一種鈦材料表面塗層的方法及其塗層複合材料的應用的製作方法

2023-05-07 22:42:01 4

專利名稱：一種鈦材料表面塗層的方法及其塗層複合材料的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫用材料領域，特別涉及一種通過重組膠原蛋白調控鈦表 面仿生礦化而形成對成骨細胞具有良好細胞相容性的新型塗層的製備方法。該 方法製備的複合材料可作為骨修復或替代材料而應用於骨組織工程。
背景技術：
骨骼組織非常複雜，其主要組成部分是有機質骨膠原和無機質羥基磷灰 石。另外，還有少量的其他有機物，如蛋白質、多糖和脂類等。從材料科學的 角度出發，天然骨可被看作是一種彈性高分子聚合物增韌的羥基磷灰石基複合 材料。正是因為骨組織具有如此精微複雜的結構，到目前為止臨床上對大塊骨 缺損的醫治仍是一個研究的難點，多年來臨床應用的骨修復技術主要採取自體 骨移植和異體骨移植，然而自體骨移植受自身供體有限性的限制且給患者增加 痛苦，異體骨移植存在抗原性的問題。
隨著科技的進步，骨修復材料的開發和應用為骨移植提供新的骨源，其中 傳統的骨修復材料(如各種以金屬、陶瓷或高分子製造的人工骨替代材料等) 也已應用於臨床，但多數是作為永久植入體使用，它們不能參與人體的新陳代 謝，因而長期效果往往不盡人意。具有生物相容性、骨誘導性等生物學特性的 骨替代材料研究和製備已成為當今世界生物材料科學研究中的前沿課題，而膠 原蛋白、羥基磷灰石和金屬鈦是目前備受關注的三種骨修復材料。
膠原蛋白由多糖蛋白分子組成，是結締組織的主要蛋白成分。膠原蛋白具 有良好的生物相容性、生物降解性和細胞黏附性能等諸多功能，在生物醫用材 料和組織工程等領域具有廣泛的應用價值。但是天然膠原蛋白來源有限，且具
有高感染性和免疫排斥反應的潛在危險(DuCL， WangMQ， Liu JY, Pan ML， Cai YR， Yao JM. Improvement of thermostability of recombinant collagen-like protein by incorporating a foldon sequence. Appl Microbiol Biotechnol 2008; 79:195-202)。羥基磷灰石是骨基質中無機鹽的主要化學成分，化學式為CalO(P04)6卿2，簡稱HA，密度為3. 16g/cm，折射率是1. 64 1. 65， Ca/P 原子比為1.67。由於羥基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳導 性及其與人體骨礦物相組分的相似性，而被廣泛用於生物醫用材料領域。然而 單一組分的羥基磷灰石燒結性能差，作為種植材料其硬度較低、韌性較差、力 學性能不足，致使其難以承受負荷或衝擊，因而限制了其在臨床上的應用。為 了提高羥基磷灰石陶瓷材料的力學性能，許多學者採用與其他材料複合的方法 來提高羥基磷灰石的性能。而鈦及合金表面會自發形成均勻緻密的二氧化鈦氧 化膜，其介電常數與水相當，因此具有較好的生物性能，且具有較高的強度和 斷裂韌性，是臨床應用的金屬植入體中綜合性能最為優異的生物醫用材料。但 它們仍然具有生物惰性，與骨的結合屬於機械鎖合。且釋放出的金屬元素會引 起細胞出現炎症反應或壞死，導致植入失敗(Xiong JY， Li YC， Wang XJ， Hodgson P， Wen CE. Mechanical properties and bioactive surface modification via alkali—heat treatment of a porous Ti-18Nb-4Sn alloy for biomedical applications. Acta Biomaterialia 2008; 4:1963—8)。

發明內容
本發明的目的在於針對鈦材料作為骨修復材料的缺陷，採用重組類人膠原 蛋白來調控鈦基體上羥基磷灰石的生成，從而製備出一種新型的對成骨細胞具
有良好細胞相容性的鈦表面生物活性塗層材料，包括以下步驟
(1) 將鈦片依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲清洗各30min;
(2) 將清洗後的鈦片放入5mol/L的Na0H溶液中，80。C處理24h;取出 鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於40。C下乾燥；
(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以10°C/min，升溫至60(TC，保溫熱處理 lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片；
(4) 配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液；
(5) 將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的 1.5倍的仿生液，並於37。C下靜置2 14天，每12h換一次1.5xCSBF液；
(6) 將步驟(5)中浸泡於1.5xCSBF中的鈦片取出，用去離子水清洗， 自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層，該塗層為重組膠原蛋白-羥基磷灰 石複合塗層。所述步驟(1)中的鈦片為10x10x1腿3的鈦片。
所述鈦片包括純鈦金屬、鎳鈦合金、鈦絡合金或其它鈦合金。
所述步驟(4)配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液按下表1L仿生 液中包含的成分，PH值為7.4，由去離子水定容，得到含有重組膠原蛋白的 1.5倍的仿生液(簡稱:1.5xCSBF溶液);
成分用量
NaCl12, 0540克
NaHC030. 5280克
KC10. 3375克
K2HP04 3H200. 3450克
MgCl2 6H200. 4665克
1 M HC115
CaCl20. 4440克
Na2S040. 1080克
C4HuN03 (Tris)9. 0945克
1 M HC150 mL
重組膠原蛋白0.5克
所述步驟(4)用1M鹽酸調pH至7.4。 更進一步-
(1) 將10x10x1 mm3的鈦片依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲 清洗各30min;
(2) 將清洗後的鈦片放入5mol/L的NaOH溶液中，80。C處理24h;取出 鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於4(TC下乾燥；
(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以1(TC/min，升溫至60(TC，保溫熱處理 lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片；
(4) 配製含有重組膠原蛋白的1.5倍的仿生液按下表依次稱量相應的 成分，並按表中的順序逐一溶解在去離子水中，用1M鹽酸調pH至7.4，定容 至1L，為1.5xCSBF溶液;_
成分 用量NaCl12. 0540克
NaHC030. 5280克
KC10. 3375克
K2HP04 3H200. 3450克
MgCl2 6H200. 4665克
1 M HC115 mL
0. 4440克
Na2S040. 1080克
C4HuN03 (Tris)9. 0945克
1 M HC150
重組膠原蛋白0. 5克
(5) 將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的 1.5xCSBF溶液，並於37。C下靜置2 14天，每12h換一次1. 5xCSBF液；
(6) 將步驟(5)中浸泡於1.5xCSBF中的鈦片取出，用去離子水小心清 洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層，該塗層為重組膠原蛋白-羥基 磷灰石複合塗層。
本發明的方法製備的具有重組膠原蛋白-羥基磷灰石複合塗層的鈦複合材料。
本發明的鈦複合材料作為骨修復或替代材料而應用於骨組織工程。
本發明所形成的塗層是納米羥基磷灰石晶體與重組膠原蛋白的複合物，具 有天然骨中的兩個主要的組成成分，具有促進細胞黏附、增殖和分化的功能。 製備的鈦複合材料可作為骨修復或替代材料而應用於骨組織工程。


圖1為本發明中鈦材料在1. 5xCSBF液中浸泡14天後的表面塗層形貌； 圖2為本發明中對照例，即在不含重組膠原蛋白的1. 5倍仿生液(1. 5xSBF) 中浸泡14天後的表面塗層形貌；
圖3比較了 MG-63細胞在不同材料上培養不同時間後的密度；圖4比較了 MG-63細胞在不同材料上培養不同時間後鹼性磷酸酶(ALP) 活性；
圖5比較了 MG-63細胞在不同材料上培養不同時間後骨鈣素(OC)表達水平。
具體實施例方式
1.5倍的仿生液(1.5xCSBF)配方如下
成分用量
NaCl12. 0540克
NaHC030. 5280克
KC10. 3375克
K2,4 3H200. 3450克
MgCl2 6H200. 4665克
1 M HC115
0. 4440克
Na2S040. 1080克
C4HuN03 (Tris)(國藥集團)9. 0945克
1 M HC150 mL
重組膠原蛋白0. 5克
(ZL200610048946. 0)1. 5倍的仿生液(1. 5xSBF)配方如下(Lin， F. ; Li， Y. C. ; Jin， J. ; Cai， Y. R. ; Wei， K. M. ; Yao， J". M. Deposition behavior and properties of silk fibroin scaffolds soaked in simulated body fluid. Mater. Chem. Phys.，
2008， 111， 92-97. ):_
成分_用量
NaCl 12.0540克
NaHC03 0. 5280克
KC1 0.3375克
K2HP04 3H20 Q.3450克MgCl2 6H20 0. 4665克
1 M HC1 15 mL
CaCl2 0. 4440克
Na2S04 0. 1080克 C4HnN03 (Tris)(國藥集團)9. 0945克
1 M HC1 50 mL
實施例1
(1) 將鈦片(10x10x1 mm3)依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲清 洗各30min。
(2) 將清洗後的鈦片放入5mol/L的NaOH溶液中，80。C處理24h。取出 鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於4(TC下乾燥。
(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以1(TC/min，升溫至60CTC，保溫熱處理 lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片。
(4) 配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液(1. 5xCSBF)，依次稱量相 應的成分，並逐一溶解在去離子水中，用1M鹽酸調pH至7.4，定容至1L。
(5) 將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的 1.5xCSBF溶液，並於37。C下靜置2天，每12h換一次1. 5xCSBF液。
(6) 將步驟(5)中浸泡於1.5xCSBF中的鈦片取出，用去離子水小心清 洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層。
實施例2
(1) 將鈦片(10x10x1 mm3)依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲清 洗各30min。
(2) 將清洗後的鈦片放入5 mol/L的NaOH溶液中，80。C處理24h。取出 鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於4(TC下乾燥。
(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以KTC/min，升溫至60(TC，保溫熱處理 lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片。
(4) 配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液(1. 5xCSBF)，依次稱量相 應的成分，並逐一溶解在去離子水中，用1M鹽酸調pH至7.4，定容至1L。(5) 將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的1.5xCSBF溶液，並於37。C下靜置8天，每12h換一次1. 5xCSBF液。
(6) 將步驟(5)中浸泡於1.5xCSBF中的鈦片取出，用去離子水小心清洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層。
實施例3
(1) 將鈦片(10x10x1 mm3)依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲清洗各30min。
(2) 將清洗後的鈦片放入5 mol/L的NaOH溶液中，8CTC處理24h。取出鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於4(TC下乾燥。
(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以1(TC/min，升溫至60(TC，保溫熱處理lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片。
(4) 配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液(1. 5xCSBF)，依次稱量相應的成分，並逐一溶解在去離子水中，用1M鹽酸調pH至7.4，定容至1L。
(5) 將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的1.5xCSBF溶液，並於37。C下靜置14天，每12h換一次1. 5xCSBF液。
(6) 將步驟(5)中浸泡於1.5xCSBF中的鈦片取出，用去離子水小心清洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層。
對照例
(1) 將鈦片(10x10x1腿3)依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲清洗各30min。
(2) 將清洗後的鈦片放入5mol/L的NaOH溶液中，80。C處理24h。取出鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於4(TC下乾燥。
(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以1(TC/min，升溫至60(TC，保溫熱處理lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片。
(4) 配製不含重組膠原蛋白的1.5倍的仿生液(L5xSBF)，依次稱量相應的成分，並逐一溶解在去離子水中，用1M鹽酸調pH至7.4，定容至1L。
(5) 將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的1.5xSBF溶液，並於37。C下靜置14天，每12h換一次1. 5xSBF液。(6)將步驟(5)中浸泡於1. 5xSBF中的鈦片取出，用去離子水小心清洗，
自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層。
細胞相容性實驗步驟如下
(1) 分別經過鹼熱處理(實施例l中第三步)的鈦片(PretreatedTi)、1. 5xSBF液中浸泡14天(對照例)的鈦片(SBF-14d)禾fl 1. 5xCSBF液中浸泡14天(實施例3)的鈦片(CSBF-14d)樣品用75%的酒精殺菌消毒。
(2) 將殺菌消毒過的樣品用PBS洗滌3次，再用DMEM細胞培養液(美國GIBC0公司)預洗一次，然後放入12孔細胞培養板中。
(3) 每孔滴加密度為1X10s個細胞/mL的MG-63細胞懸液300uL (中科院上海生命科學研究院細胞庫)，然後每孔分別加lmL的DMEM細胞培養液。將培養板置於37 °C、飽和溼度、體積分數5% C02培養箱內培養，次日更換培養液，以後隔天換液l次。設不加鈦片的孔做空白對照(Blank)。
(4) 將分別培養到3小時、12小時、2天和5天的鈦片樣品取出，用PBS清洗掉樣品表面的培養液和未黏附的細胞。然後用FITC標記的綠色螢光染料和DAPI染料對樣品上黏附的細胞進行雙螢光染色，並用螢光顯微鏡觀察細胞形態，並進行計數以做統計分析。
(5) 細胞分化分析將分別培養到2天和5天的鈦片上的細胞用2 %TritonX-100破膜，並經反覆凍融，裂解細胞，離心收集細胞裂解液。然後藉助試劑盒來測定細胞內鹼性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(0C)的含量。
(6) 細胞分化結果表明，在具有重組膠原蛋白-羥基磷灰石複合塗層的鈦片上生長的細胞與不含膠原蛋白的羥基磷灰石塗層的鈦片上生長的細胞相比，具有更高的鹼性磷酸酶活性和更高的骨鈣素表達水平，說明該重組膠原蛋白-羥基磷灰石複合塗層具有促進細分化的功能。
實施例結合圖1:圖1為本發明中鈦材料在1. 5xCSBF液中浸泡14天後的表面塗層形貌。鈦材料表面形成的羥基磷灰石呈現針狀整齊排列。
實施例結合圖2:圖2為本發明中對照例，即在不含重組膠原蛋白的1.5倍仿生液中浸泡14天後的表面塗層形貌。鈦材料表面形成的羥基磷灰石呈現針狀整齊排列。實施例結合圖3:圖3比較了 MG-63細胞在不同材料上培養不同時間後的密度。隨著培養時間的增加，不同材料表面的細胞數量明顯增加；CSBF-14d與PretreatedTi和SBF-14d相比，細胞數量增加明顯要快，體現了 CSBF-14d具有很好的細胞粘附增殖性能。
實施例結合圖4:圖4比較了 MG-63細胞在不同材料上培養不同時間後鹼性磷酸酶(ALP)活性。隨著培養時間的增加，不同材料的ALP活性明顯增加；CSBF-14d與Pretreated Ti和SBF-14d相比，ALP活性顯著增加，體現了CSBF-14d具有很好的促進細胞分化的性能。
實施例結合圖5:圖5比較了 MG-63細胞在不同材料上培養不同時間後骨鈣素(0C)表達水平。隨著培養時間的增加，不同材料的OC含量明顯增加；CSBF-14d與Pretreated Ti、 SBF-14d和Blank相比，0C含量顯著增加，體現了 CSBF-14d具有很好的促進細胞分化的性能。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限於以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1、一種鈦材料表面塗層的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將鈦片依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲清洗各30min；(2)將清洗後的鈦片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃處理24h；取出鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於40℃下乾燥；(3)將乾燥後的鈦片放入爐中以10℃/min，升溫至600℃，保溫熱處理1h，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片；(4)配製含有重組膠原蛋白的1.5倍的仿生液；(5)將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的1.5倍的仿生液，並於37℃下靜置2～14天，每12h換一次1.5×CSBF液；(6)將步驟(5)中浸泡於1.5×CSBF中的鈦片取出，用去離子水清洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層，該塗層為重組膠原蛋白-羥基磷灰石複合塗層。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的鈦片 為10x10x1 ,3的鈦片。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述鈦片包括純鈦金屬、鎳鈦合金、鈦鉻合金或其它鈦合金。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(4)配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液按下表1L仿生液中包含的成分，pH值為 7.4，由去離子水定容，得到1.5xCSBF溶液；成分 用量NaCl12. 0540克NaHC030. 5280克KC10. 3375克K2HP04 3H200. 3450克MgCl2 6H200. 4665克1 M HC115 mLCa€l20. 4440克Na2S040. 1080克C4HuN03 (Tris) 9. 0945克 1 M HC1 50 mL重組膠原蛋白 0.5克
5、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於用1M鹽酸調pH至7.4。
6、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於(1) 將10x10x1 mra3的鈦片依次經去離子水、無水丙酮和無水乙醇超聲 清洗各30min;(2) 將清洗後的鈦片放入5 mol/L的NaOH溶液中，80'C處理24h;取 出鈦片，用去離子水輕輕清洗，並放置烘箱中於4CTC下乾燥；(3) 將乾燥後的鈦片放入爐中以1(TC/min，升溫至600'C，保溫熱處理 lh，待爐內溫度自然冷卻到室溫之後，取出鈦片；(4) 配製含有重組膠原蛋白的1. 5倍的仿生液按下表依次稱量相應的 成分，並按表中的順序逐一溶解在去離子水中，用1M鹽酸調pH至7.4，定 容至1L，1. 5xCSBF溶液;成分用量NaCl12. 0540克Na0. 5280克KC10. 3375克K2HP04 3H200. 3450克MgCl2 6H200. 4665克1 M HC115CaCl20. 4440克Na2S040. 1080克C4HnN03 (Tris)9. 0945克1 M HC1 50重組膠原蛋白0.5克(5)將步驟(1)處理好的鈦片放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的` 1.5xCSBF溶液，並於37。C下靜置2 14天，每12h換一次1. 5xCSBF液；(6)將步驟(5)中浸泡於1.5xCSBF中的鈦片取出，用去離子水小心清 洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層，該塗層為重組膠原蛋白-羥基 磷灰石複合塗層。
7、 權利要求1至6中任一權利要求所述的方法製備的具有重組膠原蛋白 -羥基磷灰石複合塗層的鈦複合材料。
8、 權利要求7所述鈦複合材料作為骨修復或替代材料而應用於骨組織工程。
全文摘要
本發明公開了鈦材料表面塗層的方法經過鹼熱處理的鈦片冷卻，放置於12孔板中，每孔分別添加5mL的1.5倍的仿生液，並於37℃下靜置2～14天，每12h換一次1.5×CSBF液；取出鈦片後，用去離子水清洗，自然乾燥，即可得到鈦表面生物活性塗層，該塗層為重組膠原蛋白-羥基磷灰石複合塗層。本發明所形成的塗層是納米羥基磷灰石晶體與重組膠原蛋白的複合物，具有天然骨中的兩個主要的組成成分，具有促進細胞黏附、增殖和分化的功能。製備的鈦複合材料可作為骨修復或替代材料而應用於骨組織工程。
文檔編號A61L27/24GK101596329SQ20091010062
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月13日 優先權日2009年7月13日
發明者姚菊明, 潘明利, 蔡玉榮 申請人:浙江理工大學