用於crm197及其衍生物的生產的人工基因的細菌表達的製作方法

2023-05-08 00:47:16 1

專利名稱：用於crm197及其衍生物的生產的人工基因的細菌表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及藉助於人工基因序列生產目的藥物蛋白的領域，所述序列被插入表達載體，相應蛋白在轉化了所述表達載體的微生物中的過量表達，和用於分離所表達的蛋白的方法；具體地，涉及編碼完整CRM197及其衍生物的人工基因的構建，涉及CRM197及其衍生物在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達，和涉及用於蛋白CRM197的分離和純化的方法。
背景技術：
蛋白CRM197 (交叉反應物質197，58kDa)是白喉毒素(DTx)的變體，以減少其毒性的單突變(即，核苷酸變化在位置52產生甘氨酸-穀氨酸取代)為特徵(Uchida T.等人， 1973 ；Giannini G.等人，1984)。然而蛋白CRM197維持了與白喉毒素相同的炎性和免疫刺激特性並且廣泛用於針對百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、B型肝炎病毒和B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type B)的偶聯疫苗的製備(W0 93/24148 和 WO 97/00697、 WO 02/055105)。像野生型白喉毒素一樣，CRM197包括兩個結構域，A和B，通過二硫鍵結合在一起。A結構域(21kDa)為催化結構域，而B結構域(37kDa)包括一個用於結合細胞受體的亞結構域和另一個用於易位的亞結構域(Gill D.M.等人，1971 ；Uchida Τ.等人，1973)。 和DTx —樣，蛋白CRM197能夠結合(藉助B結構域)細胞受體HB-EGF(肝素結合性表皮生長因子)，使得其能夠通過內吞易位到細胞內。暴露於內體中的低PH引發對於B結構域插入膜和隨後A結構域易位到胞質必不可少的構象變化(Papini Ε.等人，1993 ;CabiauX V.等人，1997)。易位的必要條件是由蛋白酶導致的兩個結構域A和B之間的肽鍵的斷裂。結合二硫鍵的還原，這種消化釋放了 A結構域，使其活化，而作為一個單獨的多肽被合成的完整蛋白是失活的(Gill D.M.等人，1971)。白喉毒素的A結構域具有ADP-核糖基化活性並且催化ADP-核糖基團從NAD到參與蛋白質合成的延長因子2 (EF-2)的轉移。所形成的複合物是無活性的且因此引發真核蛋白質合成的中斷(Honjio T.等人，1971)。該蛋白的細胞毒性效應還歸因於A結構域的另一活性，其能夠非特異地降解DNA(Giarmini G.等人，1984)。這種核酸內切酶活性依賴於二價陽離子並且也被保留在CRM197中(Bruce C.等人，1990 ;Lee J. W.等人，2005)。CRM197和其他無毒性變體一直使用感染了基因組含有突變形式的編碼白喉毒素 (DTx)的tox基因的特殊β噬菌體的白喉棒狀桿菌的溶源性培養物生產。這種白喉毒素和其他變體在特定的生長條件下被分泌到培養基中，然後通過過濾或者沉澱回收，並且隨後使用層析方法純化(CoxJ.，1975)。然而，起初用於DTx及其衍生物(CRM)的生產的方法不能保證高的產率，因此從棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的單溶源性菌株產生CRM197對於其在疫苗中用作偶聯物不是經濟上有優勢的。為把CRM197的生產增加到工業規模，隨後分離到雙溶源性和三溶源性突變體，其包括整合到染色體內的兩個或三個tox基因(Rappuoli R.等人，1983 ；RappuoIiR.，1983)。1990 年，Rappuoli 描述了一種用於生產衍生自 DTx 的蛋白的方法，其使用了染色體上整合有兩個拷貝的tox突變基因的棒狀桿菌屬的菌株。還建立了生長條件(培養基、鐵離子濃度、生長溫度、氧百分率等)以增加產率(美國專利 4925792,1990)。在整個對數生長期，直到穩定期開始，CRM197積聚於培養基中，發酵開始大約20小時後達到峰值。然而，隨後出現產率大幅下降的明顯跡象，可能歸因於蛋白酶解 (美國專利 4925792,1990)。值得注意的是為增加表達效率的雙溶源性和三溶源性菌株的構建是一個需要費力篩選階段的長期過程。獲得高水平的CRM197的替代方式使用一種特殊的質粒PPX3511， 其通過將編碼CRM197的噬菌體基因與質粒pNG-22融合獲得(美國專利5614382，1995)。這使得增加基因拷貝數(達每個細胞5-10個)成為可能而不需要篩選多溶源性的細菌菌株。 再有，就被噬菌體β 197t『感染的棒狀桿菌菌株來講，CRM197表達在含有低鐵含量的特殊培養基中。儘管遺傳操作細菌菌株所需的時間量減少了，CRM197蛋白的產量與使用雙溶源性基因相比並沒有明顯增加。生產DTx或各種其他CRM的發酵方法，最近被描述在若干專利中，都包括了白喉棒狀桿菌培養物的使用。一般來講，生長發生在控制溫度、攪拌和通氣的條件下，且毒素和/或其衍生物的最大產生發生於培養20小時後(Dehottay P. M. H.等人，美國 2008/019；3475 ；Wolfe H.等人，美國 2008/0153750)。另一方面，關於使用細菌宿主代替棒狀桿菌的研究是有限的。已在大腸桿菌中進行了關於A結構域和B結構域的表達測試，和關於某些DTx的中間形式(A結構域與B結構域的部分一起)的測試。所做的這些研究通常被用來詳細測定結構域A和B (及其部分)在毒性、與受體的結合、蛋白摺疊和穩定性方面的作用(Bishai WR等人，1987a ;Bishai WR等人，1987b)。這些片段，其中有些以融合蛋白產生，已通過使用不同的啟動子和不同的表達條件表達在大腸桿菌中以評價它們的溶解性和最終產率(其在0. 4-10mg/L之間變化，相當於約7%的總蛋白)。平行地，克隆了 1875bp的片段，包括原始的tox啟動子、信號序列和編碼CRM的完整基因。作為蛋白質免疫印跡實驗的對照，在周質水平表達時該克隆表現為比多個片段更加穩定，而在高溫下表達於胞質中時該蛋白的溶解性急劇下降(BishaiWR等人，1987b)。儘管使用天然的tox啟動子表達整個A結構域是可能的(Leong D.等人，1983)， 已證明在大腸桿菌中單獨表達B結構域是更加複雜的因為該結構域極不穩定且僅在與標籤融合時才表達(Spilsberg B.等人，2005)。明顯地，毒素及其衍生物的異源生產受到與最佳蛋白構象的採用、潛在的降解和低最終產率相關的很多問題的限制。避免對於理想蛋白構象至關重要的兩個分子內二硫鍵的形成的一種策略包括構建多個修飾的肽衍生物，且尤其是肽DTa(由CRM197序列的前 185個胺基酸組成)、肽DTb (255個胺基酸，缺失了與細胞受體結合的結構域和N端8個胺基酸)，和由前兩個肽融合獲得的肽DTaDTM440個胺基酸)。這些片段以白喉棒狀桿菌基因組作為模板通過PCR合成，並且隨後通過採用色氨酸誘導系統表達在大腸桿菌中(Corvaia N.等人，FR 2827606A1 2003)。最近對CRM197的興趣不斷增加由於與其能和可溶形式的HB-EGF結合有關的潛在的抗腫瘤作用(Mekada等人，美國2006/0270600A1)。這種抗腫瘤功能不僅可歸因於 CRM197，還可歸因於DT毒素的其他無毒性衍生物(例如，雙突變體DT52E148K、或融合蛋白 GST-DT)。這些突變體已通過PCR構建，起始於編碼CRM197的基因。然而，在所述研究中通過使用白喉棒狀桿菌的培養物，在35°C生長16-17小時生產完整的CRM197。CRM197從上清液中被純化通過用硫酸銨最初沉澱，隨後三次連續的離子交換和疏水層析步驟(Mekada 等人，美國 2006/0270600A1)。因此，在文獻中沒有描述完整白喉毒素或CRM197在大腸桿菌中的表達的可以利用的研究。因此明顯需要解決一種在短時間內具有成本效益的產率的生產CRM197(及其衍生物)的替代方法和，優選地，藉助於使用替代性的細菌宿主代替棒狀桿菌。定義和縮寫CRM197 交叉反應物質DTx:白喉毒素DTA:白喉毒素A結構域DTB:白喉毒素B結構域EF-2:延長因子-2SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳IPTG 異丙基- β -D-硫代半乳糖苷發明_既述本發明藉助於特異地用於在大腸桿菌中過表達蛋白CRM197的人工多核苷酸序列(SEQ ID N0 1)解決了上述問題。該基因可與標籤序列相連並且因此使得融合蛋白 CRM197-標籤能夠在大腸桿菌中表達。本發明還涉及包含序列SEQ ID N0 1的質粒和由上述質粒的引入而遺傳修飾的大腸桿菌菌株。一方面，本發明涉及由上述提及的遺傳修飾的大腸桿菌生產的重組融合蛋白CRM197-標籤。本發明還涉及藉助於在上面闡釋的遺傳修飾的大腸桿菌中表達的具有N端標籤的重組蛋白CRM197(結構域A和B)的生產，和其隨後的純化的方法。該方法還包括去除標籤以獲得天然形式的蛋白CRM197。該發明提供了生產蛋白CRM197和相似蛋白的一種新方法，作為使用微生物白喉棒狀桿菌的替代方法。根據本發明所描述的方案，目標蛋白能夠被大量獲得以用於藥物-治療領域的基礎研究和應用。本發明提供了下列優點i)它使用了微生物大腸桿菌， 其被廣泛用於工業和藥物應用中的異源蛋白的表達；ii)大腸桿菌的遺傳學已被知悉數年且很多可選擇系統(載體和菌株)可用於其表達；iii)它是一種非致病性微生物；iv)大腸桿菌的使用使得能夠縮短生產時間因為其以高生物量產量快速生長。附圖簡要說明

圖1表示電泳(SDS-PAGE 10 從中可以看到對應於從不同大腸桿菌，即 BL21AI (泳道1、2、3、4)和BL21(DE3)(泳道5、6、7、8)的細菌培養物的總蛋白提取物中獲得的具有SEQ ID N0 6的蛋白(CRM197-標籤，61kDa)的條帶。培養物被置於不同的誘導時間(1小時、3小時和過夜)。泳道M 標準分子量參照物；泳道1和5 未誘導的樣品；泳道 2和6 誘導1小時的樣品；泳道3和7 誘導3小時的樣品；泳道4和8 誘導過夜的樣品。圖2表明對從不溶性部分得到的蛋白CRM197-標籤所做的溶解測試。所有的測試都使用含有6-7M尿素的溶液來進行。泳道1和2 從未誘導的(1)和誘導的( 培養物獲得的可溶部分；泳道3 標準分子量參照物；泳道4 :20°C的溶解溶液和吐溫20 ；泳道5 :20°C的溶解溶液和TritonX-IOO ；泳道6 :20°C的溶解溶液和還原劑(β _巰基乙醇20mM)；泳道7 :20°C的溶解溶液和SDS ；泳道8 :30°C的溶解溶液和Triton X-100 ； 泳道9 :30°C的溶解溶液和還原劑。圖3表示在親和層析後獲得的一些部分的電泳。泳道1 過柱前的用6-7M尿素溶解的樣品；泳道2 柱中未結合的流通液；泳道3和4 用梯度咪唑洗脫的初始部分；泳道 5-10 對應於洗脫峰的中心區域的部分。圖4表示10%的SDS-PAGE凝膠其中純化步驟是可見的。泳道M 標準分子量參照物；泳道1 可溶部分；泳道2 用尿素溶解的總提取物；泳道3 親和層析後的樣品；泳道 4 凝膠過濾層析後的樣品。圖5表示CRM197樣品在用腸激酶消化前後的電泳。M 標準分子量參照物；泳道 1 未被腸激酶處理的CRM197-標籤；泳道2 在被消化20小時的CRM197-標籤。樣品在還原劑存在下被煮沸。可見條帶對應於B結構域、A結構域和A-標籤結構域(分別是a、
b、c) ο發明詳述對應於Giarmini G.等人(1984)描述的完整CRM197、不含用於運出細胞外的天然信號序列的序列，被用於獲得為在大腸桿菌中表達而藉助於Leto軟體(Entelechon GmbH Regensburg，德國)優化的多核苷酸序列SEQID N0 1。基因序列SEQ ID N。1也可以在其5』和3』端連接編碼標籤多肽的寡核苷酸序列以有利於其胞質穩定性和/或隨後使用與多種標籤肽具有高親和力的基質或樹脂的純化。 有很多已知的編碼標籤多肽的核苷酸序列。在這些標籤中，有編碼6、8、10個組氨酸(H) (組氨酸-標籤)、編碼標籤MASMTGGQQMG (T7-標籤)、編碼NDYKDDDDKC (FLAG-標籤)、編碼 WSHPQFEK (Strep-tag)、編碼 YPYDVPDYA (HAT-標籤)、編碼 KETAAAKFERQHMDS (S-標籤)、禾口編碼NEQKLISEEDLC (Myc-標籤)的核苷酸序列。基因SEQ ID N° 1也可以與其他標籤序列連接，例如那些編碼硫氧還蛋白(Trx)、 穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、纖維素結合蛋白(CBD)和幾丁質結合蛋白(CBP)的標籤序列。標籤序列能合適地連接於特定的剪切序列以被能隨後去除該標籤的合適的酶識另IJ。腸激酶、凝血酶、因子)(a或者弗林蛋白酶被優選地用於去除標籤，其最為熟知的和最為常用的剪切肽序列分別是DDDDK、LVPRGS, IE/DGR和RXXR。在一個優選的實施方案中，基因SEQ ID N° 1與編碼多組氨酸標籤的寡核苷酸連接。該組氨酸標籤序列能被添加在5』末端和3』末端。以下是組氨酸標籤肽序列的實例MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR、MGSSHHHHHHSSG、 MGSSHHHHHHSSGL、MGSGHHHHHH、MGHHHHHHHHHHSSG、MHHHHHHSSG、ALEHHHHHH、AALEHHHHHH。一個特別優選的實施方案是SEQ ID N0 2，其中84個核苷酸的序列在5』末端被添加到SEQ ID N。1序列上，編碼含有6個組氨酸的序列MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR和用於腸激酶的剪切序列DDDDK。當然，優選包含SEQ ID N0 1的序列適合具有起始和終止密碼子，和具有編碼用於克隆目的的限制性內切酶的識別位點的合適序列。包含SEQ ID N0 1的基因可以通過化學合成製備且然後被克隆到合適的表達載體中。在一個優選的實施方案中，人工序列SEQ ID N0 1和2通過組裝步驟被合成地製備，分別獲得SEQ ID N0 3和5，分別編碼具有序列SEQ ID N0 4和6的蛋白。本發明還涉及包含序列SEQ ID N° 1和優選地帶有標籤和限制性內切酶和/或蛋白酶的特異識別位點的其衍生物的表達載體(質粒)。來源於pET系列的質粒被優選地用於克隆包含SEQ ID N° 1的人工基因。優選地， 載體pET9a包含特異性用於噬菌體T7的RNA聚合酶的啟動子T7。該聚合酶非常有效(優於細菌的RNA聚合酶)和特異(不識別細菌啟動子)。除了質粒pET9a，pET系列(Novagen) 中的適合該方法的其他載體包括pET3a、pET3b、pET3c、pET5a、pET5b、pET5c、pET9b、pET9c、 pET12a、pET12b、pET12c、pET17b和通常地，具有強噬菌體T7啟動子的所有載體(例如 pRSETA、B 和 C[Invitrogen]禾口 pTYBl、pTYB2、pTYB3 禾口 pTYB4[New England Biolabs])。為了克隆目的，優選使用NdeI和BamHI作為限制性內切酶。所得的構建體能用於轉化大腸桿菌菌株。所述大腸桿菌菌株可以採用不同的誘導齊U，例如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或阿拉伯糖的替代的基因表達調控系統為特徵。就所使用的ρΕΤ-型質粒來講，其包含特異用於噬菌體Τ7的RNA聚合酶的Τ7 啟動子，那麼適合用含有SEQ ID N0 1的ρΕΤ構建體轉化的大腸桿菌菌株可以是那些能夠提供Τ7 RNA聚合酶的任何一種，但優選為Β型大腸桿菌，例如ER2566、ER2833, ER3011、ER3012、BL21ΑΙ 、BL21 (DE3)、BL21 Star (DE3)、BL21-Go 1 d (DE3)、BL21 (DE3) pLys、 C41 (DE3)、C43 (DE3)、BLR (DE3)、B834(DE3 Tuner (DE3)；或來源於 K-12 的大腸桿菌，例如 HMS174(DE3)、AD494(DE3)、Origami (DE3)、NovaBlue (DE3)、Rosetta (DE3)。優選通過電穿孔轉化細菌菌株，但其他已知的方法也是一樣適合的。在優選的實施方案中，具有SEQ ID N0 3和5的基因，分別包括序列SEQ ID N0 1 和2，被化學合成並且隨後被克隆到ρΕΤ系列的特定質粒中。所使用的克隆和表達載體是 pET9a(Novagen, Darmstadt，德國)，其特徵是具有複製起點pBR322，其確保每個細胞的大量拷貝數；維持質粒處於細菌宿主內的選擇性標誌(用於卡那黴素抗性的kan基因)；包含很多個適合克隆的限制性內切酶位點的多聚接頭區域；和調控CRM197的過表達的可誘導的特異性啟動子。NdeI和BamHI被用作將人工基因克隆到質粒內(在多聚接頭內)的限制性內切酶且使用測序以驗證其合適的方向和位置。所得到的構建體通過電穿孔轉化到多種大腸桿菌菌株中，在培養皿(包含添加卡那黴素的固體LB)上選擇轉化的菌落。在適合克隆到載體 pET9a中的CRM197表達的細菌菌株中，兩種B型大腸桿菌的衍生菌株被選擇，即BL21AI和 BL21(DE!3)。兩者都含有整合到染色體中的一個拷貝的編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的基因， 由可誘導的啟動子控制。到達細胞內後，這種酶能夠激活克隆到啟動子PT7下遊的人工基因CRM197或CRM197-標籤的轉錄。菌株BL21AI具有由啟動子pBAD控制的編碼Τ7 RNA聚合酶的基因，因此誘導發生歸因於在培養基中阿拉伯糖的添加。而菌株BL21(DE3)被獲得歸因於含有受控於Iac啟動子的T7 RNA聚合酶基因的原噬菌體λ (DE3)在細菌基因組中的整合。就後一種情況來講，表達系統的級聯誘導被IPTG，一種乳糖類似物激活。適合用 pET9a-CRM197構建體轉化和目標蛋白表達的其他大腸桿菌菌株是BL21 (DE3)的衍生菌株， 例如 BL21Star (DE3)、BL21_Gold (DE3)、BL21 (DE3)pLys、ER2566 的衍生菌株，和所有在其基因組中含有一個拷貝的編碼T7 RNA聚合酶的基因的經修飾的B或K-12菌株。轉化的大腸桿菌菌株被選擇後，將在不同的培養和誘導條件下進行表達測試。預備測試的目的是找出使得與細菌蛋白相比蛋白CRM197能夠高水平表達的方法(優選達到約30-40% )。考慮的因素是培養基、生長溫度、(30°C和37°C )、誘導劑的濃度和誘導時間。 所用的培養基是經典的LB，但也可使用促使高生物量產量的其他豐富型培養基。當重組蛋白過表達時，產物能被分泌到培養基中(如果其具有特異的信號序列)或者能夠在胞質中以可溶形式或以不可溶的包涵體形式積聚。蛋白的定位影響隨後的純化過程。就特定的從 SEQ ID N0 5(帶有組氨酸-標籤)代表的人工基因的轉錄獲得的具有SEQ ID N0 6的融合蛋白CRM197-標籤來講，發現蛋白被菌體以不可溶形式(包涵體)表達並且以非常方便的方式積聚以用於工業生產目的。本發明述及的表達方案包括CRM197蛋白以所述不可溶形式的積聚和描述了包括將其以可溶形式回收和復性以獲得有生物活性形式的蛋白的步驟。此外，本發明包括兩個層析純化步驟和一個去除標籤的最終步驟。最適合的層析方法的選擇依賴於CRM197-標籤的化學物理特徵，例如pi (等電點)、胺基酸組成和尺寸。與標籤的融合使得蛋白能夠使用對該標籤具有高親和力的特定樹脂(在柱中和分批地)純化。 標籤的存在對於增加蛋白在胞質中的穩定性和隨後的純化都是有用的。因此，一方面，本發明涉及由包含SEQ ID N。1和編碼多肽標籤的簡短序列的多核苷酸編碼的重組融合蛋白CRM197-標籤。特別優選的是序列SEQ ID N0 6的重組融合蛋白，由包含SEQ ID N0 2的核苷酸編碼。上述的重組融合蛋白CRM197-標籤對於醫療目的，對於腫瘤治療例如乳腺癌、 卵巢癌和前列腺癌，或對於動脈粥樣硬化斑塊的減少是潛在有用的。前面所述的融合蛋白也可以用作例如那些針對肺炎球菌(Pneumococcus)、流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌 (Meningococcus)、肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)和其他致病菌的疫苗的偶聯載體。本發明進一步涉及用於生產CRM197-標籤蛋白的方法，所述方法包括上面闡釋的經修飾的大腸桿菌菌株的使用。所述方法優選包括(i).藉助於上述大腸桿菌培養物的蛋白的合適誘導表達；(ii).通過下述步驟提取a.在包含 Tris-HCl 20_50mM pH 7. 5-8. 5, NaCl 100_150mM、去垢劑 0. 5-1. 5%、 蛋白酶抑制劑0. 5-1. 5%的緩衝溶液中裂解，在0-5°C持續1. 5-2. 5小時，伴隨攪拌；b.上清液與固體殘留物(沉澱)的分離；c.用 pH 7. 5-8. 5 的包含 Tris-HCl 20_50mM、NaCl 100_150mM、去垢劑 0. 5-1. 5% 和尿素5-7M的溶解緩衝液處理上步得到的固體殘留物，在20-30°C持續1. 5-2. 5小時，伴隨攪拌；d.上清液與固體殘留物的分離，上清液中含有溶解的CRM197-標籤蛋白；(iii).步驟(ii)得到的蛋白的純化與復性，通過a.親和層析或透析；b.分子排阻層析(凝膠過濾)或陰離子交換層析。在大腸桿菌經包含有SEQ ID N0 2，例如SEQ ID N0 5的質粒修飾的實施方案中，重組蛋白CRM197-標籤以與包含促使其表達和有利於其隨後通過親和層析純化的6個組氨酸的標籤序列融合形式生產。通過該方法獲得的CRM197和相似蛋白的量可以通過調整控制表達水平的參數(培養基、生長溫度、誘導時間等)來改變。就轉化了所使用的合適質粒的大腸桿菌菌株BL21AI或BL21(DE!3)來講，最佳表達條件在37°C誘導3小時後獲得(圖 1)並且優選轉化菌株BL21AI。在這些條件下，表達產率高達40%且CRM197-標籤相當於裂解和去除可溶部分後獲得的不可溶部分的大約80%。認為在採用最佳生長、裂解和回收條件的生產方法中，CRM197-標籤的表達產率可以高達0. 5-lg/L是可行的。在使用SEQ ID N。5的特定情形下，表達SEQ ID N。6的重組CRM197-標籤具有包含對二價金屬離子(銅，鎳等)有高親和力的6個組氨酸的28個胺基酸的標籤；利用該特徵有助於以不可溶形式表達的融合蛋白的純化。親和層析也能用於去除從不可溶部分回收CRM197-標籤所需的變性劑。這種情況下，去除過程逐步發生(以兩個逆梯度階段)以有利於採納正確的蛋白構象(摺疊)。保持與目的蛋白結合的汙染蛋白在彼此的分子量差異相當大的情況下可隨後通過凝膠過濾層析被去除。或者，利用CRM197的pi值(5. 8-5. 9)，可使用離子交換層析進行第二純化階段。因此本發明包括在親和層析之後酌情使用的兩個不同的純化方法。無論使用哪種方法，重組蛋白的最終產率和純度水平是相當的。蛋白通過Bradford測試被定量且在10%的丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)中可見。根據本發明描述的方案獲得的CRM197-標籤蛋白的表達產率是250 士 50mg/L培養基(在裝有LB培養基的量瓶中)。如前面提及的，在發酵罐中進行的工業方法中，使用合適的生長介質和條件，產率進一步增加。值得強調的是本發明所述的裂解和提取方法是簡單的和經濟的；另外，方法的各個階段是為達到適合工業方法的方案而設計以避免對特殊緩衝液/試劑或特殊的實驗設備(例如用於細胞裂解的超聲儀)的需要。最後，本發明涉及用於去除具有雙重目的，即使得CRM197能夠表達，增加其穩定性和有助於其純化的標籤的方法。因此本發明還涉及CRM197的製備方法，所述方法的特徵是如上闡釋的經修飾的大腸桿菌菌株的使用。上面所述的用於CRM197的生產的方法優選包括上述融合蛋白CRM197-標籤的表達和隨後通過合適的酶消化的標籤的去除。就具有序列SEQ ID N。6的CRM197-標籤來講，用於去除標籤的合適的酶是腸激酶且其消化優選在含有 Tris-HCl 10-20mM、pH 7. 5-8. 5、NaC140_60mM、CaCl2 1. 5-2. 5mM 和濃度在0.01%-0.03%重量百分比(w/w)範圍內的酶的緩衝液中進行，在20-25°C持續 18-24小時。在去除標籤後，沒有標籤的蛋白優選通過親和層析純化。通過根據本發明的方法獲得的CRM197重組蛋白SEQ ID N。7在結構和功能上與使用已知方法生產的CRM197相同；其以天然形式獲得且因此是有活性的，並且因此可用於已知應用中。藉助於下面的實施方案的實例，本發明將更易理解。序列SEQ ID N° 1~為在大腸桿菌中表達而優化的編碼CRM197的人工序列
GGTGCCGAT GACGTGGTTG ACTCTTCCAA AAGCTTCGTC ATGGAAAACTTCAGCTCCTA TCACGGCACTAAACCGGGTT ATGTCGACAG CATCCAGAAAGGCATCCAGA AACCGAAATC TGGCACTCAG GGTAACTATG ACGACGACTGGAAAGAGTTC TACTCTACCG ACAACAAATA CGACGCGGCT GGTTATTCTGTGGACAACGA AAACCCGCTG TCTGGTAAAG CTGGTGGTGT TGTTAAAGTGACCTACCCGG GTCTGACCAA AGTTCTGGCT CTGAAAGTGG ACAACGCCGAAACCATCAAA AAAGAACTGG GTCTGTCTCT GACCGAACCG CTGATGGAACAGGTAGGTAC CGAGGAATTC ATCAAACGTT TTGGTGATGG TGCGTCCCGTGTTGTACTGT CTCTGCCATTTGCCGAAGGT TCTAGCTCTG TCGAGTACATCAACAACTGG GAGCAGGCCA AAGCTCTGTC TGTGGAACTG GAAATCAACTTCGAGACCCG TGGTAAACGTGGTCAGGACG CAATGTATGA ATACATGGCACAGGCTTGCG CGGGTAACCG TGTACGTCGT TCTGTAGGTT CTTCCCTGTCTTGCATCAAC CTGGACTGGG ATGTCATCCG TGACAAAACC AAAACCAAAATCGAGTCCCT GAAAGAGCAC GGTCCGATCA AAAACAAAAT GAGCGAATCTCCGAACAAAA CGGTCTCTGA GGAAAAAGCG AAACAGTACC TGGAAGAATTCCATCAGACC GCCCTGGAAC ACCCGGAACT GTCTGAACTG AAAACCGTTACCGGTACTAA CCCGGTTTTC GCAGGTGCTA ACTACGCAGC GTGGGCGGTTAACGTAGCCC AGGTAATCGA TTCCGAAACC GCAGACAACC TGGAAAAAACGACTGCGGCT CTGTCTATTC TGCCGGGTAT TGGTAGCGTG ATGGGTATTGCAGATGGTGC AGTTCACCAC AACACGGAAG AAATCGTTGC GCAGTCTATCGCTCTGTCTT CTCTGATGGTAGCACAGGCG ATCCCGCTGG TTGGTGAACTGGTTGACATT GGCTTCGCGG CCTACAACTT CGTTGAATCC ATCATCAACCTGTTCCAGGT TGTGCACAAC TCTTACAACC GTCCAGCTTA CTCTCCGGGTCACAAAACCC AGCCGTTCCTGCACGACGGT TATGCGGTTT CTTGGAACACCGTTGAAGAC AGCATCATCC GTACTGGTTT CCAGGGTGAA TCTGGCCACGACATCAAAAT CACTGCTGAA AACACCCCGC TGCCGATCGC AGGTGTTCTCCTGCCAACTA TTCCGGGTAA ACTGGACGTG AACAAATCCA AAACGCACATCTCCGTGAAC GGTCGTAAAA TCCGCATGCG TTGTCGTGCG ATTGATGGTGACGTTACTTT CTGTCGTCCG AAATCTCCGG TCTACGTAGG TAACGGTGTACATGCTAACC TCCATGTAGC GTTCCACCGT TCTTCTTCCG AGAAAATCCACTCCAACGAG ATCTCTAGCG ACTCTATCGG TGTTCTGGGT TACCAGAAAACCGTTGACCA CACCAAAGTG AACTCCAAAC TCAGCCTGTT CTTCGAAATCAAATCTSEQ ID N° 2_編碼在大腸桿菌中的CRM197-組氨酸標籤的人工序列ATG GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGACTGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA GGTGCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAGCTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCATCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA
GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGACAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCTACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACCATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGTAGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTGTACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAACAACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGAGACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGGCTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGCATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGAGTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGAACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCATCAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGGTACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACGTAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACTGCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGATGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTCTGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTTGACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTTCCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACAAAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTTGAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACATCAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGCCAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCCGTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGTTACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATGCTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCCAACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGTTGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAATCT加下劃線的編碼含有6個組氨酸的標籤肽的序列斜體併力口 7^7/減枵:編碼能被腸激酶識別的5個胺基酸(DDDDK)的15個核苷酸SEQ ID N° 3_用於大腸桿菌中的CRM197蛋白表達的人工序列CATATG GGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGGAAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATCCAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGACGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTTATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTTAAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA
CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGATGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCGTCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGAGTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAATCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATACATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTCCCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAACCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGCGAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGAAGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAACCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGGGCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGAAAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGGGTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAGTCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGGTGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCATCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCTCCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTGGAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTGGCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGTGTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAACGCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTGATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAACGGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAAAATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACCAGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTCGAAATCAAAT C l ΓΑΑ ΧΙΑ GG ATCC加粗型的NdeI ( CATATG )和BamHI ( GGATCC )限制性酶切位點加下劃線的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA TGA)SEQ ID N。4_ 來自 SEQ ID N。3 的 CRM197 蛋白序列M GADDVVDSS KSFVMENFSS YHGTKPGYVD SIQKGIQKPK SGTQGNYDDDWKEFYSTDNK YDAAGYSVDN ENPLSGKAGG VVKVTYPGLT KVLALKVDNAETIKKELGLS LTEPLMEQVG TEEFIKRFGD GASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKAL SVELEINFET RGKRGQDAMY EYMAQACAGN RVRRSVGSSLSCINLDffDVI RDKTKTKIES LKEHGPIKNK MSESPNKTVS EEKAKQYLEEFHQTALEHPE LSELKTVTGT NPVFAGANYA AffAVNVAQVI DSETADNLEKTTAALSILPG IGSVMGIADG AVHHNTEEIV AQSIALSSLM VAQAIPLVGELVDIGFAAYN FVESIINLFQ VVHNSYNRPA YSPGHKTQPF LHDGYAVSffNTVEDSIIRTG FQGESGHDIK ITAENTPLPI AGVLLPTIPG KLDVNKSKTH
ISVNGRKIRMRCRAIDGDVT FCRPKSPVYV GNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVD HTKVNSKLSL FFEIKS
_4]SEQ ID N°5_用幹大腸桿菌中的融合蛋白CRM197-標籤的表汰的人工序
MCATATG GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGACTGGTGGTCAGCAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA GGT GCCGATGACGTGGTTGACTCTTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCACGGCACTAAACCGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACCGAAATCTGGCACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACTCTACCGACAACAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAACCCGCTGTCTGGTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCTGACCAAAGTTCTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAGAACTGGGTCTGTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAGGAATTCATCAAACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCTGCCATTTGCCGAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGCAGGCCAAAGCTCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGTAAACGTGGTCAGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGGTAACCGTGTACGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGGACTGGGATGTCATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAAGAGCACGGTCCGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGTCTCTGAGGAAAAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCCTGGAACACCCGGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCGGTTTTCGCAGGTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGTAATCGATTCCGAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGTCTATTCTGCCGGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTTCACCACAACACGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCTGATGGTAGCACAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCTTCGCGGCCTACAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTGCACAACTCTTACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCCGTTCCTGCACGACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCATCATCCGTACTGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACTGCTGAAAACACCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCCGGGTAAACTGGACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTCGTAAAATCCGCATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGTCGTCCGAAATCTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCATGTAGCGTTCCACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCTCTAGCGACTCTATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACCAAAGTGAACTCCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CTTAATGA GGATCC加粗型的NdeI ( CATATG )和BamHI ( GGATCC )限制性酶切位點加下劃線的編碼含有6個組氨酸的標籤肽的84個核苷酸ATG GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGACTGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA斜體的和力口 ΤΙ/減枵編碼被腸激酶識別的5個胺基酸(DDDDK)的15個核苷酸起始密碼子ATG終止密碼子TAA TGASEQ ID N° 6_來自SEQ ID N° 5的CRM197-組氨酸標籤的蛋白序列MGGSHHHHHH GMASMTG6QQ MGRDDDDK GADDVVDSSK SFVMENFSSYHGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDff KEFYSTDNKY DAAGYSVDNENPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGTEEFIKRF⑶G ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETRGKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDffDVIR DKTKTKIESLKEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGAVHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQVVHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSffNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKITAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAID⑶VTFCRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDHTKVNSKLSLF FEIKS加粗型的包含6個組氨酸(H)和腸激酶剪切位點(DDDDK)的標籤序列( 個氨
基酸)SEQ ID N° 7_從SEQ ID N° 6去除標籤之後的CRM197蛋白序列GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDffKEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAETIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRF⑶G ASRVVLSLPF AEGSSSVEYINNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLSCINLDffDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEFHQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKTTAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGELVDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSffNTVEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHISVNGRKIRMR CRAID⑶VTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIHSNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS實驗部分實施例1-基因SEQ ID N° 3禾口 SEQ ID N° 4的合成和構建體pET9a_CRM197-標籤的製備合成基因通過把多個約27_43bp (有IO-Mbp的重疊區域)的寡核苷酸連接在一起而獲得。這一步驟叫做「組裝」。具體地，多個合成的寡核苷酸在末端被磷酸化以使得能夠進行連接反應並且然後在Taq DNA連接酶存在下等摩爾量混合。所述酶在高溫G5_65°C ) 下有活性且催化一個寡核苷酸的5』端位置的磷酸和另一個寡核苷酸的3』端位置的羥基基團之間的磷酸二酯鍵的形成。連接產物隨後通過PCR擴增並且利用NdeI和BamHI酶被克隆到pET9a載體上。所使用的用於擴增的引物如下CRM197 正向5' ggaattCATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGA 3『CRM197 反向5' cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAG 3『CRM197-His 正向5' ggaattCATATGGGTGGTTCTCATCATCACCATCA 3『CRM197-His 反向5' cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAGAACAGG 3『根據標準操作指南使用下面的量進行PCR(30個循環)3μ1連接產物5 μ 1 dNTP (4mM)5 μ 1 IThermoPol 反應緩衝液 IOX (New England Biolabs)2μ 1 正向引物(50pmol)2μ 1 反向引物(50pmol)0. 5μ 1 Vent DNA 聚合酶(New England Biolabs)並且添加32. 5 μ 1水到50 μ 1體積。含有SEQ ID Ν° 1和SEQ ID Ν° 2的PCR產物被純化以去除引物、dNTP和酶，然後用NdeI和BamHI消化，因而獲得序列為SEQ ID N。3和SEQ ID N。5的基因。平行地， Iyg的質粒pET9a在同樣條件下(37°C持續2小時)被相同的酶消化。最後，通過使用插入片段與載體比例為1 1和3 1在16°C持續12-16小時進行連接反應。該反應體系中的一等份被用於轉化受體細菌細胞。實施例2-細菌菌株和培養基BL21AI (Invitrogen)和 BL21 (DE3)大腸桿菌菌株(Novagen)被用作 CRM197-標籤 (SEQ ID N0幻表達的宿主。通常所使用的液體和固體培養基是經典的LB(Luria-Bertani ； Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning :a Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)， Cold Spring Harbor LaboratoryPress, NY)。使用 IOng 的 pET9a_CRM197_ 標籤構建體(從實施例1獲得)轉化經合適處理的宿主菌株；使用合適的Imm杯和1. Skv的脈衝 (GenePulser II,Bio-Rad)根據標準操作指南進行電穿孔。經電穿孔的細胞在SOC培養基 (Sambrook等人，1989)中在37°C伴有振蕩地生長45分鐘，然後轉移到添加了卡那黴素(終濃度為50yg/mL)的固體LB培養基上以選擇轉化子。培養通常在有氧條件下在37°C伴有振蕩(180rpm)地進行。實施例3-表達添加阿拉伯糖13mM(對於BL21AI菌株)和IPTG ImM(對於BL21 [DE3]菌株)到培養基中以誘導CRM197-標籤SEQ ID N0 5的表達。挑選轉化的菌株後，用小體積(IOmL) 進行表達測試。單菌落生長於ImL的LB培養基中(含有卡那黴素)且合適地轉移到新鮮培養基中，直到到達指數生長期(通過以分光光度計測量在600nm處的吸光度確定)。在吸光度值約為0. 5-0. 60D時加入誘導劑且以不同的時間(1小時、3小時和15小時)誘導培養物。通過離心(4000g，15分鐘)收集細胞並裂解所得的細胞沉澱以釋放總蛋白。起初，在樣品緩衝溶液(Bio-Rad)存在下持續煮沸樣品5分鐘進行簡單地裂解並在SDS-PAGE電泳 (10%丙烯醯胺)中分離20μ L的每個樣品。用考馬斯亮藍溶液對凝膠染色以看到蛋白條帶且對應於CRM197-標籤的過表達條帶(約61kDa;圖1)是可識別的。所述條帶相當於丙烯醯胺凝膠中可見總蛋白的約40%。在驗證了目的蛋白的表達之後，隨後使用大量培養物(500mL)和在最佳條件下 (用阿拉伯糖13mM誘導3小時)進行測試。實施例4-提取為不藉助於超聲儀的使用而裂解細胞，製備已知組成的不同裂解溶液還改變溶液體積與樣品體積的比值，並評價它們的效力。裂解緩衝液的組分是=Tris-HCl pH8(濃度在 20-50mM範圍內)、NaCl (濃度在100_150mM範圍內)、濃度在0. 5-1. 5%範圍內的去垢劑 (Triton X-100、SDS、吐溫20)和蛋白酶抑制劑(例如PMSF ImM)。我們也評價了還原劑例如β-巰基乙醇或DTT(10-50mM)的作用。細胞沉澱在冰上伴隨攪拌下裂解2小時。上清液(對應於可溶性的蛋白部分)通過離心(10，000g，30分鐘)被分離並在SDS-PAGE凝膠中分析(圖幻。重組蛋白在這部分是不可見的，因為其以包涵體形式積聚並聚集於裂解後獲得的沉澱中。因此本發明包括溶解溶液的使用以從不可溶部分回收CRM197-標籤(圖2)。 溶解溶液的組分是Tris-HCl pH8 (濃度在20_50mM範圍內)、NaCl (濃度在100_150mM範圍內)、0· 5-1. 5%的去垢劑(Triton X-100、SDS、吐溫20)和6-7M尿素。含有包涵體的沉澱在溫度為20-30°C的範圍伴隨攪拌下溶解2小時。通過離心回收上清液並在SDS-PAGE凝膠中分析，其中對應於CRM197-標籤的條帶是可見的(圖2)。在用尿素溶解的樣品中，與 CRM197-標籤有關的條帶相當於凝膠中所包含的蛋白的約50%。實施例5-純化用尿素溶解的樣品貯存)經過親和層析(Hi1Trap Chelating,GEHealthcare) 以達到初步純化和去除尿素以在柱中使蛋白復性的雙重目的。另一種合適的復性方法是透析，使用濃度遞減的尿素溶液(從6-7M到0M)。根據製造商的說明調節和處理層析柱。就帶有6個組氨酸標籤的CRM197蛋白來講，層析柱用鎳離子(NiSO4 0. 1M)複合。該方法包括三個階段1)去垢劑的去除；2)通過二階段逆梯度去除尿素；3)用咪唑梯度洗脫(0-500mM)。樣品在慢流速條件(0. 5mL/分鐘)下上樣和復性， 而其他階段在流速為ImL/分鐘下完成。獲得的最終部分包含溶於Tris-HClpH 8、NaCl、咪唑的溶液中的CRM197蛋白(與標籤融合)(圖3表示一些層析部分)。本發明包括後來通過凝膠過濾層析(Superdex 200柱，GE Healthcare)的純化。 在該步驟完成前，樣品通過超濾(Amicon，Millipore)被濃縮並被脫鹽以去除咪唑(HiTrap 脫鹽柱，GE Healthcare)。Superdex 柱用含有 Tris-HCl 50mM pH8、NaCl 150mM 的緩衝液調節。在SDS-PAGE凝膠中分析部分並且那些含有純的CRM197-標籤的部分被匯集和冷凍。 圖4表示CRM197-標籤純化的各個階段。作為分子排阻層析的替代方法，CRM197-標籤可通過離子交換層析純化。在這種情況下，優選使用PH8的合適緩衝液調節的陰離子交換樹脂。實施例6-標籤去除除了純化所需的6個組氨酸以外，標籤序列(MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDK)還包含能被特異性蛋白酶腸激酶(New England BioLabs)識別的剪切位點DDDDK。為獲得沒有標籤(SEQ ID N0 6)的純的重組蛋白，CRM197-標籤(SEQ ID N0 5)與腸激酶一起孵育。消化反應在Tris-HCl 20mM pH 8,NaCl 50mM、CaC122mM緩衝液中，使用相當於0. 02% (w/w)的量的酶在22-M°C下持續進行18-M小時。圖5表示SDS-PAGE凝膠其中被消化的CRM197是可見的(位於泳道2)被分為兩個結構域A和B (樣品在破壞兩個結構域之間的二硫鍵橋的還原劑存在下煮沸)。該操作方案包含隨後通過親和層析(在與上述用於 CRM197-標籤純化的相同的柱中和使用相同的樹脂)將CRM197(沒有標籤，SEQ ID N。6) 與單獨標籤分離的步驟。參考文獻-Uchida T. , Pappenheimer A. M. Jr,禾口 Greany R. , 1973. J Biol Chem, 248 3838-44.-Gill D.M. JPPappenheimer A. M. Jr, 1971. J. Biol Chem，246 1492-1495.-Uchida T. , Pappenheimer A. M. Jr, Harper Α. Α. , 1973. J Biol Chem, 248 3845-50.-Papini Ε. ，Rappuoli R. ，Murgia Μ.，禾口Montecucco C. ，1993. J. Biol. Chem, 268 1567-1574.-Cabiaux V. ，Wolff C.，禾口 Ruysschaert J. Μ. , 1997. Int J Biol Macromol, 21 285-98.-Honjo T.，Nishizuka Y.，Kato I.和 Hayaishi 0. , 1971. J Biol Chem, 246 4251-60.-Giannini G. , Rappuoli R.,禾口 Ratti G. , 1984. Nucleic Acids Res, 12 4063-4069.-Bruce C. ,Baldwin R. L. ,Lessnick S. L.，禾口 Wisnieski B. J. , 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 :2995-2998.-Lee J. W.，Nakamura L. Τ.，Chang Μ. P.，和 Wisnieski B. J.，2005. BBActa, 1747 121-131.-Cox J. C. ,1975. Applied Microbiol, 29 :464-468.-Rappuoli R. ,1983. Applied Envirom Microbiol,46 :560-564.-Rappuoi R. ,Michel J. L.，禾口Murphy J. R.，1983. J. Bacteriol, 153 :1202-1210.-Rappuoli R.等人，1990，美國專利 4925792.-Metcalf B. J.，1997，美國專利 5614382.-Leong D.，Coleman K. D.，和 Murphy J. R.，1983. J Biol Chem, 258 :15016-20.-Bishai W. R. , Miyanohara Α.禾口 Murphy J. R. , 1987a. J Bacteriol，169 (4) 1554-1563.-Bishai W. R. , Rappuoli R.禾口 Murphy J. R. , 1987b. J Bacteriol，169 (11): 5140-5151.-Spilsberg B.，Sandvig K.，和 Walchli S.，2005. lexicon，46 :900-906.-Corvaia N.，Nguyen Τ. N.和 Beck Α.，FR 2827606Α1 2003.-Dehottay P. Μ. H.等人，US2008/0193475.-Wolfe H.等人，US2008/0153750.
-Mekada Ε.和 Miyamoto S. ，US 2006/0270600A權利要求
1.一種多核苷酸，所述多核苷酸包括序列SEQ ID N0 1。
2 根據權利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸還包括編碼標籤多肽的至少一種核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的多核苷酸，其中所述標籤序列連接於合適的剪切序列以被能夠隨後去除所述標籤的合適的酶識別。
4.一種表達載體，所述表達載體包括根據權利要求1-3中的任一項所述的多核苷酸。
5.一種遺傳修飾的微生物，所述遺傳修飾的微生物屬於大腸桿菌(Escherichia coli) 物種並包括根據權利要求4所述的表達載體。
6.一種重組融合蛋白CRM197-標籤，所述重組融合蛋白CRM197-標籤由根據權利要求 2或3所述的多核苷酸編碼。
7.一種用於生產根據權利要求6所述的CRM197-標籤蛋白的方法，所述方法包括藉助於在根據權利要求5所述的遺傳修飾的大腸桿菌中培養而表達所述CRM197-標籤蛋白。
8.一種用於生產CRM197蛋白的方法，所述方法藉助於在根據權利要求5所述的遺傳修飾的大腸桿菌中表達所述CRM197-標籤蛋白。
9.根據權利要求8所述的方法，所述方法包括將根據權利要求6所述的蛋白作為中間體。
10.根據權利要求6所述的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白用於藥物用途或在藥物組合物中作為載體。
全文摘要
本發明涉及包括編碼CRM197並為其在大腸桿菌中表達而優化的SEQ ID N°1的多核苷酸序列。因此本發明涉及用於經由融合蛋白CRM197-標籤在大腸桿菌中生產CRM197的方法。
文檔編號C12P21/00GK102459317SQ201080028229
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者P·巴格裡昂尼, 亞歷山德拉·史蒂芬, 亞歷杭德羅·霍克埃普勒 申請人:大型界面系統校際研究中心