸佔蛋白質為1.2％或更低的低含量的肌醇六磷酸的蛋白質級分可以通過在生產過程中用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸來獲得。分離效率可以通過在可溶解級分和不溶解級分分離之前的實施肌醇六磷酸酶處理得到進一步提高。
通過上述生產方法獲得的可溶解級分具有的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值為0.5或更高，上述比值為0.8或更高、0.85或更高，或0.9或更高的高純化的7S球蛋白就可以容易地通過適當地選擇分離可溶解級分和不溶解級分的pH來獲得。另一級分，例如，不溶解的級分，具有的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值為0.7或更高，並且上述比值為0.8或更高、0.85或更高，或0.9或更高的高純化的7S球蛋白就可以容易地通過適當地選擇分離可溶解級分和不溶解級分的pH來獲得。
其中，7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)或11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值可以從通過依據光密度分析法用SDS-聚丙烯醯胺電泳測量遷移譜帶所獲得的相對應的級分的面積比來確定。
在酸沉的蛋白質中的油體結合蛋白的比例為大約30-35％，當蛋白質正是用硫酸鈉從酸沉的蛋白質獲得的時候，其幾乎沒有變性(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))。考慮到用氯仿和甲醇的比為2∶1(體積比)的混合溶劑提取的極性脂類在酸沉蛋白的成分中的固體含量為3-4％重量和在油體結合蛋白中的含量為10-12％重量，上述的極性脂類(在下文中有時簡寫為氯仿-甲醇可提的油份)不均衡地分布在酸沉蛋白的油體結合蛋白中，並且油體結合蛋白的量可計為氯仿-甲醇可提的油份重量的10倍。然而，這種計算適用於通過己烷等脫脂製備的主要物質，至於沒有經過己烷提取的主要物質，該計算首先適用於經過己烷脫脂的。
本發明中獲得的富含7S球蛋白的可溶解級分含有1％或更低的氯仿-甲醇可提的油份，而油體結合蛋白的含量估計為10％或更低。從不溶解級分提取的富含7S球蛋白的級分含有2％或更低的氯仿-甲醇可提的油份，而油體結合蛋白的含量估計為20％或更低。
本發明所使用的分析方法如下所述。
*粗蛋白質通過Kjaldahl方法確定氮含量，並把它乘以係數6.25轉換為粗蛋白質的含量。
*不溶解級分的分離沉澱速率使用由L.U.M.Co.製造的分離特性分析儀LUMiFuge114。含有不溶解級分的樣品溶液(0.5ml)被放入聚苯乙烯方形空格中，該空格在100G離心分離，並且透光度為20％的界面移動的速率定義為分離沉澱速率。
*SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳根據Laemmli的方法(Nature，227，680(1970))，使用凝膠濃度為10％-20％的梯度凝膠分析蛋白質。所測試的蛋白質的固體含量為6μg，，並且該凝膠用Coomassie BrilliantBlue R-250染色。
*肌醇六磷酸肌醇六磷酸的量根據Alii Mohamed方法化驗(Cereal Chemistry 63，475-478(1986))。
*氯仿-甲醇可提的油份乾燥的樣品中加入大約50倍體積的氯仿和甲醇的混合溶液(體積比，2∶1)，回流溶劑提取的固體成分的重量比確定為氯仿-甲醇可提的油份。
*純度(SPE標準)用光密度計測量通過上述SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳獲得的遷移譜帶。所期望的組分相對於該譜帶總面積的面積比值定義為純度(SPE標準)。7S球蛋白的含量是指α、α』和β亞基的總含量，而11S球蛋白的含量是指酸性多肽(A)和鹼性多肽(B)的總含量。
*校正純度考慮到其中摻雜的油體結合蛋白，從上面獲得的純度(SPE標準)計算校正純度。也就是，由於樣品中除了含有7S球蛋白和11S球蛋白外，還含有對應於氯仿-甲醇可提的油份10倍重量的油體結合蛋白，假設A(％)代表純度(SPE標準)，計算對應於包括7S球蛋白、11S球蛋白和油體結合蛋白的總蛋白的校正純度校正純度(％)＝(100(％)-氯仿-甲醇可提的油份含量(％)×10)×A(％)/100*離子強度用電導計(2％/℃，具有溫度轉換功能)計量溶液的導電率，對應於所測的導電率的NaCl的摩爾濃度定義為離子強度。
本發明優選的實施例如下所述。
任何市售或通過育種或基因工程生產的缺損特定級分蛋白的大豆都可以用作本發明的原料大豆。而含有大豆蛋白的溶液可為任何脫脂大豆的水相漿液(以下稱為脫脂大豆漿液)、從該漿液獲得的脫脂豆漿、大豆蛋白的酸沉漿液(以下稱為凝乳)或大豆蛋白分離物的溶液。特別優選脫脂大豆的水相漿液，由於其可溶解級分和不溶級分易於分離。為了分離成富含7S球蛋白級分和富含11S球蛋白的級分，優選非變性或幾乎沒有變性的大豆蛋白的溶液。
酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理進行在pH3.8-6.8，更優選pH4.0-6.6，進一步優選pH4.2-6.2，其溫度為30-75℃，更優選35-65℃，進一步優選40-60℃。0.02或更高的離子強度促進可溶解級分和不溶解級分的分離。然而，由於為了在分離之後從可溶解級分等電沉澱7S球蛋白，離子強度應調節到小於0.2，而分離時所用的離子強度為0.2或更高，因此為了避免複雜的分離過程0.02或更高但小於0.2的離子強度被建議使用。當在pH4.5或更高但小於5.6的條件下從不溶解級分分離出可溶解級分時，可以獲得富含7S球蛋白的可溶解級分和富含11S球蛋白的不溶解級分。可以通過在生產過程中用肌醇六磷酸酶分解包含在大豆蛋白中的肌醇六磷酸進一步促進富含7S球蛋白的級分和富含11S球蛋白的級分的分離，特別是在可溶解級分和不溶解級分分離之前的任何步驟中。肌醇六磷酸酶處理可以被簡化和推動，當該過程與酸性條件下的熱處理同時進行時。肌醇六磷酸酶處理最優化的條件通常是在pH3.5-9.0，20-70℃的溫度下5分鐘-3小時，每克蛋白質大約0.1-100個單位的肌醇六磷酸酶，儘管該條件會根據肌醇六磷酸酶的來源有些變化。1個單位的肌醇六磷酸酶的活性用從作為底物的肌醇六磷酸在pH5.5和37℃下的酶促反應的起始狀態一分鐘內釋放出1μmol磷酸所需的酶的量來定義。
不同於上述熱處理的pH和溫度，熱處理時間長短對分離方法中的所經歷的困難沒有明顯的影響，因此不夠重要。熱處理過程中pH超出3.8-6.8的範圍，或溫度超出30℃-75℃的範圍會導致7S球蛋白和11S球蛋白分離困難。
熱處理之後，可在同樣的溫度下進行分離，儘管優選確保低溫以控制微生物。可以使用已知的分離操作(例如過濾和離心)來完成分離，特別是用連續離心機(例如傾析器)也可以完成簡單的分離。當然不排除使用非連續離心機例如間歇式離心機。
本發明的分離為富含7S球蛋白的可溶解級分和富含11S球蛋白的不溶解級分的精確性可以依據通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳獲得的譜帶(純度基於SPE標準)進行評價。
然而，因為基於SPE標準的純度由於SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳中油體結合蛋白的低可染性會被低估，通過上述等式校正純度(％)＝(100(％)-氯仿-甲醇可提的油份含量(％)×10)×A(％)/100獲得的校正純度被認為更接近真實的純度。
分離之後，可溶解級分就可用作富含7S球蛋白的級分或者再經過濃縮、中和、滅菌或乾燥。可以通過例如調節pH4.0-5.0調節其離子強度小於0.2來分離並收集所得的不溶解級分。通常，用水進一步稀釋可溶解級分，中和，熱滅菌並乾燥。可以採用已知的如HTST、UHT處理方法進行熱滅菌。當然，根據特定的目的，該級分可以用例如溶液形式的蛋白酶的酶進行處理。
為了從不溶解的油體結合蛋白[包括「okara(源自豆漿或豆腐生產中的不溶殘渣)」組分，當不溶解級分含有它時]中分離出11S球蛋白，在分離之後可以使用適當地中性水溶液(pH6.5-7.5)從不溶解級分溶解或提取11S球蛋白。此時，為了在防止油體結合蛋白的溶解的同時選擇性的溶解或提取11S球蛋白，優選使用儘可能弱的剪應力來溶解或提取11S球蛋白。優選離心力在大約4,000G或更高的高G離心分離機，更優選大約5,000G或更高的高G離心分離機順利地用於從油體結合蛋白分離提純或溶解11S球蛋白，從而可以在保持11S球蛋白相對於11S球蛋白和7S球蛋白總量的比例為0.7或更高的同時，可以獲得固體成分中氯仿-甲醇可提油分的含量為2％或更低的蛋白質。
被適當地中性水溶液溶解或提取並且含有2％或更低的氯仿-甲醇可提的油份成分的富含11S球蛋白的級分就可被用作富含11S球蛋白的級分或經過濃縮、中和、滅菌或乾燥。例如可以通過調節可溶解級分的pH為4.5或更高但低於5.6來分離並收集所得的不溶解級分來進行濃縮。該不溶解級分通常用水進一步稀釋、中和和熱滅菌之後的乾燥。可以採用已知的如HTST、UHT處理方法進行熱滅菌。當然，根據特定的目的，不溶解級分可以用例如溶液形式的蛋白酶的酶進行處理。
下面的實施例將進一步說明本發明，但不是用於限制本發明的技術範圍。
實施例1通過壓榨大豆並用萃取劑，正己烷，提取其中的油來分離並除去油獲得的幾乎沒有變性的脫脂大豆(1重量份，氮溶解指數(NSI)91)加入抽提水(10重量份，離子交換水)。在22℃用均質混勻機攪拌混合物。通過加入20％的氫氧化鈉保持pH7.5提取40分鐘。然後，抽取物用濾布過濾，接著5,000G離心10分鐘除去不溶解級分，從而獲得脫脂豆漿。用35％的鹽酸調節該豆漿的pH到4.5，接著4,000G離心10分鐘來獲得酸沉蛋白質。離子交換水加到酸沉蛋白質中使得蛋白質成分的乾重為5％，接著該溶液用Polytron(由KINEMATICA AG製造)均化(以下稱為凝乳)。該凝乳的離子強度用氯化鈉調至0.14，並在22℃攪拌30分鐘，接著用20％的氫氧化鈉水溶液調節該凝乳的pH到5.3，隨後在22℃攪拌20分鐘。然後加熱該凝乳至50℃，並在50℃攪拌10分鐘之後，立刻冷卻該凝乳至22℃。從加熱開始到冷卻至22℃所需的時間為25分鐘。在進一步在22℃攪拌15分鐘之後，用LUMiFuge114測定不溶解級分的分離沉澱速率。同時，把通過5,000G離心分離5分鐘獲得的溶解級分和不溶解級分用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行化驗，確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率(通過用光密度計測量SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳的譜帶獲得的各級分的面積比)。
不溶解級分的分離沉澱速率如表1所示，可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表2所示。
對比實施例1按照與實施例1相同方法製備的5％的凝乳的離子強度用氯化鈉調節至0.14。在22℃攪拌30分鐘該凝乳，用20％的氫氧化鈉水溶液調節pH到5.3，然後在22℃攪拌60分鐘。按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率，接著把通過5,000G離心分離5分鐘獲得的溶解級分和不溶解級分用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行化驗來確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
不溶解級分的分離沉澱速率如表1所示，可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表2所示。
表1不溶解級分的分離沉澱速率
表27S球蛋白和11S球蛋白的比率
從實施例1和對比實施例1的結果可知，含有高純度7S球蛋白的可溶解級分和含有高純度11S球蛋白的不溶解級分的分離可以通過酸性條件下加熱該凝乳得到進一步的促進。
實施例2按照與實施例1相同方法製備的5％的凝乳的離子強度用氯化鈉調節至0.14。不用調節pH(pH大約4.5)，在22℃攪拌30分鐘，加熱至50℃，接著立刻冷卻至22℃。從加熱開始到冷卻至22℃所需的時間為15分鐘。冷卻後，用20％的氫氧化鈉水溶液調節該凝乳的pH到5.5，接著攪拌15分鐘。按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率，並確定可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表3所示，不溶解級分的分離沉澱速率如表4所示。
對比實施例2按照與實施例1相同方法製備的5％的凝乳經過與實施例2(pH未調節；該凝乳在22℃攪拌30分鐘，加熱至50℃，接著立刻冷卻至22℃。)相同的熱處理，沒有調節離子強度(離子強度0.013)。然後，凝乳的pH用20％的氫氧化鈉水溶液調節至5.9(不能獲得具有相似7S球蛋白和11S球蛋白的比率的級分，除非當離子強度低時提高用於分離可溶解級分和不溶解級分的pH)。攪拌15分鐘之後，按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率，並測量可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表3所示，不溶解級分的分離沉澱速率如表4所示。
表37S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S11S)
表4不溶解級分的分離沉澱速率
從實施例2和對比實施例2的結果可知，從含有11S球蛋白的不溶解級分分離出含有7S球蛋白的可溶解級分可以通過提高離子強度和降低分離pH得到進一步的促進。
從以上實施例和對比實施例的結果可知，與僅僅在酸性條件下的熱處理或僅僅調節離子強度相比，含有7S球蛋白的可溶解級分和含有11S球蛋白的不溶解級分的分離可以通過酸性條件下含有大豆蛋白溶液的熱處理與調節離子的結合得到進一步的促進。
實施例3按照與實施例1相同方法脫脂的幾乎沒有變性的脫脂大豆1個重量份加入抽提水(離子交換水，10個重量份，22℃)(以下稱為脫脂大豆漿液)。離子強度用氯化鈉提調節至0.17，並且沒有調節pH在22℃攪拌器攪拌凝乳30分鐘。然後，pH用35％的鹽酸調節至5.3，並將該粗製的凝乳加熱至50℃，攪拌器攪拌10分鐘，接著立即冷卻至22℃。加熱至50℃所需時間為10分鐘，而冷卻至22℃所需時間為5分鐘。冷卻後，用35％的鹽酸調節該粗製的凝乳的pH至4.8，在22℃額外攪拌10分鐘，按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率。進一步的，至於通過5,000G離心5分鐘所得的可溶解級分，按照與實施例1相同方法確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。另一方面，水(7倍於脫脂大豆重量)加到不溶解級分中，並且在22℃通過均質機攪拌30分鐘提取蛋白質，同時其pH通過加入20％氫氧化鈉水溶液保持在7.2，並且通過5,000G離心5分鐘所得的可溶解級分用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳化驗來確定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
對比實施例3按照與實施例3相同方法製備的脫脂大豆漿液的離子強度用氯化鈉調節至0.17，並且在22℃攪拌漿液30分鐘。然後，脫脂大豆漿液的pH用35％的鹽酸調節至5.3，接著在22℃攪拌25分鐘。然後，該漿液的pH用20％的氫氧化鈉溶液調節至4.8，並在22℃攪拌10分鐘，測量不溶解級分的分離沉澱速率，並按照與實施例1相同方法測量可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表5所示，不溶解級分的分離沉澱速率如表6所示。
表57S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S∶11S)
表6不溶解級分的分離沉澱速率
從實施例3和對比實施例3的結果可知，當使用脫脂大豆漿液時可溶解級分和不溶解級分的分離也可以通過調節酸性條件下的熱處理溫度和離子強度得到促進。
實施例4按照與實施例1相同方法製備的5％的凝乳的離子強度用氯化鈉調節至0.17。在按照與實施例1相同方法加熱該凝乳之後。(不用調節pH用攪拌器在22℃攪拌30分鐘，pH調節至5.3，並將該凝乳攪拌器攪拌加熱至50℃，接著立刻冷卻至22℃)。然後，用20％的氫氧化鈉水溶液調節pH到5.4(用於分離凝乳的pH應比此值高，因為為了獲得具有同樣7S球蛋白和11S球蛋白比率的級分從脫脂大豆豆漿和凝乳中分離脫脂大豆豆漿，此時脫脂大豆豆漿的離子強度與凝乳的相同)，接著在22℃額外攪拌10分鐘。按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率，並用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳確定可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解級分和不溶解級分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表7所示，不溶解級分的分離沉澱速率如表8所示。
表77S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S∶11S)
表8不溶解級分的分離沉澱速率
從實施例3和實施例4的結果可知，如果在含有大豆蛋白的溶液中使用脫脂的大豆漿液，使用較高的不溶解級分的分離沉澱速率更促進分離。
實施例5按照與實施例1相同方法製備的5％的凝乳的離子強度用氯化鈉調節至0.14，pH未調節(pH大約4.5)在22℃攪拌該漿液30分鐘，接著加熱至50℃。升溫至50℃所需的時間為10分鐘。溫度升到50℃之後，漿液的pH用20％的氫氧化鈉水溶液調節至5.3，並額外加熱該漿液20分鐘，接著冷卻至22℃。冷卻所需的時間為5分鐘。冷卻後，5,000G離心分離該漿液10分鐘來獲得可溶解級分和不溶解級分。
所得可溶解的級分用35％的鹽酸調節至pH4.5，3,000G離心10分鐘來獲得沉澱級分。然後，該沉澱級分加入水，用20％的氫氧化鈉水溶液中和該混合物，並且凍幹來獲得富含7S球蛋白級分。
另一方面，5倍重量的離子交換水加到由5,000G離心10分鐘來獲得的不溶解級分，用攪拌器在22℃攪拌30分鐘萃取該混合物，同時該混合物的pH用20％氫氧化鈉水溶液保持在6.8。然後，該混合物在5,000G離心10分鐘，並且所得的上層溶液的pH用35％的鹽酸調節至4.5，接著在3,000G離心10分鐘來獲得沉澱級分。然後，該沉澱級分加入水，並且該混合物用20％氫氧化鈉水溶液中和，且凍幹來獲得富含11S球蛋白級分。
用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳確定各級分中7S∶11S的比率、富含7S球蛋白級分中7S球蛋白的純度(SPE標準)和富含11S球蛋白級分中11S球蛋白的純度(SPE標準)、氯仿-甲醇可提的油份的量、7S球蛋白的校正純度、11S球蛋白的校正純度和各級分中肌醇六磷酸的含量如表9所示。表10顯示了按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率。
表9各級分的組成(單位％)
表10不溶解級分的分離沉澱速率
從以上結果可知，含有微量的氯仿-甲醇級分，或含有微量的油體結合蛋白的高純化的7S和11S球蛋白級分可以通過本發明的方法獲得。
從實施例1的結果其中樣品溶液立即冷卻未經熱處理之後的保持溫度和從實施例5的結果其中熱處理之後保持溫度20分鐘，證明熱處理後保持溫度可以提高分離沉澱速率。
實施例6按照與實施例1相同方法製備的5％的凝乳的離子強度用氯化鈉調節至0.14，pH未調節(pH大約4.5)在22℃攪拌該漿液30分鐘，接著加熱至50℃。加熱所需的時間為10分鐘。當溫度升到50℃時，漿液的pH用20％的氫氧化鈉水溶液調節至5.3。然後，肌醇六磷酸酶(Sumizyme PHY，Shin Nihon Chemical Co.Ltd.生產)基於脫脂大豆的重量計以0.2％重量比加入，並且該漿液用攪拌器額外攪拌20分鐘。然後，該漿液冷卻至22℃。冷卻所需的時間為5分鐘。冷卻之後，該漿液在5,000G離心10分鐘來獲得可溶解級分和不溶解級分。所得的可溶解級分用35％的鹽酸調節至pH4.5，3,000G離心10分鐘來獲得沉澱級分。然後，該沉澱級分加入水，用20％的氫氧化鈉水溶液中和該混合物，並且凍幹來獲得富含7S球蛋白級分。
另一方面，5倍重量的離子交換水加到經5,000G離心10分鐘之後獲得的不溶解級分，用攪拌器在22℃攪拌該混合物，並被萃取30分鐘，同時該混合物的pH用20％氫氧化鈉水溶液保持在6.8。然後，該混合物在5,000G離心10分鐘，所得的上層溶液的pH用35％的鹽酸調節至4.5，接著在3,000G離心10分鐘來獲得沉澱級分。然後，該沉澱級分加入水，並且該混合物用20％氫氧化鈉水溶液中和，且凍幹來獲得富含11S球蛋白級分。
用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳確定各級分中7S∶11S的比率、富含7S球蛋白級分中7S球蛋白的純度(SPE標準)和富含11S球蛋白級分中11S球蛋白的純度(SPE標準)、氯仿-甲醇可提的油份的量、7S球蛋白的校正純度、11S球蛋白的校正純度和各級分中肌醇六磷酸的含量如表11所示。表12顯示了按照與實施例1相同方法測量不溶解級分的分離沉澱速率。
表11各級分的組成(單位％)
表12不溶解級分的分離沉澱速率
從實施例5和實施例6的結果可知，用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸的伴隨使用促進了可溶解級分和不溶解級分的分離，從而可能獲得富含7S球蛋白的級分和富含11S球蛋白的級分，其都含有更少的肌醇六磷酸。
工業實用性如上所述，依據本發明，富含7S球蛋白的可溶級分和富含11S球蛋白的不溶級分可以簡單容易地通過結合調節含有大豆蛋白的溶液的離子強度和酸性條件下的熱處理實現工業化規模的分離。
權利要求
1.一種生產大豆蛋白的方法，其包括在酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液，然後在離子強度為0.02或更高並且pH為4.5或更高但低於5.6的條件下將其分成可溶解級分和不溶解級分。
2.根據權利要求1所述的方法，其中含有大豆蛋白的溶液為脫脂大豆的水漿液、從該漿液獲得的脫脂大豆豆漿、酸沉大豆蛋白漿液或大豆蛋白分離物的溶液。
3.根據權利要求1所述的方法，其中的酸性條件為pH3.8-6.8。
4.根據權利要求1所述的方法，其中的加熱在30-75℃進行。
5.根據權利要求1所述的方法，其還包括從由權利要求1的分離獲得的可溶解級分中分離出7S球蛋白，其中所述的7S球蛋白的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.5或更高，並且所述7S球蛋白的固體內容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的極性脂類的含量為1重量％或更低。
6.根據權利要求5所述的方法獲得的7S球蛋白，其中7S球蛋白的固體內容物中肌醇六磷酸的含量為1.2重量％或更低。
7.根據權利要求1所述的方法，其還包括從由權利要求1的分離獲得的不溶解級分中分離出11S球蛋白，其中所述的11S球蛋白的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值為0.7或更高，並且所述11S球蛋白的固體內容物中用氯仿和甲醇的混合溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的極性脂類的含量為2重量％或更低。
8.根據權利要求7所述的方法獲得的11S球蛋白，其中11S球蛋白的固體內容物中肌醇六磷酸的含量為1.2重量％或更低。
全文摘要
本發明的目的在於開發一種分離7S球蛋白和11S球蛋白的新方法，特別是，可以以工業規模實施的高精確度和效率的分離方法。還意欲獲得含有很少脂類結合蛋白，並且顯示固有的高純度7S球蛋白和11S球蛋白的特徵的蛋白級分。一種用於生產大豆蛋白的方法，其特徵在於包括在pH 3.8－6.8酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液到30－75℃，然後在離子強度為0.02或更高並且pH為4.5或更高但低於5.6的條件下將其分成可溶解級分和不溶解級分。
文檔編號A23J1/14GK1738540SQ20038010867
公開日2006年2月22日 申請日期2003年10月23日 優先權日2002年11月12日
發明者石川正廣, 廣塚元彥 申請人:不二制油株式會社