白細胞介素－2/粒細胞－巨噬細胞集落剌激因子融合蛋白的製作方法

2023-05-08 15:33:21 1

專利名稱：白細胞介素－2/粒細胞－巨噬細胞集落剌激因子融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬基因工程領域，為一種白細胞介素2/粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白(IL2/GM-CSF)。
白細胞介素-2(IL-2)與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是兩類重要的細胞因子，它們作用於機體的免疫系統，激活免疫效應細胞，誘導產生其他細胞因子，從而使機體能有效地清除腫瘤細胞、病毒、或細菌、及真菌感染的細胞，在疾病的預防和治療中扮演了重要的角色。
IL-2有以下功能促進T淋巴細胞、B淋巴細胞的生長和分化；激活LAK細胞和TIL細胞；增強NK細胞的殺傷活性；刺激神經膠質細胞的增殖與分化；參與成熟T淋巴細胞凋亡的調控，並有免疫佐劑的作用。GM-CSF有如下功能維持和促進造血幹細胞以及某些成熟的血細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞)的生長；與IL-2協同，可大大促進T細胞的增殖，上調中性粒細胞粘附因子的表達；激活中性粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞，增強其抗原提呈功能和對病原體及腫瘤的殺傷功能；並可作為中性粒細胞和巨噬細胞的趨化因子。因此，IL-2與GM-CSF的聯合應用，具有較好的協同效應，尤其是GM-CSF在免疫感受階段能調節抗原的提呈，增強機體對特異性腫瘤抗原和某些胞內病原體(如病毒、寄生蟲、分枝桿菌)抗原的識別。GM-CSF與IL-2共同作用於免疫效應階段可增強機體對上述被識別抗原的清除能力。
使用IL-2/GM-CSF融合蛋白分子優於IL-2、GM-CSF兩者的聯合應用，因為該融合蛋白分子能同時與中性粒細胞(抗原提呈細胞)和T淋巴細胞結合，從而起到穩定兩者橋梁的作用，提高免疫識別的特異性及效率；而且，該融合蛋白分子能同時與同一細胞(如T淋巴細胞)的對應受體結合，從而使相應受體傳遞的信號強度增加，起著雙功能抗體的效應。
IL-2/GM-CSF融合蛋白的發明過程如下為了獲得含有IL-2/GM-CSF融合基因的質粒，我們對IL-2cDNA進行了亞克隆和末端改造，除去其終止密碼子和引入限制性內切酶SmaⅠ位點，即CCCGGG(見圖1、圖2)，構建IL-2-pLY4重組質粒；製備了GM-CSF cDNA(見圖3、圖4)；構建IL-2/GM-CSF重組質粒(見圖5)；將IL-2/GM-CSF-pLY4轉化大腸桿菌DH5α，獲得相應的工程菌Escherichia coli SIB-203-3pLY4-IL/G(CCTCCNo:M97001)，並對IL-2/GM-CSF融合基因實現了表達，表達效率為20-30％；IL-2/GM-CSF融合蛋白在細菌內主要以包涵體形式存在；分離純化蛋白並經復性處理。
本發明IL-2/GM-CSF融合蛋白，其IL-2的生物學活性為1×106U/mg，其GM-CSF的生物學活性為1×107U/mg。
通過下述實施例對本發明的技術特徵作詳細描述。
材料與方法一、細胞株、菌株與質粒CTLL-2(IL-2依賴細胞)，TF-1細胞株(GM-CSF依賴細胞)；菌株JM105,DH5α；質粒IL-2-pLY4(Ampr,4.6Kb，人IL-2表達質粒)，pLY-4(Ampr,4.6Kb，原核表達載體)，pUC 18/19(Ampr,2.7Kb)和M13mp18/19 RF DNA(7.3Kb)。
二、酶類限制性內切酶、綠豆芽核酸及RNaseA(華美生物工程公司)，T4聚合酶、DNA聚合酶ⅠKlenow片段、T4DNA連接酶(BRL)，mRNA純化Kit和cDNA合成Kit(Pharmacia)，TaqDNA聚合酶(Amersham)和DNA測序Kit(USB)。
三、主要生化試劑及材料IL-2及GM-CSF標準品(BoehringerMannheim)，dNTP、瓊脂糖(BRL)，丙烯醯胺及N,N′-二甲基雙丙烯醯胺(Fluka)，低分子量標準(東風生化試劑廠)，X-gal及IPTG(華美生物工程公司)。
四、質粒的製備DNA片斷的連接、轉化及轉化子篩選，限制性內切酶分析，DNA序列分析，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳等常規方法均參照文獻(Sambrook J et al.A Laboratory Methods-Molecular cloning,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York,2nd edition,1989.)。
五、樣品蛋白質含量測定1．紫外吸收法測定樣品在260mm和280mm波長的光吸收，按下式計算樣品中蛋白質含量。
蛋白質濃度(mg/ml)=(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數。
2．Bradford染色法①．染色液的配製100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95％乙醇中，隨後與100ml 85％(w/v)磷酸混合，用水稀釋至1000ml；②．標準測定法取0.1ml蛋白質樣品(0.2-1.4mg/ml)與5ml染色液混勻，靜置5-30分鐘後測定A595值；或微量測定法取0.8ml蛋白質樣品(5-1000mg/ml)與0.2ml染色液混勻後進行測定；標準曲線由BSA測得。
本發明的


如下圖1是人IL-2cDNA 3′端的改造和IL-2-pLY4重組質粒的構建。
IL-2*未修飾的IL-2cDNA；E:EcoRⅠ；B:BamHⅠ；S:SalⅠ；P:PstⅠ；Sm:SmaⅠ。
圖2是已修飾的IL-2cDNA的核苷酸序列。
圖3是GM-CSF cDNA的製備E:EcoRⅠ；B:BamHⅠ；S:SalⅠ；P:PstⅠ；Sm:SmaⅠ；N:NcoⅠ。
圖4是GM-CSF cDNA的核苷酸序列。
圖5是構建IL-2/GM-CSF-pLY4質粒的流程圖。
E:EcoRⅠ；B:BamHⅠ；S:SalⅠ；P:PstⅠ；Sm:SmaⅠ；N:NcoⅠ。
圖6是IL-2/GM-CSF融合基因連接的核苷酸序列分析。
圖7是IL-2/GM-CSF質粒的限制性酶切分析。
1:Ncol；2:EcoRⅠ(5.0kb)；3:EcoRⅠ+BamHⅠ(4.2Kb,0.8Kb)；M:λDNA(EcoRⅠ/HindⅢ)。
圖8是融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達及其存在形式W全細胞裂解液；S上清液；IB包涵體；P部分純化的IL-2/GM-CSF融合蛋白；M蛋白質分子量標準(94、67、43、30、17.5Kd)。
實施的具體步驟分別敘述如下(未註明具體方法的均按上述材料與方法上已指明的常規的操作)實施例1．引物寡聚脫氧核苷酸的設計與製備P1:5』TTTGGGGTGTGTGATACG 3』(18nt)與pLY-4質粒上EcoRⅠ位點上遊(48-30bp)處的序列一致；P2:5』GGGAGTCAGTGTTGAGATGAT 3』(21nt)與IL2 cDNA終止碼前18bp的序列互補，經PCR後除去終止密碼子，並引入SmaⅠ位點。
P3:5』ATGGCTCCGGCCCGCTCGCCCAGCCCC 3』(27nt)與編碼成熟GM-CSF(不含信號肽)的cDNA起始24nt一致，5』端攜ATG；插入SmaⅠ位點，可創造NcoⅠ位點。
P4:5』GGGATCCTTATCGCTCCTGGACTGGCTC 3』(28nt)與GM-CSF cDNA的末端18nt互補，並攜另外一終止碼TAA和BamHⅠ位點。(含一個多餘的鹼基作為酶切保護)P1、P2、P3和P4的合成均使用ABI公司的DNA合成儀、試劑及方法，由上海生化所合成。
實施例2．人IL-2 cDNA的末端改造及其全長核苷酸序列的測定。
為了獲得IL-2/GM-CSF融合基因，我們對IL-2 cDNA進行了亞克隆和末端改造，以除去其終止密碼子和引入SmaⅠ位點，即CCCGGG，並對其全長編碼序列進行了核苷酸順序測定(圖1和圖2)。
實施例3．GM-CSF cDNA的製備。
參照mRNA純化和cDNA合成Kit(Pharmacia)的說明，將PHA活化的健康人外周血單個核細胞106懸浮於1.5ml DNA抽提液中，用玻璃勻漿器碾磨細胞後，再追加3ml抽提液，充分混勻，離心收集上清；取Oligo(dT)-Cellulose Spum Column，混合內容物，350g離心2分鐘，棄去柱內液體；取4ml上述上清液上柱，與Oligo(dT)纖維素混勻，纖維素沉降後棄去液體，然後用高鹽緩衝液洗三遍，低鹽緩衝液洗二遍，最後用65℃預熱過的洗脫液洗脫三次，每次0.25ml，收集洗脫液，乙醇沉澱mRNA。
將mRNA溶於20μl重蒸水，65℃，10分鐘，置於冰上備用；在第一條反應混合液內加入lμl DTT溶液和熱變性好的mRNA，37℃保溫1小時；再將此反應液加入第二條鏈反應混合液中，11℃和22℃各1小時，最後加1μKlenow酶，37℃30分鐘，再用酚/氯仿抽提，經Sephacryl S-300柱純化後保存。
聚合酶鏈式反應。參照文獻(Innis MA et al.PCR Protocols,Academic pressInc,New York,1990)反應體積為100μl，依序加入模板DNA，25pmol的上、下遊引物P3+P4(見實施例1)，10×PCR buffer(10μl)、25mmol/L MgCl2(6μl)、2.5mmol/L 4×dNTP(2μl)，於0.5ml Eppendorf管中，100℃變性10分鐘後，立即冰浴，加入2U Taq DNA聚合酶和100μl石蠟油；在PCR儀上進行擴增95℃30秒，72℃1-2分鐘，循環30次後，72℃10分鐘；反應完成後，加入100μl氯仿抽提一次，回收上清，酒精沉澱後備用。它就是GM-CSF cDNA(見圖3、圖4)。
實施例4．IL-2/GM-CSF-pLY4重組質粒的構建。
按照圖5構建IL-2/GM-CSF-pLY4質粒的流程圖進行，並對IL-2/GM-CSF-pLY4質粒進行限制性酶切分析(見圖7)。
實施例5．IL-2/GM-CSF融合基因在大腸桿菌中的高效表達將IL-2/GM-CSF轉化大腸桿菌DH5α，獲得相應的工程菌Escherichiacoli,SIB-203-3 pLY4-IL/G(CCTCC,No:M 97001)。並對IL-2/GM-CSF融合基因實現了表達，表達效率為20-30％(圖8)。
同時，對IL-2/GM-CSF融合蛋白在細菌內的存在形式進行了鑑定，結果顯示表達產物主要以包涵體的形式存在(圖8)其具體操作是將含IL-2/GM-CSF融合基因表達質粒的細菌在30℃活化過夜，次日以1∶20稀釋到LB培養基中，30℃搖床擴增至A600=0.4-0.6，迅速轉至42℃進行熱誘導，繼續培養3小時後收集菌體，取少量菌體懸浮於適量1×樣品緩衝液中；再將菌體懸浮於1/20體積的1×PBS中，冰浴中超聲破碎菌體，15000rpm離心10分鐘，收集沉澱(即包涵體)和上清，進行SDS-PAGE分析。
實施例6．IL-2/GM-CSF融合蛋白的分離純化1．製備包涵體。5g菌體懸液於100mlLB(10mmol/L磷酸鈉緩衝液，pH7.0)，冰浴中超聲(電流270mA)，30秒×10次(每次間隔30秒)；裂解液於4℃離心10分鐘(8000g)，將沉澱懸浮於100mll×PBS(內含4M尿素，0.5％Triton X-100,20mmol/L EDTA)中進行漂洗，隨後離心(1000g×10分鐘)收集沉澱；漂洗兩次後，溶於50mmol/L磷酸鉀緩衝液(內含8mol/L尿素，10mmol/L DTT)中，15000g×15分鐘得上清，測A280/260，計算並調節蛋白質的濃度，使之為10-15mg/ml。
2．分子篩層析將製備的包涵體溶解液上樣於Sephacryl S-300柱(2.5×120cm)，上樣量不超過柱床體積2％；用洗脫液(50mmol/L磷酸鉀緩衝液，pH7.6,8mol/LDTT,1mmol/LEDTA)洗脫，流速15ml/小時，用蛋白檢測儀檢測，收集融合蛋白峰(SDS-PAGE)鑑定。
3．離子交換層析DEAE-Sepharose FF柱(柱體積2.6×10cm)用A溶液(同上述洗脫液)平衡5個柱體積後，將分子篩層析收集的融合蛋白質液(用洗脫液稀釋至電導≤洗脫液)以30ml/小時的流速上層析柱，並用A溶液洗脫至樣品A280恢復至基線；然後，用A和B溶液(A溶液加0.5mol/LNaCl)進行0-0.5mol/L NaCl的線性梯度洗脫，分管收集各洗脫峰。
實施例7．IL-2/GM-CSF融合蛋白的復性將純化的融合蛋白樣品調整至500μg/ml，加入DTT至終濃度10mmol/L，室溫放置1-2小時；隨後按1∶10稀釋於復性溶液(0.1mol/LTris.HCl,pH8.0,0.5mol/L L-精氨酸，2mmol/L EDTA,4mmol/L GSSG)中15℃復性24小時；此時DTT和尿素的溶液分別為1mmol/L和1mmol/L；復性完畢後，於1×PBS中透析過夜，過濾除菌分裝，儲存於-20℃備用。
實施例8．IL-2/GM-CSF融合蛋白活性的測定參照文獻(Glillis,Set al.Immunol,120:2027-2032,1978；Aggarwal,BA Gutterman Ju.Human Cytokines,Blackwell Scientific Publications,Boston,1991.)利用CTLL-2或TF-1細胞株3H摻入法對IL-2和GM-CSF的活性進行測定。部分純化的IL-2/GM-CSF融合蛋白經復性處理，測得其IL-2的活性為1×106U/mg,GM-CSF的活性為1×107U/mg。
權利要求
1．一種融合蛋白，其特徵在於將白細胞介素-2(IL-2)的基因與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因經過基因重組、表達而產生的融合蛋白，即白細胞介素-2/粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白(IL-2/GM-CSF融合蛋白)。
2．根據權利要求1所述的IL-2/GM-CSF融合蛋白，其特徵在於融合蛋白N端是IL-2序列；C端是GM-CSF序列。
3．根據權利要求1、2所述的IL-2/GM-CSF融合蛋白，其特徵在於IL-2與GM-CSF之間的接頭是脯氨酸(Pro)，基因的核苷酸接頭的聯碼是CCC。
4．根據權利要求1、2所述的IL-2/GM-CSF融合蛋白，其特徵在於將IL-2基因克隆入帶有PL啟動子，cIts857溫控阻遏蛋白的基因載體pLY4，構建成IL2-pLY4質粒；將質粒3′端切開，導入GM-CSF基因，形成IL2-NcoⅠ-GMCSF-pLY4表達質粒，其5′端含EcoRⅠ，3′端含BamHⅠ，中間含NcoⅠ位點，用內切酶消除NcoⅠ位點，構建成IL-2/GM-CSF-pLY4表達質粒，轉化大腸桿菌後獲得高效表達，轉化後工程菌為Escherichia coli SIB-203-3pLY4-IL/G(CCTCC NO:M97001)，表達產物IL-2/GM-CSF融合蛋白具有雙功能分子活性，即IL2的活性和GMCSF的活性。
5．根據權利要求4中所述的IL-2/GM-CSF-pLY4表達質粒構建，其特徵在於構建中使用設計合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1、P2、P3、P4，它們的核苷酸序列分別是P1 5′TTTGGGGTGTGTGATACG 3′(18nt)P2 5′GGGAGTCAGTGTTGAGTGAT 3′(21nt)P3 5′ATGGCTCCGGCCCGCTCGCCCAGCCCC3′(27nt)P4 5′GGGATCCTTATCGCTCCTGGACTGGCTC3′(28nt)
6．根據權利要求1、2所述的IL-2/GM-CSF-pLY4融合蛋白，其特徵在於融合蛋白中具有IL-2和GM-CSF雙功能分子，在體內能同時激活T細胞和巨噬細胞，同時又能通過融合蛋白拉近T細胞與抗原提呈細胞(APC)之間的距離，從而提高T細胞對APC的識別。
全文摘要
本發明為一種用基因工程技術生產的白細胞介素－2/粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白(IL－2/GM－CSF融合蛋白)。通過對rIL－2進行亞克隆和末端改造等措施與GM－CSF連接構建了IL－2/GM－CSF表達質粒,將其轉化大腸桿菌並得到了高效表達,融合蛋白具有IL－2和GM－CSF的的雙重活性。
文檔編號A61K38/19GK1225368SQ9911346
公開日1999年8月11日 申請日期1999年2月5日 優先權日1999年2月5日
發明者王小寧, 黃樹其, 高基民, 鄭仲承, 孫蘭英, 劉新垣 申請人:中國科學院上海生物化學研究所, 中國人民解放軍第一軍醫大學