生理活性物質的篩選方法

2023-05-07 23:50:41 1

專利名稱：生理活性物質的篩選方法
技術領域：
本發明涉及生理活性物質的篩選方法、基因調控劑及基因調控方法。
處於應激負荷狀態或由此而向疾病發展的狀態時，生物體內的各種機能、因素複合地相關，但其中實質上是存在基因的表達狀態的變化。因此，通過基因水平的調控，平穩地避免應激應該是可能的。但是，受應激的狀態、以及避免該應激的過程中的基因表達的調控的詳細情況尚不清楚，上述的通過基因水平的調控避免應激的方法尚未建立。
一方面，已知由瓊脂糖所得的L-甘油基-1，5-環氧-1αβ，6-二羥基-順-己-3-烯-2酮(以下稱為DGE)，具有各種生理活性，是維持生物體內平衡有用的化合物(國際公開第99/64424號公告)。但是該化合物的基因水平上的作用機制尚不清楚。
本發明的目的是提供篩選具有與DGE同樣的基因表達調控活性的生理活性物質或生理活性物質的侯補物質的方法、對維持生物體內平衡有效的，例如緩和或預防應激為目的的基因調控劑、以及基因調控的方法。
(i)選自以下式(I)表示的化合物、該化合物的衍生物及它們的鹽類中的至少1種化合物。 (式中，X和Y為H或CH2OH，但X為CH2OH時，Y為H，X為H時，Y為CH2OH)(ii)選自以下式(II)表示的3，6-脫水半乳糖、它的醛體、水合物及它們的2-O-甲基化物及2-O-硫酸化物的至少1種化合物；和/或選自還原末端有該化合物的可溶性糖化合物的至少1種化合物。 (2)測定(1)的生物體中基因的表達量，比較施加負荷①時和施加負荷②時的該值的步驟，以及(3)選擇被檢物質的步驟，該被檢物質使至少1種基因所表示的表達量變化與施加負荷②時實質上相同。
本發明的第2發明是生理活性物質的篩選方法，該方法包括以下步驟(1)將被檢物質負荷施加於生物體的步驟。
(2)測定(1)的生物體中基因的表達量和不施加相應的負荷時，該生物體中基因的表達量，並比較兩者的該值的步驟，以及(3)選擇被檢物質的步驟，該被檢物質使選自下述A群、C群、E群及F群中的至少一種基因的表達量減少，和/或使選自下述B群、D群及G群中的至少一種基因的表達量增加A群骨形態發生蛋白-6[BMP-6(基因庫登記號NM_001718)]基因、趨化因子受體-1[CCR-1(基因庫登記號NM_001295)]基因、肝細胞增殖因子[HGF(基因登記號X16323)]基因、細胞間粘附分子-1[ICAM-1(基因庫登記號NM_000201)]基因、白介素-1β[IL-1β(基因庫登記號X02532)]基因、白介素-16[IL-16(基因庫登記號M90391)]基因、白血病抑制因子[LIF(基因庫登記號NM_002309)]基因、骨橋蛋白[osteopontin(基因庫登記號NM_000582)]基因、腫瘤壞死因子-α[TNF-α(基因庫登記號X02910)]基因、神經纖維網-1[Neuropilin-1(基因庫登記號NM_003873)]基因、信號傳導物和轉錄激活物6[STAT6(基因庫登記號AF067575)]基因、以及含有智人(Homo Sapiens)cDNAFLJ22298倒位刺激基因(fis)，克隆HRC04637(基因庫登記號AK025951)的基因B群血紅素加氧酶[HO-1(基因庫登記號NM_002133)]基因、硫氧還蛋白還原酶-1(基因庫登記號AF106697)基因、推定的翻譯起始因子[SUI1(基因庫登記號AF083441)]基因、以及智人的(Homo Sapiens)推測的蛋白[HSPC014(基因庫登記號NM_015932)]基因、C群N-myc下遊調節性基因1[NDRG1(基因庫登記號NM_006096)]基因、腺苷脫氨酶、RNA特異性[ADAR(基因庫登記號NM_015841)]基因、剪接因子3b、亞基2[SF3B2(基因庫登記號NM_006842)]基因、
白介素增強子結合因子3[ILF3(基因庫登記號NM_004516)]基因、纈氨醯基-tRN合成酶2[VARS2(基因庫登記號NM_006295)]基因、以及含有序列表的序列號12中所述的鹼其序列的基因、D群真核生物翻譯延伸因子1α1[EEF1A1(基因庫登記號NM_001402)]基因、核糖體蛋白L17[RPL17(基因庫登記號NM_000985)]基因、核糖體蛋白L24[RPL24(基因庫登記號NM_000986)]基因、富含精氨酸/絲氨酸的剪接因子2[SFRS2(基因庫登記號NM_003016)]基因、翻譯調控的腫瘤蛋白1[TPT1(基因庫登記號NM_003295)]基因、還原型輔酶Q(ubiquinol)-細胞色素C還原酶結合蛋白[UQCRB(基因庫登記號NM_006294)]基因、核糖體蛋白S15a[RPS15A(基因庫登記號NM_001019)]、以及核糖體蛋白L27[RPL27(基因庫登記號NM_000988)]基因、E群白介素-2受體α[IL2RA(基因庫登記號X01057)]基因、白介素-6[IL6(基因庫登記號X04430)]基因、CD166(基因庫登記號Y10183)基因、幹擾素調節因子-1[IRF1(基因登記號X14454)]基因、白介素-15受體α[IL15RA(基因登記號U31628)]基因、核因子Kappa-bp105亞基[NFKB1(基因登記號M58603)]基因、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(カスパ-ゼ-1)[CASP1(基因登記號M87507)]基因、白介素-1β[IL1B(基因庫登記號M15330)]基因、腫瘤壞死因子-α[TNF-α(基因庫登記號X02910)]基因、Gr01癌基因[GR01(基因庫登記號X54489)]基因、
白介素-1α[IL1A(基因庫登記號M28983)]基因、抑制素βA[1NHBA(基因庫登記號J03634)]基因、白介素-7受體[IL7R(基因庫登記號M29696)]基因、前B細胞集落增強因子[PBEF(基因庫登記號U02020)]基因、肝和激活作用調節性趨化因子[LARC(基因庫登記號U64197)]基因、以及白介素-8[IL8(基因庫登記號M26383)]基因、F群集落刺激因子-1受體[CSF1R(基因庫登記號X03663)]基因、趨化因子(C-X-C基元)受體-4[CXCR4(基因庫登記號AF147604)]基因、以及エンドグリン[ENG(基因庫登記號NM_000118)]基因、G群血紅素加氧酶-1[HM0X1(基因庫登記號Z82244)]基因。
本發明的第3發明是篩選生理活性物質的方法，該方法包括下述步驟(1)分別對生物施加應激負荷、以及對生物體施加被檢物質和應激負荷的步驟。
(2)分別測定(1)的生物體以及未施加任何負荷的正常生物體中基因的表達量的步驟，以及(3)用由(2)所得的基因表達量就(1)的生物體和正常生物體作比較、選擇被檢物質的步驟，該被檢物質表現出選自下述(a)～(g)所述的基因表達模式中的至少一種基因的表達模式(a)選自上述A群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時減少；(b)選自上述B群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時進一步增加；(c)選自上述C群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體減少，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時進一步減少；
(d)選自上述D群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體減少，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時增加；(e)選自上述E群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時減少；(f)選自上述F群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，與正常生物體相同，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時減少；(g)選自上述G群的至少一種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，與正常生物體相同，對被生物體施加被檢物質和應激負荷時增加。
本發明的第3發明中，施加於生物體的應激負荷是用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯處理時，基因的表達模式如上述(a)～(d)的例子所示；施加於生物體的負荷是用脂多糖處理時，基因的表達模式如上述(e)～(g)的例子所示。
本發明的第1～3發明中，作為生物體，可以用生物個體或培養細胞來舉例說明。對於基因的表達量，可根據由該基因轉錄的mRNA量所測定的基因表達量來舉例說明，該測定尤其以通過使用DNA點陣的雜交法進行為合適。此外，本發明還包括由本發明的第1～3發明所得的物質。
本發明的第4發明涉及本發明的第1～3發明的篩選方法中所使用的DNA點陣，該DNA點陣的特徵是至少2個選自上述A～G群所述的基因或其片段在載體上預先規定的位置上固定化。
本發明的第5發明涉及基因調控劑，該調控劑的特徵是包含具有下述作用的化合物使選自上述A群、C群、E群及F群中的至少一種基因的表達量減少，和/或使選自上述B群、D群及G群中的至少一種基因的表達量增加。
本發明的第6發明涉及基因調控劑，該調控劑的特徵是包含具有下述作用的化合物在受到應激負荷的生物體中，使選自上述所示的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自上述所示的B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加。
本發明的第7發明涉及基因調控劑，該調控劑的特徵是包含具有下述作用的化合物在受到應激負荷的生物體中，使由於應激而增加表達量的選自上述A群及E群中的至少1種基因的表達量減少。
本發明的第8發明涉及基因調控劑，該調控劑的特徵是包含具有以下作用的化合物在受到應激負荷的生物體中，使由於應激而增加表達量的選自上述B群及G群中的至少1種基因的表達量增加。
本發明的第9發明涉及基因調控劑，該調控劑的特徵是包含具有下述作用的化合物在受到應激負荷的生物體中，使由於應激減少表達量的選自上述C群及F群中的至少1種基因的表達量減少。
本發明的第10發明涉及基因調控劑，該調控劑的特徵是包含具有下述作用的化合物在受到應激負荷的生物體中，使由於應激而減少表達量的選自上述D群中的至少1種基因的表達量增加。
本發明的第5～10發明中例示的基因調控劑是指，其包含的各種化合物是根據本發明第1～3中任何一個發明的篩選方法所得的物質的基因調控劑。此外，本發明的第5～10發明的基因調控劑是以緩和或預防應激為目的的基因調控劑的例子。
本發明的第11發明涉及基因的調控方法，該方法的特徵是，從上述(i)所述的化合物、上述(ii)所述的化合物、以及對至少1種基因具有和這些化合物實質上相同的基因表達調控活性的化合物中，選擇至少1種化合物，通過將此化合物或含有該化合物的組合物施予生物體，使選自上述A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自上述B群、D群和G群中的至少一種基因的表達量增加。
本發明的第12發明涉及基因的調控方法，該方法的特徵是從上述(i)所述的化合物，上述(ii)所述的化合物、以及對至少1種基因具有和這些化合物實質上相同的基因表達調控活性的化合物中，選擇至少1種化合物，通過將此化合物或含有該化合物的組合物施予受到應激負荷的生物體，使選自上述A群、C群、E群及F群的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自上述B群、D群和G群的至少一種基因的表達量增加。
本發明的第11和12發明中，上述(i)所述的化合物，或上述(ii)所述的化合物，和對至少1種基因有實質上相同的基因表達調控活性的化合物是由本發明的第1～3發明中任何一種篩選方法所得物質的例示。
該化合物可以由選自還原末端上有3，6-脫水半乳糖的化合物，例如瓊脂二糖、k-角叉菜那二糖(カラビオ一ス)及還原末端有3，6-脫水半乳糖的化合物中的至少1種化合物，在中性至鹼性條件下處理(維持)而得到。也可以將相應的化合物在pH7(未滿)進行酸水解和/或酶解，然後將所得的酸分解物和/或酶分解物在中性至鹼性的條件下處理(維持)而得到。
另外，上述的酶解舉例來說有還原末端有3，6-脫水半乳糖的化合物，如瓊脂糖，用α-瓊脂糖酶的分解。對進行酶解的條件無特定的限制，按照有關所使用的酶的公知條件即可。
還原末端有3，6-脫水半乳糖的化合物，例如選自瓊脂二糖、k-角叉菜二糖以及還原末端有3，6-脫水半乳糖中的至少1種化合物，在用pH超過7的鹼處理時，對於溶解或懸浮該化合物的鹼的種類無特別的限制，可以使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氨水等無機鹼，Tris(三羥甲基氨基甲烷)、乙胺、三乙胺等有機鹼，鹼的濃度也沒有特別的限定，但可以優選在0.001～5，更優選在0.001～1當量的濃度下使用。此外，處理溫度也無特別的限制，優選設定在0～200℃，更優選設定在20～130℃。另外，處理時間也沒有特別的限定，設定為數秒至數日都可以。鹼的種類和濃度、處理時的溫度及時間可根據作為原料的上述化合物的種類和以式(I)表示的目的化合物的生成量適當選擇。一般，pH只要超過7就可以，但選擇高濃度的鹼和高溫，而不是低濃度和低溫，可使式(I)表示的化合物的生成迅速進行。
例如，將瓊脂二糖或k-角叉菜二糖配製成pH11.5的水溶液，在37℃下保持5分鐘，即生成式(I)表示的化合物。
所生成的含有式(I)的表示的化合物的鹼溶液可以按照要求，中和後使用，或也可以作為pH低於7的酸性溶液使用。
作為本發明的式(I)表示的化合物的精製方法，可以採用化學的方法，物理的方法等公知的精製方法，例如可以將凝膠過濾法、通過分子量差示膜的差示法、溶劑提取法、使用離子交換樹脂等的各種色譜法等的精製方法，組合起來進行精製。
例如，由瓊脂二糖的中性到鹼性條件下的處理物精製為式(I)表示的X為CH2OH、Y為H的化合物；由k-角叉菜二糖的中性到鹼性條件下的處理物，精製為式(I)表示的X為H、Y為CH2OH的化合物。
此外，作為式(I)表示的化合物的衍生物，對於在生物體內，能表示與相應的化合物實質上相同的基因表達的模式無特別的限定，例如，可以使用由式(I)表示的化合物與含SH基的化合物(例如半胱氨酸、穀胱甘肽或其公知的衍生物)反應所得的化合物。另外，由式(I)表示的化合物與含有SH基的化合物反應所得的化合物的製造方法有國際公開第99/64424號公告中所述的公知方法。
作為式(I)表示的化合物或其衍生物的鹽，使用可藥用的鹽為合適，該鹽可以採用公知的方法進行轉換。
此外，式(I)表示的化合物DGE是瓊脂寡糖被攝入生物體內時生成的化合物，所以可以預測將瓊脂寡糖施予生物體時，會產生與DGE同樣的生物反應[Jpn.J.Phycol.(Sorui)4813-19，March 10，2000]。由此，人們認為對生物體給藥時，不使用本發明中以式(I)表示的化合物，而是由相應的化合物來生成，也可以使用選自上式(II)表示的3，6-脫水半乳糖、它的醛體、水合物及它們的2-O-甲基化物及2-O-硫酸化物中的至少1種化合物，和/或選自還原末端有該化合物的可溶性糖化合物中的至少1種化合物，(另外，關於3，6-脫水半乳糖的醛體、水合物、2-0-甲基化物以及2-O-硫酸化物，由國際公開第00/41579號公告中所述的化合物作為例子說明)。作為相應的化合物例子，無特別的限定，例如有瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖等瓊脂寡糖的例子。[1]本發明的生理活性物質的篩選方法以上述式(I)表示的化合物之一的DGE具有緩和生物體受到的損傷、促進維持生物體內平衡的作用。已知在上述受到應激的生物體中，DGE對於觀察到表達量有變化的基因的該表達量具有調控活性，亦即有基因表達調控活性(或作用)，該活性參與生物體內的各種基因的表達調控。而且也已知DGE具有各種生理活性，例如，誘發細胞程序死亡(アポト一シス)的活性、抗癌的活性、活性氧產生的抑制活性、過氧化脂質自由基產生的抑制活性、一氧化氮產生的抑制活性等抗氧化活性、抗病原微生物活性、抗變異原活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性、免疫調節作用、前列腺素合成抑制作用、抗炎症作用、抗變應性作用、細胞因子產生調節作用、抗風溼作用、抗糖尿病作用、滑膜細胞增殖抑制活性、熱激蛋白質產生的誘導作用等。因此，可以認為這些生理活性是由於DGE的基因調控作用，通過表達量的調節而使其表達的。
本發明的生理物質的篩選方法，以基於上述各種生理活性已知的DGE的基因調控作用的基因的表達量變化為指標，對至少表現出同樣的基因表達量的變化的DGE以外的物質，提供了一種篩選方法。亦即，提供在生物體內，至少表現出與DGE同樣的基因表達模式的物質的篩選方法。
由於根據本發明所得的物質表現出與DGE有同樣的基因表達調控活性，所以推測其是具有與DGE同樣的生理活性的物質。因此，使用該化合物，例如該生理活性的表達對於其有效解決的疾病和/或症狀(例如癌、炎症、變態反應、糖尿病等上述需要DGE的生理活性的疾病)的治療或預防來說，有可能提供有效的醫藥、食品、飲料等。
此外，也有可能獲得具有與DGE的生理活性不同的未知生理活性的物質，由此觀點，由本發明的生理活性物質的篩選方法也可以獲得生理活性物質的候補物質的篩選方法。
本發明的生理活性物質的篩選方法，具體是通過下述步驟可以得到具有與DGE同樣的基因表達調控活性的物質(1)以①被檢物質，及②上述(i)中所述的化合物和/或上述(ii)中所述的化合物作為負荷，分別施加於生物體的步驟、(2)測定(1)的生物體中基因的表達量、比較在施加負荷①時與施加負荷②時的該測定值，以及(3)選擇具有與DGE同樣基因表達調控活性的被檢物質的步驟，該被檢物質使至少一種基因表現出與施加負荷②時實質上相同的表達量變化。
另外，「實質上相同的表達量的變化」是指不一定是在表達量程度上的相等，而是指至少是表達量的變化模式相同的意思。
亦即，①測定施加了被檢物質負荷，即投予或攝取了被檢物質(以下同)的生物體樣品中的基因表達量、另一方面，測定施加了②的化合物負荷，例如上述式(I)表示的化合物，如DGE，的生物體樣品中的基因表達量、然後比較每種基因表達量和/或其變化，判定被檢物質和DGE各自的基因表達調控作用是否類似。基因表達調控作用類似的物質具有與DGE同樣的生理活性的可能性大，可以期望能用於與DGE同樣的使用目的中。
上述的具有DGE的基因表達調控作用並沒有特別的限定，例如，可以通過比較施加了DGE負荷的生物體與未施加該負荷時的該生物體(對照)之間的基因表達狀態(表達模式)來確認。這時，兩者間的表達量有差異的基因可認為是由DGE調控的對象基因。另外，DGE所具有的基因表達調控作用也可以如下述的實施例1所述，通過對生物體施加應激負荷來確認。
另外，本說明書中，對生物體無特別的限定，使用生物個體(人除外)或培養的細胞為合適。例如，使用生物個體時，可以從該個體取出適合的樣品，例如組織的一部分和體液等，研究其基因表達的狀態。
此外，對本發明篩選方法中使用的被檢物質無任何限定，天然來源的物質、人工合成的物質、將天然來源的物質經人工改變的物質等都可以使用。這些物質可以單獨的物質、也可以是包含多種物質的物質，任何一種都可使用，例如，也可以適當地將分離操作和本發明的篩選方法組合起來，將有用的物質精製或分離。
此外，通過使用本發明的篩選方法，例如，可以由與上述(i)所述的化合物或上述(ii)所述的化合物有實質上相同的生理活性的組合物，例如來源於植物、動物、擔子菌或微生物等天然來源的組合物，特定其活性成分。例如將構成這種組合物的化合物作為被檢物質，通過實施本發明的生理活性物質的篩選方法，可以特定其活性成分。
還有，由上述本發明的篩選方法所得的物質，即與上述(i)所述的化合物或上述(ii)所述的化合物有實質上相同的基因調控活性的物質也包括在本發明的範圍內。將被檢物質提供給本發明的篩選方法中，然後通過判定其是否具有該方法中規定的基因調控活性，即可獲得相應的物質。此外，作為相應的物質，舉例說明有植物、擔子菌類來源的物質及其衍生物，這裡使用的植物舉例說明有各種生理活性已知的藥用植物和海藻類等。
還有，對於上述來源的物質無特別的限定，包括含有作為組成成分的糖的物質，例如多糖類、它的分解物或它們的衍生物，特別是分子量為100-2000左右的物質為合適。進一步可以由這些物質，通過本發明的篩選方法，選擇對照物質(例如DGE)以外的具有基因調控活性的物質。作為上述含有組成成分糖的物質，特別合適的是分子內含有3，6-脫水半乳糖的物質。另外，分解物、衍生物，只要在生物體內表現出與其出發物質實質上相同的基因表達模式的物質即可，無特別的限定。
基因表達狀態的比較可用公知的方法進行，例如，測定相應的基因產物(多肽)量和由相應的基因轉錄的mRNA量。由上述的目的來看，測定mRNA的方法有效，較為合適。
例如，多肽量的測定，使用對該多肽或其片段特異結合的抗體進行為好。作為該抗體，多克隆抗體、單克隆抗體的任何一種都可以，還有，用公知技術修飾的抗體和抗體的衍生物，例如Fab片段、單鏈抗體等也可以使用。這些抗體及衍生物等可以按照公知的方法製備(例如參照1992年，John wiely Sons，Ine.發行，John E·Coligan編，Current Protocols in Immunology)。此外，作為多肽量的測定方法有，例如公知的酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法等。還有，為了在上述的多肽量的測定方法中便於檢測出上述的抗體，也可以進行各種標記。
對mRNA量的測定方法無特殊的限定，可以使用公知的方法，例如RT-PCR法、Northern雜交法、點印跡雜交法、使用DNA點陣的雜交法、DNA微珠法篝。由於使用DNA點陣的方法用微量的試樣即可以研究很多基因的表達狀態，所以對於上述的目的，該方法特別合適。
本說明書中的所謂「DNA點陣」是指基因或來源於基因的DNA片段固定在載體上預先規定的領域(位置)的元件，例如包括為DNA晶片的元件。此外，基因或來源於基因的DNA片段高密度固定在載體上的元件稱為DNA微點陣。
DNA點陣的載體只要是可以用於雜交的材料，則無特殊的限定，通常使用載玻片、矽晶片、硝酸纖維素膜和尼龍膜等。載體的表面可以是能通過共價或非共價結合、將單鏈DNA或雙鏈DNA固定化的任何一種表面，載體表面上有親水性或疏水性的官能基團的載體都可以適用，無特別的限定，例如有羥基、氨基、硫醇基、醛基、羧基、醯基的表面可以適用。這些官能基可以是載體本身的特性而存在的，也可通過表面處理而導入。作為這樣的表面處理物，例如有將玻璃用氨烷基矽烷等市售的有機矽烷偶合劑處理的表面、聚賴氨酸和聚乙烯亞胺等聚陽離子處理的表面。此外，一部分經過這種處理的載玻片在市場上有售。
對於在載體上固定化的基因或其DNA片段無特別的限定，例如基因組DNA文庫、cDNA文庫、通過以它們為模板的公知的核酸擴增法，例如，PCR(polymerase chain reaction)法、LCR(ligase chainreaction)法、SDA(strand displacement amplification)法和ICAN(isothermal and chimeric primer-initiated amplificationof nucleic acids)法(國際公開第00/56877號公告所述)等擴增的DNA，對擴增這此核酸的反應條件無特別的限定。另外，也可以使用通過RNA反轉錄所得的DNA，該RNA是通過以RNA為模板的轉錄擴增系統(TAS；Transcription-based amplification system)法、自主複製(3SR；self-sustaind sequence replication)法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification)法、TMA(transcription-mediated amplification)法、或者Qβ複製酶法擴增的RNA。
在載體上固定化的操作可以用市售的DNA點陣製作裝置，例如Affymetrix公司生產的DNA晶片製作裝置進行。通過使用該裝置，可以製作出基因高密度地排列並固定化的DNA點陣(DNA微點陣)。
本發明中所使用的DNA點陣可以是將任意基因或來源於該基因的DNA片段固定的DNA點陣，優選固定了編碼與生物體恆常性功能有關的蛋白的基因、或來源於該基因的DNA片段的點陣。此外，將各種基因的片段固定化的DNA微點陣已在市場上銷售(IntelliGene HumanCytokine CHIP等，寶酒造公司生產)，這種點陣也可以使用。還有，在該DNA點陣上固定化的基因或來自於該基因的DNA片段的選擇，可按以下方法進行，按下述實施例3中所述的DNA微珠法、減法、差示顯示法等，對生物體施加應激負荷，例如施加對生物體維持恆常性產生障礙的藥劑，如施加佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯和脂多糖等負荷，選擇施加負荷與未施加負荷的生物體之間的表達量發生變化的基因。
通過使用這樣的DNA點陣，可以同時測定核酸樣品中含有的多種核酸的量。而且還具有用少量的核酸樣品也能進行測定的優點。例如，對樣品中的mRNA進行標記、或以mRNA為模板製備標記的cDNA、使其與DNA點陣進行雜交，由此可以同時檢測樣品中轉錄的多個mRNA，並進一步測定其表達量。
施加DGE負荷和未施加DGE負荷的生物體中基因表達的差異，例如兩種情況下的基因表達模式，可以通過如以下所述的比較進行研究。
亦即，使來源於施加DGE負荷的生物體的樣品(DGE負荷樣品)中的核酸以及來源於未施加DGE負荷的生物體的樣品(對照樣品)中的核酸分別與DNA點陣雜交，通過比較所得的結果，可以檢測出表達量不同的基因。例如，用任意的方法標記上述樣品的核酸，針對與該核酸雜交的點陣，根據使用的標記，進行合適的信號檢測，比較點陣上各基因的DGE負荷樣品及對照樣品中的表達量。優選將DGE負荷樣品和對照樣品中的每種核酸預先用不同的方法標記好，採用能夠檢測多種標記，例如2種螢光標記的多波長檢測螢光分析儀，由同一DNA點陣上的競爭雜交可以對DGE負荷樣品中的基因表達量與對照樣品中的基因表達量之差進行比較。亦即，將兩者當量混合，與DNA點陣進行雜交，兩者的基因表達量之差可以按信號的顏色及強度的差異進行檢測。結果，根據所得的信號強度，兩者間的差別有優勢的某種基因，可特定為DGE的表達調控對象基因。
更具體地說，可以按照以下的步驟對DGE負荷樣品和對照樣品間的基因表達量的差別進行研究。
由來源於需要相互比較的生物的樣品，例如由經過不同的處理的細胞製備成mRNA、對樣品中的mRNA、該mRNA來源的cDNA或該cDNA轉錄或擴增的核酸進行標記。標記所用的標記物可以使用放射性同位素、螢光物質、化學發光物質、有發光團的物質等。例如，螢光物質有Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、異硫氰酸螢光素(FITC)、德克薩斯紅、若丹明等。此外，從同時檢測的觀點出發，最好用2種以上的螢光物質、較合適是用2種螢光物質對DGE負荷樣品、對照樣品分別用不同的螢光物質進行標記。另外，除了用化學方法標記樣品中的mRNA、該mRNA由來的cDNA或該cDNA轉錄或擴增的核酸以外，也可以用下述方法，例如在由mRNA合成cDNA時、或在由cDNA轉錄、擴增反應時與標記核苷酸共存進行標記。
然後，使上述的標記核酸與固定了對應於適當的基因的核酸或其片段的DNA點陣進行雜交。雜交可用公知的方法進行，雜交條件可以適當地選擇適合於所用的DNA點陣和標記cDNA的條件。例如，可按分子克隆，實驗室指南(Molecular Cloning，A laboratory manual)第2版，第9.52-9.55頁(1989)中所述的條件進行。
比較由上述雜交所得的來源於標記的信號，可以檢測出樣品信號強度存在有意義的差別的基因。具體地說，對於用上述方法標記的核酸樣品進行雜交的點陣，使用專用測定器，例如色譜掃描儀或圖像分析儀等，對放射能、螢光、發光等信號強度進行檢測，根據該信號強度的差別，可以檢測出其表達量有意義地變化的基因。標記的檢測法，可以根據所用的標記物質的種類選擇適合的方法。
用相互區別的標記物質對各種樣品來源的核酸(mRNA、來源於該mRNA的cDNA或由該cDNA轉錄或擴增的核酸)進行標記，由此可以通過一次雜交，對兩種樣品中的基因表達量的差別進行比較。例如，上述用Cy3和Cy5作為標記物質的情況下，通過在532nm和635nm的波長下分別對Cy3和Cy5進行掃描，可以在1片DNA點陣上測定兩種樣品中的基因表達量。
這樣，可以用微量的樣品對不同樣品之間的多種基因表達量進行比較。
另外，為了測定DGE負荷樣品和對照樣品的基因表達差別，必須對兩者的mRNA量及使用的螢光物質間的強度差別進行修正，該修正可以用表達變化較少的標準基因(持家基因為合適)按公知的方法進行。
此外，本說明書中，判定基因表達量的差為佔優勢的情況是，例如，DGE負荷樣品中基因表達量相對於對照樣品中基因表達量的比，亦即，相對表達比率(DGE負荷樣品中基因表達量/對照樣品中基因表達量)為1.7以上或0.6以下。這裡，相對表達比率為1.7以上時，判定為表達量增加的基因；0.6以下時判定為表達量減少的基因。
此外，DGE負荷樣品和對照樣品間的基因表達量的差，也可以按公知的DNA微珠點陣法進行。根據該方法，對表達量、和無論已知或未知的表達的基因都可進行分析。
按照上述的方法，對給予或攝取DGE的生物體和未給藥的對照之間的基因表達狀態進行比較，可以確定DGE能調控其表達的基因。以上那樣確認的、作為DGE能對其產生基因表達調控作用的基因，例如可舉出下述表1～3中所示的A～G群中所述的基因。
生物由於生活環境的變化等外部因素，病毒、細菌感染等內在的因素，受到各種各樣的應激。作為應激，舉例說明有，例如高溫、低溫環境、飢餓狀態、暴露於化學物質中等。這裡，作為化學物質，例如有佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA)、脂多糖(LPS)、植物血球凝集素(PHA)、辛酸(オカダ酸)等。尤其是TPA和LPS，對生物體給藥可引起炎症，利用這種作用，可用來製作人工的炎症模型。
受到這種應激的結果是，在生物體內，各種基因的表達發生變化。其中也存在應激的結果是表達誘導或增強，而對生物體產生不利影響的基因群(例如，A群及E群的基因)。也有為了除去應激的不利影響而使表達誘導或增強、或與未受應激的情況下的表達相同的基因群(例如B群及G群的基因)。受到應激，A群及E群基因產生高表達的狀態，如果該表達處於持續不降低的狀態，一般認為與各種疾病的發病有關。因此，受到應激時，使A群及E群的基因的表達處於難以增加的狀態與各種疾病的預防有關。此外，受到應激時，使增加的A群及E群的基因的表達迅速地降低，這也與各種疾病的預防、治療、防止惡化有關。一方面，B群及G群的基因屬於為了避免應激狀態而增加表達的基因群，受到應激時，這樣的基因群的表達變得更高，這樣可能迅速地避免應激的狀態，一般認為與各種疾病的預防、治療、防止惡化有關。
還有，如果說，應激的結果，為了除去應激的不利影響，而存在使表達減少或與未受應激的情況下的表達相同的基因群(例如C群及F群的基因)，那麼也存在應激的結果，使表達減少而對生物體產生不利影響的基因群(例如D群的基因)。一般認為C群的基因是為了避免應激的狀態而減少表達的基因群，受到應激時，這樣的基因群的表達量進一步抑制，這樣有可能迅速地避免應激的狀態，與應激引起的各種疾病的預防、治療、防止惡化有關。一方面，一般認為，受到應激，D群的基因產生表達降低的狀態，如果其表達持續處於不增加的狀態，則與各種疾病的發病有關。因此，受到應激時，D群的基因的表達增加與各種疾病的預防有關。另外，受到應激時，使減少的D群基因的表達迅速地增加也與各種疾病的預防、治療、防止惡化有關。
根據本發明已查清，DGE抑制其表達(使其減少)的A群、C群、E群及F群的基因、以及DGE促進其表達(使其增加)的B群、D群及G群的基因在表1～3中表示。表1基因名稱基因庫登記號A群骨形態發生蛋白-6(BMP-6) NM_001718趨化因子受體-1(CCR-1) NM_001295肝細胞增殖因子(HGF) X16323細胞間粘附分子-1(ICAM-1)NM_000201白介素-1β(IL-1β) X02532白介素-16(IL-16)M90391白血病抑制因子(LIF) NM_002309骨橋蛋白(osteopontin) NM_000582腫瘤壞死因子-α(TNF-α) X02910神經纖維網-1(Neuropilin-1) NM_003873信號傳導物和轉錄激活物6(STAT6) AF067575含有智人cDNAFLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637的基因 AK025951B群血紅素加氧酶-1(H0-1)NM_002133硫氧還蛋白還原酶-1 AF106697推定的翻譯起始因子(SUI1)AF083441智人的推測的蛋白(HSPC014) NM_015932表2基因名稱 基因庫登記號C群N-myc下遊調節性基因1(NDRG1) NM_006096腺苷脫氨酶，RNA特異性(ADAR) NM_015841剪接因子3b，亞基2(SF3B2) NM_006842白介素增強子結合因子3(ILF3) NM_004516纈氨醯基-tRNA合成酶2(VARS2) NM_006295含有序列表的序列號12中所述的鹼基序列的基因 無D群真核生物翻譯延伸因子1α1(EEF1A1) NM_001402核糖體蛋白L17(RPL17) NM_000985核糖體蛋白L24(RPL24) NM_000986富含精氨酸/絲氨酸的剪接因子2(SFRS2) NM_003016翻譯調控的腫瘤蛋白1(TPT1) NM_003295還原型輔酶Q-細胞色素c還原酶結合蛋白(UQCRB)NM_006294核糖體蛋白S15a(RPS15A)NM_001019核糖體蛋白L27(RPL27) NM_000988表3基因名稱 基因庫登記號E群白介素-2受體α(IL2RA) X01057白介素6(IL6) X04430CD166 Y10183幹擾素調節因子-1(IRF1)X14454白介素-1 5體α(IL15RA)U31628核因子kappa-b p105亞基(NFKB1) M58603天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(CASP1) M87507白介素-1β(IL1B) M15330腫瘤壞列因子-α(TNF-α) X02910Gro1癌基因(GR01) X54489白介素-1α(IL1A) M28983抑制素βA(INHBA) J03634白介素-7受體(IL7R)M29696前B細胞集落增強因子(PBEF) U02020肝和激活作用調節性趨化因子(LARC) U64197白介素-8(IL8) M26383F群集落刺激因子-1受體(CSF1R) X03663趨化因子(C-X-C基元)受體-4(CXCR4) AF147204エンドグリン(ENG) NM_000118G群血紅素加氧酶-1(HM0X1) Z82244
對被檢物質，與上述DGE同樣地進行基因表達調控作用的研究，並通過與DGE的比較，可選擇出與DGE有同樣的基因表達調控活性的物質。另外，在施加被檢物質負荷的場合與施加DGE負荷的場合的基因表達量的變化比較中，亦即在表達模式的比較中，可以對至少1種基因進行比較，但從發現更有用的物質的觀點出發，優選對多種基因的表達模式進行比較。在這方面對本發明無特別的限定，例如優選對2種以上的基因、較優選對4種以上的基因、更優選對7種以上的基因的表達模式進行比較，選擇所需要的具有基因表達調控活性的物質。
作為合適的方案，可以從上述的表1～3所示的A群～G群中選擇至少1種基因進行比較，較優選的是從A群、C群、E群及F群中選擇至少1種基因，以及從B群、D群及G群中選擇至少1種基因(共計2種以上的基因)、更優選從A群～G群的每個群選擇至少1種基因(共計7種以上的基因)、並對其表達模式進行比較。
此外，在以上的見解的基礎上，根據本發明，提供如以下所述的本發明的生理活性物質篩選方法的其他方案。亦即，根據本發明，提供包含下述步驟的生理活性物質的篩選方法(1)將被檢物質負荷施加於生物體的步驟、(2)測定(1)的生物體中基因的表達量和未施加相應負荷的生物體中基因的表達量，比較兩者的該測定值的步驟，以及(3)選擇被檢物質的步驟，該被檢物質可使選自表1～3中的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加。根據該方法，可以簡便地得到與DGE有同樣基因表達調控活性的物質。
此外，更詳細而言，提供了如以下所述的本發明的生理活性物質的篩選方法的其他方案。亦即，根據本發明，提供包含下述步驟的生理活性物質的篩選方法(1)分別對生物體施加應激負荷、以及對生物體施加被檢物質和應激負荷的步驟、(2)分別測定(1)的生物體以及未施加任何負荷的正常生物體中的基因表達量的步驟，以及(3)用由(2)所得的基因表達量就(1)的生物體和正常生物體作比較、選擇被檢物質的步驟，該被檢物質表現出選自下述(a)～(g)所述的基因表達模式中的至少一種基因的表達模式(a)選自上述A群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時減少。
(b)選自上述B群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時進一步增加。
(c)選自上述C群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體減少、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時進一步減少。
(d)選自上述D群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體減少、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時增加。
(e)選自上述E群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時減少。
(f)選自上述F群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，與正常生物體相同、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時減少。
(g)選自上述G群的基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，與正常生物體相同、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時增加。根據該方法，可以簡便地得到與DGE有同樣的基因調控活性的物質。
另外，上述的2種其他方案中，可以用與上述的DGE同樣的方法，對被檢物質的基因表達調控作用進行研究。此外，對生物體施加應激負荷，可按上述那樣，將各種應激負荷施加於生物體，但優選用化學物質進行為合適，尤其是TPA(波佛醇肉豆蔻酸乙酸酯)處理或LPS(脂多糖)處理更為合適。這裡所說的處理是指投予或使其攝取。
已知TPA是致癌的促癌劑，並已知它的作用除了直接變異作用外，還通過誘導生物體的炎症而致癌。亦即，TPA引起NO、前列腺素E2等炎症介體與巨噬細胞等炎症細胞的分離。
LPS是細胞因子誘導因子、對生物體產生發熱、致死效果、血壓降低等各種影響，但該作用不是LPS本身的直接作用，而是通過LPS，以巨噬細胞為中心的宿主細胞產生的炎症性細胞因子等所引起的作用。
上述A～D群是用TPA作為應激時，確認為基因有變化的基因群，而上述的E～G群是用LPS時確認為基因有變化的基因群。由於DGE抑制由TPA和LPS誘發的炎症，亦即，在上述步驟中的用TPA處理作為應激時，如果選擇表現出上述基因表達模式(a)～(d)的化合物，對於誘發機制和TPA誘發的炎症相同的炎症來說，可期望得到對其治療或預防有效的化合物，另外，用LPS處理作為應激時，選擇表現出上述基因的表達模式(e)～(g)的化合物，對於誘發機制和LPS誘發的炎症相同的炎症來說，可期望得到對其治療或預防有效的化合物。
另外，基因調控作用稍有不同的物質也可能具有DGE所具有的生理活性中的幾種生理活性。這樣的物質也可以作為DGE的替代物，根據其目的而使用。
還有，作為另一種方案，還提供適用於本發明的生理活性物質的篩選方法的試劑盒。該試劑盒至少要含有用來檢測選自表1～3中所示的A群～G群的至少1種基因所表達的mRNA或其片段的引物和/或探針、或對應於該基因編碼的多肽或其片段的抗體或其片段。[2]本發明的DNA點陣本發明還提供用於上述生理活性物質篩選方法中的DNA點陣，該DNA點陣是將選自上述A～G群基因中的至少2種基因或其片段在載體上預先規定的位置固定化的DNA點陣。本發明的DNA點陣是上述受到DGE表達調控的基因或該基因來源的DNA片段在載體上預先規定的位置固定化的點陣。亦即，在載體上預先決定與各個基因對應的DNA或其片段的位置，使用這樣的點陣時，由檢測的信號的位置，可以直接知道該信號來自哪個基因的DNA或其片段。該點陣可用於上述[1]的生理活性物質的篩選、以及對DGE的投予或攝取有效的疾病從基因方面對病態的分解。
上述DNA點陣上固定的基因或其DNA片段，只要是受到施加於生物體的應激和DGE的表達調控的基因或其DNA片段、或者是含有這些基因或其DNA片段的物質，則無特別的限定，例如可以用下述的實施例3中所述的DNA微珠法，選擇固定化的基因或其DNA片段。此外，也可以含有受到施加於生物體的應激和DGE表達調控的基因以外的基因，例如，作為陰性對照的基因等。另外，該點陣可以按照公知的方法製造，例如，可以使用上述[1]中所述的DNA點陣製作裝置來製造。
本發明的DNA點陣中，基因或其DNA片段採用單鏈或雙鏈固定都可以。還有，多聚核苷酸、寡核苷酸的任何一種都可以使用，而且，對其製法無特別的限定，化學法合成的、天然物質、酶法合成的，或其組合都可以。另外，基因或其DNA片段的鏈長無特別的限定，但最好長度為約20個鹼基～約1kb(キロ塩基)，而且，比該鏈的長度短或長的基因或DNA片段，只要它與任意的被檢樣品中的核酸雜交時進行特異雜交，都可以使用。
點陣的載體、DNA固定化的密度也無特別的限定，根據目的和固定化的基因數適當選擇即可。例如，作為DNA點陣的載體，可以用上述的材料，只要是可用於雜交的材料則無特別的限定，通常使用載玻片、矽晶片、硝酸纖維素和尼龍膜等。此外，製作大量的基因固定化的點陣和適用於微量樣品的點陣時，可採用基因在載體上高密度地固定的微點陣。作為該微點陣，核酸、特別是DNA，以100個點/cm2以上的密度固定化為合適。另外，對其形狀也無特別的限定，可適當選擇平板狀、圓盤狀、帶狀等。〔3〕本發明的基因調控劑、基因調控方法本發明還涉及生物體中的基因表達的調控方法，對該方法無特別的限定，對於受到應激的生物體中表達量發生變化的基因，提供對相應的基因的表達進行調控(調節)、保持生物體內平衡的方法、以及該方法所用的基因調控劑。
例如，一般認為，對受到上述的應激的生物體的影響，可能通過對該生物體中的基因的表達進行適當的調控而消除。為此，使用能對該基因，例如表1～3中所舉出的基因，進行調控的化合物、或將該化合物作為有效成分而包含在內的組合物，亦即，根據本發明提供的基因調控劑是有效的。因此，該基因調控劑特別適用於應激的緩和或預防。
上述的基因調控劑中可以作為有效成分包含在內的化合物，例如可使用DGE、DGE衍生物和/或它們的鹽類；還可以使用具有與DGE同樣的基因表達調控活性的化合物、其衍生物和/或它們的鹽類。另外，該化合物的衍生物可以與上述式(I)表示的化合物的衍生物同樣地製造。作為具有與DGE同樣的基因表達調控活性的化合物，可以使用上述〔1〕中所述的通過篩選所得的物質。
相應的基因調控劑可以按照公知的藥物製造方法製備。例如，將上述有效成分與公知的藥用液狀或固體狀載體混合，進一步按照要求，加入公知的溶劑、分散劑、乳化劑、穩定劑、潤滑劑等，即可製成液劑、懸濁劑、乳劑等液體製劑、或片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑等固形製劑。
上述的載體可根據本發明的基因調控劑的給藥方式及劑型而選擇。作為口服劑時，例如適宜採用澱粉、乳糖、甘露醇、羧甲基纖維素等。一方面，用作非口服劑時，例如，適宜採用注射用蒸餾水、生理鹽水、大豆油、丙二醇等。
本發明的基因調控劑中的上述有效成分的含量不能根據基因調控劑的給藥方式，給藥方法等的變化一概而定，但只要是按照能獲得本發明所要求的效果的量，而將上述有效成分給藥，則對該量無特別的限定。
本發明的基因調控劑根據劑型通過適當的給藥途徑，可以口服或非口服給藥。非口服給藥時，例如作為注射劑，可以通過靜脈內、肌肉內、皮下、皮內等給藥。對該給藥量也無特別的限定，例如，根據劑型、給藥方法、使用目的、給藥對象患者的年齡、體重、症狀等，在可獲得本發明所要求的效果範圍內適當決定。
本發明的基因調控劑具體可用以下例子說明。
(1)含有某種化合物而製成的基因調控劑，該化合物具有使選自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群的至少1種基因的表達量增加的作用；(2)含有某種化合物而製成的基因調控劑，在受到應激負荷的生物體中，該化合物具有使選自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群的至少1種基因的表達量增加的作用；(3)含有某種化合物而製成的基因調控劑，在受到應激負荷的生物體中，該化合物具有使因應激而增加表達量的選自表1～3所述的A群及E群的至少1種基因的表達量減少的作用；(4)含有某種化合物而製成的基因調控劑，在受到應激負荷的生物體中，該化合物具有使因應激而增加表達量的選自表1～3所述的B群及G群的至少1種基因的表達量增加的作用；(5)含有某種化合物而製成的基因調控劑，在受到應激負荷的生物體中，該化合物具有使因應激而減少表達量的選自表1～3所述的C群及F群的至少1種基因的表達量減少的作用；(6)含有某種化合物而製成的基因調控劑，在受到應激負荷的生物體中，該化合物具有使因應激而減少表達量的選自表1～3所述的D群的至少1種基因的表達量增加的作用；進一步根據本發明，提供以下的基因調控方法將選自上述(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物，以及對至少1種基因具有與這些化合物實質上相同的基因表達調控活性的化合物中的至少1種化合物、或含有該化合物的組合物，施予生物體，由此使選自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加的基因調控方法、以及將選自上述(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物，以及對至少1種基因具有與這些化合物實質上相同的基因表達調控活性的化合物中的至少1種化合物、或含有該化合物的組合物，施予受到應激負荷的生物體，由此使選自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群的至少1種基因的表達量增加的基因調控方法。
這裡所說的生物體是指哺乳動物，尤其是指人。此外，作為對至少1種基因實質上有相同的基因表達調控活性的化合物，可以適當地使用上述〔1〕中所述的通過篩選方法所得的物質。
根據這樣的基因調控方法，可以合適地對表1～3所示的基因的表達進行調控，有可能緩和和/或避免生物體受到的應激。
另外，作為有效成分給藥的化合物或含有該化合物的組合物的給藥方法、給藥量等，可以與上述基因調控劑相同。
根據本發明的基因的調控方法，在抑制因應激而對生物體產生不利影響的基因群的表達的同時，增強與避免應激狀態有關的基因群的表達，可以對各種疾病進行預防、治療、阻止惡化。
以下，舉出實施例對本發明進一步具體地說明，但本發明不限定於這些實施例。
實施例1(1)RNA的製備將HL-60細胞(ATCC CCL-240)懸浮於含有10％牛胎兒血清(JRHバイオサイエンシズ公司生產)、1.3％含有二甲亞碸的RPMI1640培養基(バイオウイタカ-公司生產，12-702F)中，5％碳酸氣存在下、37℃下培養1周、分化誘導成嗜中性細胞。
將上述所得的細胞離心分離回收，按106個細胞/ml的濃度懸浮於含10％牛胎兒血清的RPMI1640培養基中，每個10cm的培養皿中加入10ml。設定各個培養皿中加入100μl的4mM DGE水溶液，4小時後回收總RNA的組、添加10μl的100μg/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA、ギブコ社制、13139-019)二甲亞碸溶液，4小時後回收總RNA的組、添加100μl的4mMDGE水溶液，培養6小時後再添加10μl的100μg/ml TPA二甲亞碸溶液，4小時後回收總RNA的組。此外，設定添加100μl的水、4小時後回收總RNA的組，作為陰性對照。另外，用Rneasy Mini試劑盒(キアゲン公司生產，74104)，按照試劑盒的說明書製備。
(2)cDNA的合成將上述所得的各總RNA 25μg和100pg的λpolyA+RNA-A(寶酒造公司生產，TX802)，用RNA螢光標記核心試劑盒(寶酒造公司生產，TX807)和1mM F luoroLink Cy3-dUTP或Cy5-dUTP(Amersham·Pharmacia公司生產，PA53022(Cy3)、PA55022(Cy5))、按試劑盒的說明書進行螢光標記的cDNA合成反應和精製。將螢光標記的DNA溶液按表4的組合混合，用氯仿·異戊醇(24∶1)進行抽提、加入2μl的5×CompetitorI(Human)(寶酒造公司生產，TX808)、用乙醇沉澱、回收DNA。所得的DNA溶於10μl的雜交溶液(經過0.22μm的過濾器過濾的6×SSC、0.2％SDS、5×Denhard溶液、0.1mg/ml變性鮭魚精子DNA溶液)中，備作雜交之用。
表4

(3)雜交在蓋玻片(22×22mm)上滴下10μl的預雜交溶液(經過0.22μm的過濾器過濾的6×SSC、0.2％SDS、5×Denhard溶液、1mg/ml變性鮭魚精子DNA溶液)，將人細胞因子晶片(ver.1.0)(寶酒造公司生產，X104)的DNA點陣DNA面向下地復蓋在蓋玻片上，而且不使氣泡進入。將晶片翻過來，使DNA面向上、用膠紙(コクヨ社制，タ-100)將蓋玻片周邊滴下的溶液封閉，在室溫下放置2小時進行預雜交。將晶片移至2×SSC中並將膠紙和蓋玻片取下，在2×SSC中、然後在0.2×SSC中洗淨後，通過離心除去水份使其乾燥。
使上述的溶於雜交液的螢光標記DNA溶液在95℃下加熱2分鐘使其變性後，離心、並將上清液滴下至蓋玻片(22×22mm)上，將經過上述處理的晶片的DNA點陣面向下地復蓋在蓋玻片上、而且不使氣泡進入。將晶片翻過來，使DNA面向上、用膠紙將蓋玻片周邊滴下的溶液封閉。將此晶片放入溼箱後，置於65℃的恆溫槽內保溫16小時。將晶片移至2×SSC中並將膠紙和蓋玻片取下，在55℃的2×SSC、0.2％SDS中洗2次，每次30分鐘、然後在65℃的2×SSC、0.2％SDS中洗5分鐘、在室溫的0.05×SSC中洗5分鐘後，通過離心除去水份使其乾燥。
(4)分析用Affymetrix418點陣掃描儀(寶酒造公司生產，GM205)讀取上述晶片的各個點的螢光信號。以該圖象數據為基礎，用ImaGene(寶酒造公司生產，，BD001)對各個點的螢光信號進行定量。結果，可以確認，TPA添加組中，有幾個基因的表達有變化、與此對應，可以確認，DEG+TPA添加組中，該變化進一步上下變動。亦即，可以確定，對於某幾個基因，DGE對因TPA引起的基因變化有修飾作用。該結果歸納在表5中表示。表5歸納了因TPA而產生變化的基因中，通過DGE修飾其變化的基因，A-1群是通過DGE抑制其表達的基因、B-1群是通過DGE促進其表達的基因。
表5基因名稱 基因庫登記號A-1群骨形態發生蛋白-6(BMP-6) NM_001718趨化因子受體-1(CCR-1)NM_001295肝細胞增殖因子(EGF) X16323細胞間粘附分子-1(ICAM-1) NM_000201白介素-1β(IL-1β) X02532白介素-16(IL-16) M90391白血病抑制因子(LIF) NM_002309骨橋蛋白(osteopontin NM_000582腫瘤壞死因子(TNF-α) X02910神經纖維網-1(Neuropilin-1) NM_003873B-1群血紅素加氧酶-1(H0-1) NM_002133硫氧還蛋白還原酶-1 AF106697實施例2(1)PBMC的分離及保存從健康人供體採血400ml。採集的血液用PBS(-)稀釋2倍、在Ficoll-paque(Pharmacia公司生產)上分層後在500×g下離心20分鐘。用移液器回收中間層的外周血單核細胞(PBMC)、用RPMI1640培養基(バイオウイタカ-公司生產)洗淨。採集的PBMC懸浮於90％FCS(JRHバイオサイエンシズ公司生產)/10％二甲亞碸的保存液中，保存在液氮中。實驗時，將保存的PBMC在37℃的水浴中迅速融解、用含10μg/ml DNase(DNA酶，カルビオケム公司生產)的RPMI1640培養基洗淨後，用錐蟲藍染色法算出活細胞數供各實驗之用。
(2)塑料粘著性單細胞的分離將PBMC按照1×107個細胞/ml的濃度懸浮於含有5％的人AB血清、0.1mM非必須胺基酸、1mM丙酮酸鈉、2mM L-穀氨醯胺(以上バイオウイタカ-公司生產)、10mMHEPES(ナカライテスク公司生產)、1％鏈黴素-青黴素(ギブコBRL公司生產)的RPMI1640培養基(以下簡稱為5HRPMI培養基)中、然後在每個100mm的培養皿(旭テクノグラス公司生產)上塗布15ml、在37℃下、5％的CO2的溼式保溫箱內保溫1.5小時。然後吸去非粘著性的細胞，用RPMI1640將各池洗淨、加入10ml的5HRPMI培養基，即得到塑料粘著性的單細胞。
(3)RNA的製備設定實施例2-(2)所得的各培養皿中加入10μl的1μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司生產，L-2012)水溶液，4小時後回收總RNA的組、添加10μl的20mM DGE水溶液培養4小時後再加10μl的1μg/ml LPS水溶液，4小時後回收總RNA的組。此外，設定作為陰性對照、添加10μl的水，4小時後回收總RNA的組。另外，RNA用Rneasy Mini試劑盒(キアグン公司生產，74104)，按試劑盒的操作說明書製備。
(4)cDNA的合成cDNA的合成按實施例1-(2)所述的方法進行。但是，螢光標記的DNA溶液的組合按照表6進行。
表6

(5)雜交雜交按照實施例1-(3)所述的方法進行，但晶片採用人細胞因子晶片(ver.1.0)(寶酒造公司生產，X104)。
(6)分析用Affymetrix 428 Array Scanner(寶酒造公司生產)讀取上述晶片上各個點的螢光信號。用ImaGene(寶酒造公司生產，BD001)對該圖象數據的各個點的螢光信號進行定量。結果，可以確認，有幾個基因在添加LPS的組的表達增加，與此相對，也可以確認，由於添加了DGE而抑制了該表達的增加。此外，有幾個基因雖然在添加LPS的組未看到表達的變化，但可以確認在添加DGE+LPS的組表達的增加和下降。其結果歸納如表7所示。表7總結的內容是因LPS使其表達增加的基因中，通過DGE抑制該增加的基因(E群)、雖然LPS使其表達無變化，但在DGE+LPS的組其表達下降的基因(F群)和增加的基因(G群)。表7基因名稱 基因庫登記號E群白介素-2受體α(IL2RA)X01057白介素6(IL6) X04430CD166Y10183幹擾素調節因子-1(IRF1) X14454白介素-15受體α(IL15RA) U31628核因子kappa-b p105亞基(NFKB1)M58603天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(CASP1)M87507白介素-1β(IL1B) M15330腫瘤壞列因子-α(TNF-α) X02910Gro1癌基因(GR01) X54489白介素-1α(IL1A) M28983抑制素βA(INHBA) J03634白介素-7受體(IL7R) M29696前B細胞集落增強因子(PBEF)U02020肝和激活作用調節性趨化因子(LARC) U64197白介素-8(IL8)M26383F群集落刺激因子-1受體(CSF1R)X03663趨化因子(C-X-C基元)受體-4(CXCR4) AF147204エンドグリン(ENG)NM_000118G群血紅素加氧酶-1(HM0X1)Z82244
實施例3 DNA微珠的製作和基因的選擇按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第97卷，第1665-1670頁(2000年)(以下稱為文獻1)所述的方法，如以下所示的方法製作DNA微珠。
(1)cDNA的合成將人前骨髓性白血病細胞HL-60細胞(ATCC CCL-240)懸浮於含有10％牛胎兒血清(JRHバイオサイエンシズ公司生產)、1.3％二甲亞碸的RPMI1640培養基中(バイオウイタカ一公司生產)，在5％碳酸氣存在下，37℃下培養1周，使上述細胞分化誘導成嗜中性細胞。將所得的細胞離心回收，按照1×106個細胞/ml的濃度懸浮於含有10％牛胎兒血清的RPMI1640培養基中，然後將此懸浮液加入2個10cm的培養皿內，每個10ml。1個培養皿內加入100μl的水(A)，另一個培養皿內加入10μl的100μg/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA，ギブコ公司生產)二甲亞碸溶液(B)，分別培養4小時。用Trizol試劑(ギフゴ公司生產)分別由每個培養皿回收的(A)、(B)的細胞製備總RNA，然後用オリゴテツクスTM-dT30(寶酒造公司生產)由總RNA精製mRNA。以2.5μg的該mRNA為模板，用cDNA合成試劑盒(ストラタジ一ン公司生產)合成cDNA。此時，反轉錄所用的引物採用序列表的序列號1中所示的鹼基序列的5』生物素標記引物。
用苯酚·氯仿處理上述所得的cDNA，用Cellulose CL4B(Amersham·Pharmacia公司生產)凝膠過濾精製後、乙醇沉澱。沉澱後回收的cDNA溶於200μl的DphII緩衝液(New England Biolabs公司生產)中，用限制酶DpnII(New England Biolabs公司生產)消化，用鏈黴抗生物素蛋白磁珠(タイナ一ル公司生產)由消化物回收cDNA的3』端部分後，加入20μl的10×NEB#2緩衝液(New EnglandBiolabs公司生產)，使總體積調至200μl，用限制酶BsmBI(NewEngland Biolabs)進行消化。反應液用苯酚·氯仿處理和乙醇沉澱後，將沉澱溶於10.5μl的無菌水中，作為3』端的cDNA溶液用於以下的實驗中。
(2)3』端cDNA和帶有抗標記物的微珠的雜交來源於由實施例3-(1)合成的(A)和(B)的3』端cDNA溶液1μl分別插入200ng文獻1所述的標記載體pLCV2中，製備成6個14萬-18萬個克隆的質粒庫。每份100μl的反應液分別使用100pmol的序列表的序列號2中所述的鹼基序列的5』生物素標記引物、和序列表的序列號3中所述的鹼基序列的5』FAM標記引物，每份反應液以125ng上述各質粒庫的質粒為模板進行PCR反應，每個質粒庫進行48份PCR反應，PCR反應按以下條件進行。
94℃-保持3分鐘94℃-30秒、67℃-3分鐘為1個循環，共8個循環94℃-30秒、64℃-3分鐘為1個循環，共22個循環67℃-保持3分鐘反應結束後，分別將每個庫的PCR反應液收集為1份，用苯酚·氯仿處理和乙醇沉澱後，所得的沉澱溶於1200μl無菌水中。溶解的沉澱中加入180μl 10×NEB#4緩衝液(New England Biolabs公司生產)，將總量調至1800μl，然後用限制酶PacI(New England Biolabs公司生產)進行消化。從反應液中除去吸附在超交聯SA樹脂(ウルトラリンクSAレジン，ピアス公司制)上的級分，所得的cDNA溶液用苯酚·氯仿處理和乙醇沉澱後，沉澱溶於1200μl無菌水中，在此溶解的沉澱中加入180μl 10×NEB#2緩衝液(New England Biolabs公司生產)，使總量調整至1800μl(用T4DNA聚合酶(寶酒造公司生產)處理，此時另加入作為底物的dGTP，使標記部分單鏈化。
將帶有單鏈標記的cDNA的各個庫按每個庫用300μg與文獻1所述的14400萬個帶抗標記物的微珠混合，在400μl的雜交緩衝液(10mM磷酸緩衝液(pH7.2)、0.5MNaCl、0.01％Tween20、1.2％硫酸葡聚糖)中，72℃下振蕩3天進行雜交。通過離心分離收集微珠懸浮於500μl的10mMTris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl2、50mMNaCl、1mM二硫蘇糖醇、0.01％Tween20中，64～70℃下振蕩洗滌30分鐘。收集反覆洗滌數次後的6個庫的cDNA微珠，用MoFloサイトメ-タ-(サイトメ-シヨン公司生產)測定微珠的FAM的螢光強度(激發波長488nm、檢測波長530nm)、從螢光強度大的微珠中選出1％的微珠。通過以上的操作得到的約600萬個經雜交與cDNA結合的微珠。
(3)DNA微珠懸浮液的製備將實施例3-(2)所得的、通過雜交與cDNA結合的微珠約200萬個，懸浮於100μl的10mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl2、50mM NaCl、1.4mM二硫蘇糖醇、0.01％Tween 20、各0.1mM的dATP、dGTP、dTTP、5-甲基dCTP、1mMATP中，加入20U的T4DNA聚合酶和400U的T4DNA連接酶、12℃下反應2小時，用鏈黴蛋白酶處理停止反應，通過離心分離收集反應液中的微珠，懸浮於100μl的DpnII緩衝液(NewEngland Biolabs公司生產)中，用DpnII(New England Biolabs公司生產)消化。通過離心分離收集微珠，懸浮於100μl的10mMTris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、0.033mM dGTP、7.5mM二硫蘇糖醇、0.01％Tween20中，加入10U的DNA聚合酶I大片段(寶酒造公司生產)，25℃下反應15分鐘。通過離心分離收集微珠，懸浮於100μl的連接緩衝液(寶酒造公司生產)中之後，加入0.1nmol預先用序列表的序列號4、序列號5中所示的鹼基序列的DNA經退火製成的接頭，用T4DNA連接酶(寶酒造公司生產)進行連接反應。離心收集微珠、懸浮於脫微珠溶液(150mM NaOH、0.01％Tween20)中，室溫下反應10分鐘。反應液離心分離除去上清後，用10mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、0.01％Tween20洗淨、懸浮於1ml的10mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、0.01％Tween20中，得到來源於樣品1和樣品2的DNA微珠懸浮液。
(4)探針的製備將1μl實施例3-(1)製備的(A)和(B)來源的3』端cDNA分別插入200ng文獻1所述的探針載體pLCV中，製備含有800萬-1000萬個克隆的質粒。在每10μg該質粒中加入通用緩衝液H(寶酒造公司生產)20μl，將總量調至200μl後，用限制酶Sau3A I(寶酒造公司生產)消化。以1.2μg(A)來源的經Sau3AI消化過的質粒1.2μg為模板，用2nmol序列表的序列號6所示的鹼基序列的5′FAM標記引物、或用2.4μg(B)來源的經Sau3AI消化過的質粒2.4μg為模板，用4nmol序列表的序列號7中所示的鹼基序列的5』Cy5標記引物，分別進行線性PCR。線性PCR按以下條件進行。
95℃-保持5分鐘95℃-30秒、64℃-30秒、72℃-30秒為一個循環，共25個循環。
72℃-保持10分鐘用キアクイツクPCR純化試劑盒(キアゲン公司生產)由每種線性PCR後的反應液精製擴增的DNA、用乙醇沉澱後，溶於21μl無菌水中，得到來源於樣品1的FAM螢光標記探針和來源於樣品2的CY5螢光標記探針。
(5)和DNA微珠的雜交將實施例3-(3)製備的來源於樣品1的DNA微珠和來源於樣品2的DNA微珠各約36萬個混合，在該微珠中加入(4)製備的來源於樣品1的FAM螢光標記探針和來源於樣品2的Cy5螢光標記探針各5μg，在50μg的緩衝液(4×SSC、25％甲醯胺、0.1％SDS)中，65℃下振蕩雜交過夜。離心分離收集微珠、用1×SSC，0.1％SDS在65℃下洗滌30分鐘，用0.1SSC，0.1％SDS在65℃下洗滌30分鐘，離心分離收集DNA微珠，並將其懸浮於10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、0.01％Tween20中，即得到雜交過的DNA微珠。
(6)分類將實施例3-(5)所得的雜交過的DNA微珠，提供給用MoFloサイトメ-タ-(サイトメ-シヨン公司生產)進行分類之用。對於DNA微珠，測定其FAM的螢光強度(激發波長488mm、檢測波長530mm)和Cy5的螢光強度(激發波長647nm、檢測波長670nm)，分選出了3692個(微珠懸浮液A)FAM的螢光強的DNA微珠、3349個(微珠懸浮液B)Cy5的螢光強度強的DNA微珠。
(7)PCR以及DNA鹼基的確定以實施例3-(6)中選出的微珠懸浮液A和B為模板，用序列表的序列號8和序列號9分別所示的鹼基序列為引物，進行PCR。每100μl反應液中，加入200個微珠模板和40pmol引物，微珠懸浮液A、B各自分別進行5份反應。PCR按以下條件進行。
95℃-保持5分鐘95℃-30秒、64℃-30秒、72℃-30秒為1個循環，共25個循環72℃-保持10分鐘將懸浮液A、B的PCR反應液各自合併為1份，每種取1μl與克隆載體pT7Blue(ノバジエン公司制)混合，進行連接、克隆。由微珠懸浮液A來源的960個克隆和微珠懸浮液B來源的960個克隆共1920個克隆提取質粒，分析插入的DNA片段的鹼基序列。從所得的鹼基序列中，選擇滿足以下所示條件之一的序列。
條件1插入序列的長度為40個鹼基以上的序列。
條件2插入序列的長度為30個鹼基以上的序列，40個鹼基以下、無polyA序列的序列。
多個質粒出現同一序列時，任意選擇1個質粒，得到740個用於DNA點陣的模板質粒。
實施例4用DNA點陣的表達分析(1)DNA點陣的製作以實施例3中所得的740個克隆的質粒為模板，用含有序列表的序列號10和11中所述的序列的一對引物進行PCR反應。隨後，將該擴增反應產物用乙醇溶液精製後按0.3μg/μl的濃度溶於1×溶液T(SolutionT，寶酒造社制)中，將此溶液作為製作點陣的溶液。用Affymetrix 417點陣儀(Affymetrix公司生產)，將此溶液點在氨基化的載玻片MAS塗層載玻片(松浪硝子公司生產)上。點過樣後的載玻片在37℃、溼度90％下保持1小時後，用能量為60mJ/cm2的UV進行交聯。再用0.2％SDS洗滌1次，然後用蒸餾水洗滌2次後，在由2.75g琥珀酸酐和162.5ml的N-甲基-2-吡咯烷酮、15ml的1M硼酸緩衝液(pH8.0)配成的封閉溶液中浸20分鐘，封閉游離的氨基。隨後，用蒸餾水洗2次後，在沸水中熱變性2分鐘、用冰冷的100％乙醇迅速冷卻、然後在1,000rpm左右下低速離心分離、使載玻片乾燥，用於以下的實驗中。
(2)細胞的製備將HL-60細胞(ATCC CCL-240)懸浮於含有10％牛胎兒血清(JRHバイオサイエンシズ公司生產)、1.3％二甲亞碸的RPMI1640培養基(バイオウイタカ一公司生產，12-702F)中，在5％碳酸氣存在下，37℃下培養1周，分化誘導成嗜中性細胞。離心分離回收所得的細胞，按106個細胞/ml的濃度懸浮於含有10％牛胎兒血清的RPMI1640培養基中，並在每個10cm的培養皿中加入10ml。設定各培養皿中添加100μl的4mM DGE水溶液，4小時後回收RNA的組、添加10μl的100μg/ml的佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA，ギブコ公司生產，13139-019)的二甲基亞碸溶液，4小時後回收RNA的組、添加100μl的4mMDGE水溶液，培養6小時後再加入10μl的100μg/ml TPA二甲亞碸溶液，4小時後回收RNA的組。另外，設定作為陰性對照，添加100μl的水，4小時後回收RNA的組。
(3)檢測用的標記cDNA的製備和雜交實施例4-(2)中製備的HL-60細胞，用Trizol Reagent(GIBCOBRL公司生產)和Oligotex-dT30Super(寶酒造公司生產)，按照各自的試劑盒的方法說明製備PolyA(+)RNA。然後用RNA FluorescenceLabeling Core Kit(M-MLV Version)(寶酒造公司生產)。按照試劑盒的方法說明，以1.0μg的每種PolyA(+)RNA為模板，按表8所示的樣品RNA的組合，製備以Cy3和Cy5標記的cDNA、並混合。
表8

接著，按照IntelliGene(寶酒造公司制)的操作說明書，使實施例4-(1)中製備的DNA微點陣和上述的Cy3標記的cDNA和Cy5標記的cDNA的混合物(4種)進行雜交，並進行洗淨、乾燥的操作。然後用Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix公司生產)得到Cy3(激發波長532nm，檢測波長570nm)和Cy5(激發波長635nm，檢測波長660nm)的螢光圖像。其後，用圖像定量分析軟體ImaGene4.1(Biodiscovery公司生產)定量算出各點的點領域的信號強度平均值和點的周邊領域(以下稱為背景領域)的信號強度的平均值和標準偏差。
(4)各克隆的分組由表達比率通過統計分析對各克隆進行分組，必須刪除可靠性低的數據和未表現出有意義變化的克隆的數據。因此，按照以下的次序對提供分組的克隆進行交叉。亦即，由實施例4-(3)中所得的背景領域的信號強度平均值和標準偏差，按照以下的公式求出信號強度的閾值。
信號強度的閾值＝背景領域的信號強度平均值+2×(背景領域的信號強度的標準偏差)根據各點領域的信號強度的平均值是否比上述的閾值大，判斷該點信號在各系統中的有意義性。然後，將全部4個樣品Cy3和Cy5兩系統中無有效信號的點的克隆除外。再算出Cy5的信號強度對Cy3信號強度的比率(以下稱為表達比率)，對全部樣品中該比率大於1/2而且小於2的克隆，作為未表現出變化的克隆在以後的分析中除去。以上交叉的結果，從740個克隆中選出227個克隆。
然後，對於上述選出的227個克隆，通過TPA和DGE的處理，其表達發生變化的克隆，亦即樣品3或4的表達比率值為0.55以下或1.8以上的克隆，根據DGE處理的變化的關係，可以分為以下4個組。
A-3群經TPA處理表達增加，再經DGE處理，其表達降低的克隆。
B-3群經TPA處理表達增加，再經DGE處理，其表達增加的克隆。
C-3群經TPA處理表達降低，再經DGE處理，其表達降低的克隆。
D-3群經TPA處理表達降低，再經DGE處理，其表達增加的克隆。
針對這些克隆的相同性進行檢索。根據這些結果，對於分成4組的克隆，所得到的相同性的鹼基序列名及其基因庫的登記號在表9和表10中表示。另外，在表9和表10中，對於看到有相同性的克隆用其在基因庫登記的鹼基序列名表示、對於未看到有相同性的克隆其序列表的序列號表示。表9認為有同源性的鹼基序列 基因庫登記號A-3群智人信號傳導蛋白和轉錄激活物6(STAT6)基因， AF067575外顯子15至23和完全的cds基因智人cDNAPLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637AK025951B-3群智人SUI1固源mRNA，完全的cds基因 AF083441智人的推測的蛋白(HSPC014)，mRNA NM_015932C-3群智人cDNAFLJ22730倒位刺激基因，克隆HSI15793， AK026383高度類似於AF004162同型早期人類鎳特異性的誘導蛋白(Cap43)mRNA智人腺苷脫氨酶，RNA特異性(ADAR)，轉錄物變異的 NM_015841ADAR-c，mRNA智人剪接因子3b，亞基2，145kD(SF3B2)，mRNA NM_006842結合雙鏈RNA的細胞核蛋白ILF3所結合的智人的部分 AJ271747mRNA，可變轉錄物人轉移纈氨醯基-tRNA合成酶nRNA，cds的3′端 M98326序列表的序列號12中所述的鹼基序列 無表10認為有同源性的鹼基序列 基因庫登記號D-3群智人cDNAFLJ22997倒位刺激基因，克隆KAT11962， AK026650高度類似於延伸因子1-α的HSEF1AC人mRNA(克隆CEF4)智人核糖體蛋白L17(RPL17)mRNA NM_00985智人核糖體蛋白L24(RPL24)mRNA NM_00986智人染色體17，克隆hRPK318_A_15，完全序列 X75755翻譯調控的腫瘤蛋白(TCTP)的智人TPT1基因，外顯子 AJ4007171-6智人還原型輔酶Q-細胞色素C還原酶結合蛋白(UQCRB) NM_006294mRNA智人核糖體蛋白S15a(RPS15A)mRNA NM_001019智人核糖體蛋白L27(RPL27)mRNA NM_000988由這些結果推測，分別分類為A-3群、B-3群、C-3群、D-3群的克隆是表11所示的基因的部分序列。另外，表11中的基因庫登記號中，基因的全鹼基序列尚未清楚的，用表9及10所述的鹼基序列的基因庫登記號表示。表11基因名稱 基因庫登記號A-3群信號傳導蛋白和轉錄激活物6(STAT6) AF067575含智人cDNAFLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637的基因 AK025951B-3群推定的翻譯起始因子(SUI1) AF083441智人的推測的蛋白(HSPC014) NM_015932C-3群N-myc下遊調節性基因1(NDRG1)NM_006096腺苷脫氫酶，RNA特異性(ADAR)NM_015841剪接因子3b，亞基2(SF3B2) NM_006842白介素增強子結合因子3(ILF3)NM_004516纈氨醯基-tRNA合成酶2(VARS2)NM_006295含有序列表的序列號12中所述的鹼基的基因 無D-3群真核生物翻譯延伸因子1α1(EEF1A1) NM_001402核糖體蛋白L17(RPL17) NM_000985核糖體蛋白L24(RPL24) NM_000986富含精氨酸/絲氨酸的剪接因子2(SFRS2)NM_003016翻譯調控的腫瘤蛋白1(TPT1) NM_003295還原型輔酶Q-細胞色素c還原酶結合蛋白(UPCRB) NM_006294核糖體蛋白S15a(RPS15A) NM_001019核糖體蛋白L27(RPL27) NM_000988
序列表說明序列號1的序列是有關總mRNA反轉錄用引物的序列。
序列號2的序列是擴增標記載體pLCV2的一部分的PCR所用的引物序列。
序列號3的序列是擴增標記載體pLCV2的一部分的PCR所用的引物序列。
序列號4的序列是寡核苷酸接頭的序列。
序列號5的序列是寡核苷酸接頭的序列。
序列號6的序列是擴增探針載體pLCV的一部分的線性PCR所用的引物序列。
序列號7的序列是擴增探針載體pLCV的一部分的線性PCR所用的引物序列。
序列號8的序列是有關DNA微珠上的cDNA的PCR所用的引物序列。
序列號9的序列是有關DNA微珠上的cDNA的PCR所用的引物序列。
序列號10的序列是擴增pT7Blue載體的一部分的PCR所用的引物序列。
序列號11的序列是擴增pT7Blue載體的一部分的PCR所用的引物序列。
工業上應用的可能性本發明提供篩選具有與DGE同樣的基因表達調控活性的生理活性物質、或生理活性物質的候補物質的方法、對維持生物體的恆常性有效的，例如緩和或預防應激為目的的基因調控劑、以及基因調控的方法。根據本發明，例如，對於DGE的各種生理活性的表達起有效作用的疾病或症狀來說，可以期望有治療或預防效果。
序列表110寶生物工程株式會社120生理活性物質的篩選方法13001-065-PCT150JP 2000-3036441512000-10-03150JP 2001-2833931512001-09-1816012210121143212DNA213人工合成序列220223用於總mRNA反轉錄的引物4001gacatgctgc attgagacga ttctttttt tttttttttt ttv 43210221125212DNA213人工合成序列220223擴增標記載體pLCV2的一部分所用的PCR引物4002cgccagggtt ttcccagtca cgacg25210321124212DNA213人工合成序列220223擴增標記載體pLCV2的一部分所用的PCR引物4003gcttccggct cgtatgttgt gtgg 24210421114212DNA213人工合成序列220223設計的寡核苷酸接頭組成4004gactggcagc tcgt14210521117212DNA213人工合成序列220223設計的寡核苷酸接頭組成4005atcacgagct gccagtc 17210621118212DNA213人工合成序列220223擴增探針載體pLCV的一部分所用的線性PCR引物4006tgtaaaacga cggccagt18210721118212DNA213人工合成序列220223擴增探針載體pLCV的一部分所用的線性PCR引物4007tgtaaaacga cggccagt18210821119212DNA213人工合成序列220223用於插入DNA微珠的cDNA的PCR引物4008gcccgcattg agacgattc 19210921118212DNA213人工合成序列220223用於插入DNA微珠的cDNA的PCR引物4009gattggcagc tcgtgatc182101021120212DNA213人工合成序列220223擴增pT7Blue載體的一部分所用的PCR引物40010agggttttcc cagtcacgac 202101121120212DNA213人工合成序列220223擴增pT7Blue載體的一部分所用的PCR引物40011atgcttccgg ctcgtatgtt 202101221173212DNA213同型早期人類40012tttttttttt ttttgtcatg ttggagttat gaggggaatg gggagttgtt tgtttccatt 60tgtaaactcg atc 7權利要求
1.一種生理活性物質的篩選方法，其特徵在於該方法包含下述步驟(1)將①被檢物質、及②下述(i)中所述的化合物和/或下述(ii)中所述的化合物分別對生物體施加負荷的步驟(i)選自下述以式(I)表示的化合物、它的衍生物及它們的鹽中的至少1種化合物、 (式中，X及Y是H或CH2OH，但是，X為CH2OH時，Y為H，X為H時，Y為CH2OH)(ii)選自以下式(II)表示的3，6-脫水半乳糖、它的醛體、它的水合物，以及它們的2-O-甲基化物及2-O-硫酸化物中的至少1種化合物、和/或選自在還原末端有該化合物的可溶性糖化合物的至少1種化合物， (2)測定(1)的生物體中的基因表達量，比較負荷為①時和負荷為②時的該值的步驟，以及(3)選擇被檢物質的步驟，該被檢物質至少使1種基因表示出與負荷為②時實質上相同的表達量的變化。
2.一種生理活性物質的篩選方法，其特徵在於該方法包含下述步驟(1)將被檢物質對生物體施加負荷的步驟，(2)測定(1)的生物體中基因的表達量和不施加該負荷時該生物體中基因的表達量，比較兩者的值的步驟，以及(3)選擇被檢物質的步驟，該被檢物質使選自以下所示的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自以下所示的B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加A群骨形態發生蛋白-6[BMP-6(基因庫登記號NM_001718)]基因、趨化因子受體-1[CCR-1(基因庫登記號NM_001295)]基因、肝細胞增殖因子[HGF(基因登記號X16323)]基因、細胞間粘附分子-1[ICAM-1(基因庫登記號NM_000201)]基因、白介素-1β[IL-1β(基因庫登記號X02532)]基因、白介素-16[IL-16(基因庫登記號M90391)]基因、白血病抑制因子[LIF(基因庫登記號NM_002309)]基因、骨橋蛋白[osteopontin(基因庫登記號NM_000582)]基因、腫瘤壞死因子-α[TNF-α(基因庫登記號X02910)]基因、神經纖維網-1[Neuropilin-1(基因庫登記號NM_003873)]基因、信號傳導物和轉錄激活物6[STAT6(基因庫登記號AF067575)]基因、以及含有智人(Homo Sapiens)cDNAFLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637(基因庫登記號AK025951)的基因B群血紅素加氧酶[HO-1(基因庫登記號NM_002133)]基因、硫氧還蛋白還原酶-1(基因庫登記號AF106697)基因、推定的翻譯起始因子[SUI1(基因庫登記號AF083441)]基因、以及智人的推測的蛋白[HSPCO14(基因庫登記號NM_015932)]基因、C群N-myc下遊調節性基因1[NDRG1(基因庫登記號NM_006096)]基因、腺苷脫氨酶、RNA特異性[ADAR(基因庫登記號NM_015841)]基因、剪接因子3b、亞基2[SF3B2(基因庫登記號NM_006842)]基因、白介素增強子結合因子3[ILF3(基因庫登記號NM_004516)]基因、纈氨醯基-tRN合成酶2[VARS2(基因庫登記號NM_006295)]基因、以及含有序列表的序列號12中所述的鹼其序列的基因、D群真核生物翻譯延伸因子1α1[EEF1A1(基因庫登記號NM_001402)]基因、核糖體蛋白L17[RPL17(基因庫登記號NM_000985)]基因、核糖體蛋白L24[RPL24(基因庫登記號NM_000986)]基因、富含精氨酸/絲氨酸的剪接因子2[SFRS2(基因庫登記號NM_003016)]基因、翻譯調控的腫瘤蛋白1[TPT1(基因庫登記號NM_003295)]基因、還原型輔酶Q-細胞色素C還原酶結合蛋白[UQCRB(基因庫登記號NM_006294)]基因、核糖體蛋白S15a[RPS15A(基因庫登記號NM_001019)]、以及核糖體蛋白L27[RPL27(基因庫登記號NM_000988)]基因、E群白介素-2受體α[IL2RA(基因庫登記號X01057)]基因、白介素-6[IL6(基因庫登記號X04430)]基因、CD166(基因庫登記號Y10183)基因、幹擾素調節因子-1[IRF1(基因庫登記號X14454)]基因、白介素-15受體α[IL15RA(基因庫登記號U31628)]基因、細胞核因子Kappa-bp105亞基[NFKB1(基因庫登記號M58603)]基因、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1[CASP1(基因庫登記號M87507)]基因、白介素-1β[IL1B(基因庫登記號M15330)]基因、腫瘤壞死因子-α[TNF-α(基因庫登記號X02910)]基因、Grol癌基因[GR01(基因庫登記號X54489)]基因、白介素-1α[IL1A(基因庫登記號M28983)]基因、抑制素βA[1NHBA(基因庫登記號J03634)]基因、白介素-7受體[IL7R(基因庫登記號M29696)]基因、前B細胞集落增強因子[PBEF(基因庫登記號U02020)]基因、肝和激活作用調節性趨化因子[LARC(基因庫登記號U64197)]基因、以及白介素-8[IL8(基因庫登記號M26383)]基因、F群集落刺激因子-1受體[CSF1R(基因庫登記號X03663)]基因、趨化因子(C-X-C基元)受體-4[CXCR4(基因庫登記號AF147204)]基因、以及エンドグリン[ENG(基因庫登記號NM_000118)]基因、G群血紅素加氧酶-1[HMOX1(基因庫登記號Z82244)]基因。
3.一種生理活性物質的篩選方法，其特徵在於該方法包含以下步驟(1)分別將應激負荷施加於生物體，以及將被檢物質和應激負荷施加於生物體的步驟，(2)分別測定(1)的生物體以及未施加任何負荷的生物體的基因表達量的步驟，以及(3)比較由(2)所得的(1)的生物體和正常生物體的基因表達量，選擇被檢物質的步驟，該被檢物質表現出選自下述(a)～(g)所述的至少一種基因表達模式(a)權利要求2中記載的選自上述A群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時減少，(b)權利要求2中記載的選自上述B群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時進一步增加，(c)權利要求2中記載的選自上述C群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體減少、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時進一步減少，(d)權利要求2中記載的選自上述D群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體減少、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時增加，(e)權利要求2中記載的選自上述E群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，比正常生物體增加、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時減少，(f)權利要求2中記載的選自上述F群的至少1種基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，與正常生物體相同、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時減少，(g)權利要求2中記載的G群的基因的表達量，在對生物體施加應激負荷時，與正常生物體相同、在對生物體施加被檢物質和應激負荷時增加。
4.權利要求3所述的生理活性物質的篩選方法，其中的應激是用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯處理，基因的表達模式選自(a)～(d)所述的表達模式。
5.權利要求3所述的生理活性物質的篩選方法，其中的應激是用脂多糖處理，基因的表達模式選自(e)～(g)所述的表達模式。
6.權利要求1～5中任何1項所述的生理活性物質的篩選方法，其中的生物體是生物個體或培養細胞。
7.權利要求1～6中任何1項所述的生理活質的篩選方法，其中基因的表達量根據該基因轉錄的mRNA量來測定。
8.權利要求7所述的生理活性物質的篩選方法，其中的基因表達量通過使用DNA點陣的雜交法來測定。
9.權利要求8所述的生理活性物質的篩選方法中所使用的DNA點陣，其特徵在於選自權利要求2所述的A～G群的基因中的至少2個基因或其片段在載體上的預先規定的位置上固定化。
10.一種基因調控劑，其特徵在於該調控劑含有可使選自權利要求2中所述的A群、C群、E群及F群中的至少1個基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加的化合物。
11.一種基因調控劑，其特徵在於該調控劑含有在受到應激負荷的生物體中，可使選自權利要求2所述的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使選自B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加的化合物。
12.一種基因調控劑，其特徵在於該調控劑含有在受到應激負荷的生物體中，可使因應激而增加表達量的選自權利要求2中所述的A群及E群中的至少1種基因的表達量減少的化合物。
13.一種基因調控劑，其特徵在於該調控劑含有在受到應激負荷的生物體中，可使因應激而增加表達量的選自權利要求2所述的B群及G群中的至少1種基因的表達量增加的化合物。
14.一種基因調控劑，其特徵在於該調控劑含有在受到應激負荷的生物體中，可使因應激而表達量減少的選自權利要求2所述的C群及F群中的至少1種基因的表達量減少的化合物。
15.一種基因調控劑，其特徵在於該調控劑含有在受到應激負荷的生物體中，可使因應激而表達量減少的選自權利要求2所述的D群中的至少1種基因的表達量增加的化合物。
16.權利要求10～15中任何一項所述的基因調控劑，其中的化合物是由權利要求1～8中任何一項所述的篩選方法所得的物質。
17.權利要求10～16中任何一項所述的基因調控劑，其中該基因調控劑是以緩和或預防應激為其使用目的。
18.一種基因調控的方法，其特徵在於，通過選自權利要求1中所述的(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物以及與這些化合物至少對1種基因具有實質上相同的基因調控活性的化合物的至少1種化合物、或含有該化合物的組合物施予生物體，可使選自權利要求2所述的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加。
19.一種基因調控的方法，其特徵在於，通過選自權利要求1中所述的(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物以及與這些化合物至少對1種基因具有實質上相同的基因調控活性的化合物的至少1種化合物、或含有該化合物的組合物施予受應激負荷的生物體，可使選自權利要求2所述的A群、C群、E群及F群中的至少1種基因的表達量減少，和/或使B群、D群及G群中的至少1種基因的表達量增加。
20.權利要求18或19所述的基因的調控方法，其中權利要求1中所述的(i)所述的化合物或(ii)所述的化合物和至少對1種基因具有實質上相同的調控活性的化合物是由權利要求1～8中任何一項所述的篩選方法所得的物質。
21.權利要求1～8中任何一項所述的篩選方法所得的物質。
22.權利21所述的物質，其中該物質是來源於植物的物質、來源於擔子菌的物質或它們的衍生物。
23.權利要求21或22所述的物質，其中該物質是多糖類，它的分解物或它們的衍生物。
全文摘要
本發明提供與具有各種生理活性的DGE有同樣的基因調控活性的生理活性物質、或生理活性物質的候補物質的篩選方法，對維持生物體的恆常性有效的，例如，以緩和或預防應激為目的的基因調控劑、以及基因的調控方法。
文檔編號G01N33/50GK1478149SQ01819944
公開日2004年2月25日 申請日期2001年10月3日 優先權日2000年10月3日
發明者榎龍嗣, 山下周作, 六嶋正知, 峰野純一, 佐川裕章, 加藤鬱之進, 一, 之進, 作, 知, 章, 龍嗣 申請人:寶生物工程株式會社