監控生長和檢測植物中環境應力的方法

2023-05-07 08:56:51 2

專利名稱：：監控生長和檢測植物中環境應力的方法
背景技術：
：1.發明領域本發明涉及一種檢測綠色陸生植物，尤其是農業作物中，存在的環境應力(environmentalstress)的方法，以便能在應力對植物產生永久損害前，通過減輕應力，使生產最優化。2.相關技術的描述絕大多數活性生物體直接或間接地依賴於光合作用。也就是說，光合生物體通過光合作用獲取太陽能，並以有機分子的形式貯存能量，這些有機分子是那些不能進行光合作用的活性生物體的食物來源。人類文明很大程度地依賴於農業綠色陸生植物作為食物和纖維，以及許多重要的有機化學物質的來源。其它光合生物體，例如樹，提供建築材料和類似的東西。綠色陸生植物是令人驚奇的食品工廠，它僅需光、水和少量土壤礦物質，用以將大氣中的二氧化碳轉化成有機分子。儘管我們大多數人忽視植物生長最優化所必需的因素，農民們卻知道無數能夠減少或毀壞生長中的作物的事情。害蟲咀嚼植物的組織或者吮吸植物的汁液。各種病菌阻礙植物生長或殺死植物，同時關鍵土壤礦物質的缺乏會減慢或阻礙植物的生長。其它不希望有的植物(雜草)長出，與作物競爭。還可能有不充足(或過量)的土壤水分，氣溫也可能太熱或太冷，不利於生長的最優化。以上所有因素可能並確實對生長中的植物產生應力，而一些應力因素，例如蟲害的出現，比較容易檢測(通常目測)和補救(通常用殺蟲劑)。一些植物病菌更難以檢測，最佳的抑制方法是種植僅遺傳性地具有抵抗力的莊稼作物。綠色陸生植物的礦物質養分通常為人熟知，比較簡單的土壤測試便可以讓人們決定哪些土壤礦物質需要補充(以化肥的形式)以及需要補充多少。最佳的生長溫度也得到了深入的研究，但除了溫室生長的植物外，生長溫度通常超出人為控制的範圍。這使水成為植物最優化生長中唯一的最重要的可控制因素。象許多好的事物一樣，水很容易過量，當過量水阻止氧氣進入土壤中時，會對植物根部造成損害。但是，通常的問題是水量不充足。綠色陸生植物用水作為循環介質，用以將土壤礦物質從根部輸送到進行光合作用的葉子，在此處，光合作用和細胞生長的各方面均需要礦物質，以及將光合合成物(糖)從葉子輸送到植物中所有不能進行光合作用的組織。此外，草本植物的整個植物體和木本植物的葉子靠水力原理支撐，以至於如果缺水，植物就會倒塌(枯萎)。這種枯萎極大地影響了光合作用，因為起皺的葉子不能用作高效的光吸收表面。此外，通過光合作用固定在有機分子中的空氣中的二氧化碳通過被稱為氣孔的小孔進入葉子。當植物缺水時，氣孔自動關閉，以減少通過蒸發造成的水損失。這同時也限制了光合作用所需的二氧化碳的進入。參見，例如「響應空氣中和土壤中的乾旱，二氧化碳和水蒸氣的交換」植物生理學年鑑修訂本(Ann.Rev.PlantpHysio1.)37247-74(1986)；和「在乾旱應力下玉米雜交種中碳水化合物、氮和乾物質的累積和分解」，植物學年鑑(AnnalsofBotany)66407-15(1990)。那麼真正的問題是如何決定什麼時候提供足夠的水以避免應力，並使植物生長最快而不浪費經常缺乏的水資源。此外，許多地區的水源含鹽，例如氯化納，它們累積在土壤中，最終造成對植物的損害。很明顯，人們不希望使用超過最佳量的水，因為過量應用只會提高土壤中鹽的累積量。稱重一份土壤樣品並計算其中含有多少水是比較簡單的。但不同類型的土壤對水有不同的親和力，植物根部滲透深度不同，這取決於土壤結構和植物種類。因此，表層土壤樣品中水分的測定對預測正在生長的植物中誘發乾旱的應力存在還是不存在，幾乎沒什麼用。也有可能測定被稱為植物中的水潛勢的因素。水潛勢給出了水從土壤進入植物的趨勢的一個測定值，但此因素也很難與植物應力相關聯。最後，已經有大量嘗試，通過測定植物的葉子溫度和/或通過對空氣溫度和葉子溫度作比較，來定量測定植物的水應力。原則上，暴露於太陽光下的植物葉子吸收大量太陽能，只有其中一部分通過光合作用被獲取；剩餘的能量以熱的形式出現，趨向於提高葉子的溫度。同時，葉子通過氣孔損失大量水份；引起的蒸發性冷卻會緩和光吸收作用引起的溫升。這樣，所有其它事情是同等的，高葉子溫度反映水的低供應率(也就是乾旱應力)。當然，許多其它因素，例如周圍空氣的相對溼度也必須考慮。舉一個實例證明用葉子溫度預測乾旱應力，參見美國專利4,998,826，Wood等人，它描述了為農業應用設計的一種紅外溫度計。該專利講授葉子溫度有一個狹小的區域可導致植物生長最優。此專利還指出當葉子溫度升至最佳溫度區域以上時，應該將水供給田地。但是，眾所周知，葉子溫度也受周圍空氣的相對溼度和許多其它因素的影響。此外，通常很難提前預測什麼是最佳葉子溫度。也就是說，即使溫度測定值用所有其它因素校正過，也很難知道給出的溫度是否最佳，直到在作物損害發生後才知道。美國專利4,755,942和4,876,647，Gardner等人，通過同時測定許多不同因素，包括作物蓋(葉片)溫度和空氣溫度及相對溼度，試圖提高測定作物中水應力的預測精度。一臺運行專門設計的程序的微機分析各種因素，並在預先記錄的數據基礎上進行應力預測，這些數據是關於手頭現有的特定作物的應力因素的。主要的問題又是預測組合因素中的哪些值真正代表某一特殊種類或多種植物的乾旱應力是極其困難的。不知道哪些值真正代表應力，綜合的多因素測定實際上也就毫無意義。發明綜述本發明的目的是提供一種通過分析植物細胞壁的葡糖共軛體(glycoconjugate)和寡糖前體而檢測植物中的環境應力的方法。這些和其它目的可通過一種檢測植物中的環境應力，尤其是棉花作物中的水應力的方法而實現。此方法以植物組織，例如棉花纖維的溫和的冷水提取為基礎。提取物用高pH陰離子交換色譜法分析，以分離和鑑定被冷水提取出來的糖類、寡糖和其它葡糖共軛體。提取出來的碳水化合物代表了一種獨物的檢測環境應力的靈敏手段。受環境應力的植物顯示提取出的碳水化合物有定性或定量的變化。提取出的碳水化合物的變化可用於表明什麼時候需要額外的灌溉或對生長條件作其它修正。附圖的簡要描述本發明被認為是新穎的的目的和特徵，在附加的權利要求中被特別提出。本發明的構思和實施方式，以及其它的目的和優點，通過參見以下描述，並結合附圖可以很好地理解。圖1顯示了從棉花品種DPL5415的開花後21天的棉鈴中取出的棉纖維的冷水提取物樣品的理想的HPAEC圖；圖2顯示了開花後21天DPL5415纖維的實際色譜圖；圖3顯示了開花後28天DPL5415纖維的實際色譜圖；圖4顯示了開花後42天DPL5415纖維的實際色譜圖；圖5顯示了開花後56天DPL5415纖維的實際色譜圖；圖6顯示了從在最佳條件下和在乾旱條件下生長棉花品種Maxxa的成熟棉鈴中提取出來的碳水化合物的差值圖；圖7顯示了圖2～5的DPL5415樣品，顯示在圖6中標識出的應力響應峰，以對數形式作圖；圖8顯示了在次優的溫度條件下生長的棉花品種PimaS-6的樣品，顯示應力響應峰，以對數形式作圖；圖9顯示了在次優的溫度條件下生長的棉花品種DES119的樣品，顯示應力響應峰，以對數形式作圖；圖10顯示了從在正常灌溉下生長的棉花品種Maxxa的開花後八天的纖維中提取出來的碳水化合物的色譜圖；圖11顯示了從在水應力條件下生長的棉花品種Maxxa開花後八天的纖維中提取出來的碳水化合物的色譜圖；圖12顯示了來自絲蘭的組織並按照本發明提取和分析的碳水化合物的色譜圖，表明被認為是本發明一部分的碳水化合物存在於品種繁多的植物中。優選實施方案的詳細描述提供以下描述，以便使任何本領域技術人員能夠應用本發明並提出發明者仔細考慮的實施其發明的最佳方式。但是各種修正，對那些本領域技術人員來說，將是很明顯的，因為本發明的基本原理已在此處特別定義，以提供一種具有再現性的方法，它使得分析植物組織的樣品以確定被取樣的植物是否在承受應力成為可能。申請人通過考慮環境對植物體部分的碳水化合物的含量的影響來探討綠色陸生植物中的環境應力問題。正如上面所述，應力會對光合作用有直接影響，因此，應力將引起由光合作用直接生成的各種植物的碳水化合物的變化。此外，因為綠色陸生植物的機體主要由碳水化合物骨架和其它光合作用的有機產物組成(也就是說，木材主要是纖維素結合一種被稱為木質素的有機多酚)，所以植物體的分析將會提供由應力，例如乾旱，誘發植物中碳水化合物變化的一個很好的記錄。環繞植物細胞並形成植物體基礎的纖維素細胞壁的精確結構和組成尚未完全確定。儘管細胞壁的許多化學特徵已經描述過，細胞壁合成的確切方式仍在一定程度上是個謎。如果有人正在尋找植物細胞壁的變化，那他必須首先確定一個正常的細胞壁看起來象什麼。一篇由Gibeaut和Carpita撰寫的綜述「植物細胞聚糖的生物合成」(美國實驗生物學學會聯合會期刊FASEBJournal，8904-15(1994))給出了當前對細胞壁合成的理解的一個很好的描述。對植物細胞壁的研究剛剛開始證實環境應力，例如水應力可能影響植物細胞壁的結構和/或組成這一觀念。參見「乾旱應力誘發麥杆的非結構型碳水化合物組成的變化」，澳大利亞植物生理學期刊Aust.J.Plant.pHysiol.18239-47(1991)；「受重複乾旱應力的白色雲杉(Piceaglauca)針葉中細胞壁的變化」植物生理學pHysiologiaPlantarum82513-18(1991)；「豆(pHaseolusvulgarisL.)幼苗中缺水誘發的細胞壁蛋白質」植物生理學PlantpHysiol1071119-28(1995)。棉花可能是織物生產所需要的世界最重要的纖維作物。棉纖維實際上是在種子莢(棉鈴)中附著棉花作物的正在發育的種子上生長的一種極長(達4釐米)的單細胞植物毛狀體或毛。纖維以兩種形式存在細毛，比較短，它堅固地附著在棉花種子上；和棉絨，它是長纖維，很容易從棉籽中分離出來。直至棉花開花後纖維才開始發育。很明顯，纖維生長響應於由正在發育的種子中的胚胎產生的激素。纖維在開花後伸長至少三周或四周，主要生成所謂的初級細胞壁。在纖維伸長以後的幾個星期中，其它的纖維素細胞壁物質沉積，形成二級細胞壁，它強化了幾乎成熟的纖維。在二級細胞壁的沉積後，纖維細胞在開花後約八星期(56天)時死去，留下其纖維質外骨架成為常見的貿易棉纖維。棉花是極有價值的作物，因為它產生棉籽，是油、動物食物的來源之一和棉纖維。本發明最初是在試圖鑑別出那些影響整個纖維質量的棉纖維細胞壁組分時產生的。眾所周知，生長條件的變化可能嚴重影響棉花作物的產量和質量。實際上，一些高質量的棉花一定程度地局限於在加利佛裡亞、西南部和世界上類似氣候的地區生產。大概在那些地區，光照或其它生長因素特別有利。這意味著最好的棉花通常生長在缺水普遍的地區。在夏季類似加利佛裡亞的乾旱氣候，棉花在生長季節裡通常灌溉大約三次。灌溉包括淹沒田地，以致大量水在灌溉過程中被消耗掉。有大量證據表明太多或太少的水對棉花生產都有不利影響。了解何時植物開始顯示水應力徵兆以便下一次灌溉能在最佳時間進行將是極其有意義的。大多數棉纖維細胞壁由以次晶微纖維形式排列的聚糖纖維素組成，正如在大多數植物細胞壁中一樣，同時也有少量其它聚糖，它們組成用以定位並將纖維素微纖維固定在其位置上的連結物質和/或微纖維和連結物質的前體。儘管我們現在知道細胞壁的各種聚糖中有許多是化學互聯的，傳統地，細胞壁物質是由將它們從細胞壁中提取出來所要求的條件來鑑定的。通常，提取方法導致細胞壁物質中至少一有些共價鍵水解。因此，各種衍生的成分一定程度地代表了一個複雜細胞壁結構的比較簡單的離解產物。螯合劑或熱的稀酸提取出各種含有被稱為果膠物質的聚合物的半乳糖醛酸。其它的被稱為半纖維素的非纖維質聚糖可被強鹼提取出來，而真正的纖維素即使在強鹼中也不溶解。目前，大大改進的高壓液相色譜法(HPLC)技術允許分離各種細胞壁組分成聚糖成分，聚糖能被進一步水解以鑑定出組分單糖。高pH陰離子交換色譜法(HPAEC)的應用使細胞壁組分的鑑別清楚化成為可能。在HPAEC方法中，一種鹽梯度(例如醋酸鈉梯度)用於保持在高pH值下的特殊的離子交換樹脂柱中，用以順續地洗脫出各種單糖和聚糖。實質上，糖的羥基是極弱的酸，在高pH下脫去質子，鍵合在離子交換基質上，直至被梯度洗脫出來。儘管有大量HPAEC材料的賣主，本發明應用由加利佛裡亞，Sunnyvale的Dionex公司生產的產品和系統。這些產品和系統在Dionex技術記要中，尤其在技術記要20和21中(此處引入本申請)得到了詳盡的解釋。從植物細胞壁中分離出來的碳水化合物組分用DionexCarboPacPA1和PA-100柱分析。兩種柱都含有帶季胺官能團的聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯膠乳微珠(Latexmicrobead)(350納米直徑)。柱在生產商推薦的壓力條件下(4000psi最大)，在氫氧化鈉中用醋酸鈉洗脫梯度操作。糖醇用CarboPacMA1柱進行分析，柱中含有帶烷基季銨官能團的乙烯基氯苯/二乙烯基苯的多孔珠(8.5微米直徑)。這些柱也在生產商推薦的條件下(2000psi最大)，在氫氧化鈉中用氫氧化鈉洗脫梯度操作。用於分離大多數複雜的碳水化合物(聚糖和葡糖共軛體)的條件列於表1。用於分離糖醇和丙三醇的條件列於表2。大多數單糖的測定條件列於表3，而甘露糖和木糖的測定條件列於表4。表1聚糖(葡糖共軛體)的測定表2糖醇(醛醇，環己六醇)和丙三醇的測定表3單糖的測定表4甘露糖和木糖的測定以下呈現的結果應用了一種脈衝式電流測定(PAD)系統。本發明包含了鑑別某些葡糖共軛體存在和/或不存在及出現或消失的時間的實用性。必須認識到，檢測這些碳水化合物的確切方法不是本發明的中心。任何其它能夠分辨洗脫出來的碳水化合物的合適的檢測系統都可以應用。但是，PAD系統的簡略說明是必要的。PAD通過碳水化合物羥基在金電極表面的電化學氧化作用來檢測碳水化合物。有效的氧化電勢施用於在高pH下，與碳水化合物溶液接觸的金電極上，氧化羥基，產生的電流是碳水化合物濃度降至約10微微摩爾範圍的靈敏和準確的體現。PAD方法僅在那些能夠在某一特定的電極電勢下被氧化的某些化合物中具有選擇性。但是，碳水化合物氧化產物會迅速汙染電極表面。這個問題已經通過短暫地將電極電勢升至一個較高的正值，以氧化金電極表面並驅走被氧化的碳水化合物而得到解決。氧化步驟之後，降低電極電勢，以再生金電極表面；最後，電極恢復到測定電勢。這種脈衝循環一次又一次地重複。HPAEC用於分析各種提取出的棉花細胞壁餾分，試圖將棉花樣品在物理性質上的變化與提取出的細胞壁餾分在化學組成上可能的變化關聯起來。HPAEC提供了最可行的同時分析單糖和聚糖的方法。最初，熱水提取物由細胞壁物質組成。意外地有大量單糖被HPAEC色譜法顯示出來，表明熱水正在打斷共價鍵。進一步的研究是由越來越冷的水提取方法組成的。在此研究期間，發現棉纖維的冷水提取物中單糖和多糖意外地豐富。傳統上認為熱水提取法至少被要求用來將有意義的物質從細胞壁中釋放出來。被冷水提取出來的聚糖顯示出不同的複雜性。通常較小的聚糖稱作「寡糖」，儘管沒有確切的劃分界線將寡糖從聚糖中區分開來。此外，這些分析表明一些提取出的物質含有蛋白質成分。其它還可能含有類脂物成分。普遍因素是寡糖或聚糖的出現，表明化合物能被HPAEC分離。在以下的描述中，「葡糖共軛體」或「寡糖」被用來描述這些可能還含有蛋白質和/或類脂物的不同的碳水化合物。分析在各種條件下生長的植物的已知生長階段的棉纖維樣品。在這些實驗中，遵循的總體實驗草案是開花時標記棉花作物的每朵花。通過這種方法，在開花後一個已知的時間便可收穫棉鈴。收穫時間通常是開花後2，3，4和5+星期以與上面列出的棉纖維發育時間相一致。一旦從棉花作物收穫了棉鈴，就必須採取措施，以防止微生物損害或自體分解，並保護棉纖維使其細胞壁組分不被過早提取。優選的方法是收穫後儘快冷凍棉鈴。棉鈴可被迅速放在冷凍機裡，優選放在一個在-20℃或更低的溫度下工作的低溫單元中。或者，將乾冰或液氮帶到田間，棉鈴一收穫便被立即冷凍。目前，放在泡沫聚苯乙烯或類似的絕熱的冷藏箱裡的乾冰是優選的收穫後冷凍的方法。乾冰很容易購買和運到棉花地。大量棉鈴可以很方便地收穫並立即以這種方式冷卻。分析前棉鈴必須冷凍乾燥以去除自由水分。凍幹的棉鈴可輕易打開，不合種子的纖維樣品、果皮(棉鈴)和棉絨可被輕易分開。纖維在提取前可能進行進一步的處理，例如壓成樣品小丸。確切的預處理看來似乎並不重要，只要來自棉鈴或其它來源的物質不被汙染。然後每個纖維樣品用冷水提取。典型地，3～5毫克纖維用0.5毫升水在一個帶蓋的小瓶中，在冰浴狀態的0℃下進行提取。為確保提取完全，小瓶用一設定在80瓦的Bransonic超聲波聲處理器進行15分鐘聲處理。圖1顯示了從棉花品種DPL5415的開花後21天的棉鈴中取出的棉纖維的冷水提取物樣品的理想的HPAEC圖。該樣品來自在美國東南部在最佳條件下生長的植株，應該是那個地區一般植株的代表。這是這種方法的典型圖，顯示PAD系統(y軸)對在色譜柱中的保留時間(x軸)的反應。PAD方法是定量的，這樣峰下面的面積正比於含有該峰的碳水化合物的數量。在冷水提取物中感興趣的寡糖(葡糖共軛體)在典型的分析條件下，通常在柱中停留不到40分鐘的時間。單糖通常在3～6分鐘之間出峰。蔗糖峰12在約10分鐘時從柱中出現。單糖和二糖，如蔗糖，趨向於比作為本發明主題的葡糖共軛體更快速地通過柱。跟隨蔗糖峰12的是第一組葡糖共軛體峰14。這些峰14表示成葡糖共軛體1(GC1)，並且典型地顯示保留時間為從約14到17分鐘，最大的峰(GC1-2)16通常在14～15分鐘之間出現。大量細胞壁提取物的分析表明這些重要的峰連續出現。應該認識到，實驗條件的變化可能引起精確的保留時間不斷變化。但保留時間可以按已知的標準和鑑別出的峰，例如蔗糖峰，進行標準化。此外，峰在它們從柱中出現後可以並且被收集，以進行進一步的分析，以清楚鑑別每個峰。GC114在小「峽谷」17的一側形成一個約有4～8個峰的「山脈」，第二組被稱為葡糖共軛體2(GC2)的峰18在峽谷17的另一側形成一個山脈。GC218的保留時間通常從約18到約21分鐘，最高峰(GC2-2，GC2-3)在大約19～20分鐘。峰用它們在每組中的位置命名，GC1中的最高峰16稱為GC1-2，GC2中的最高峰20稱為GC2-3。如在理想圖1中所示，其它峰以類似方法命名、儘管在冷水提取物的分析中看到的碳水化合物峰的確切起源尚未知道，但很可能它們代表了用於合成棉纖維細胞壁的網狀碳水化合物複合物。蔗糖是植物的一種重要的傳輸用的碳水化合物，是從源頭(葉子)傳輸到匯點(正在生長的棉纖維)的主要光合合成物。含有兩組峰的葡糖共軛體峰能很好地代表聚糖載體複合物，它們被裝配成適合傳輸至正在生長的纖維細胞壁的亞結構。各種餾分的單糖分析表明GC1和GC2餾分富含丙三醇和環己六醇，暗示了載體結構，在此結構中，糖(主要是葡萄糖和甘露糖)可能是通過羥基連結在這些化合物上。用於檢測葡糖共軛體的同樣的色譜分析通過檢測在280納米處的吸光度，能夠並且已經用於檢測蛋白質部分的出現。本研究已表明一些懷疑的環己六醇/丙三醇載體，正如對生物載體所預期的那樣，也含有蛋白質組分。有可能但不是很可能，寡糖能代表用提取方法分離的細胞壁片。首先，冷水提取法不太可能打斷共價鍵或斷開將細胞壁固定在一起的其它相互作用力。其次，每個葡糖共軛體峰的出現相當連續，並且在不同的生長階段在數量上有變化。這更可能是細胞壁前體，例如預聚合的糖組件，而不是從已經裝配的細胞壁上分離出來的細胞壁區。圖2顯示了開花後21天DPL5415纖維(DPA)的實際色譜圖。這是典型的「原始」色譜圖，圖1從它演變而來。圖3顯示了正常生長的DPL5415纖維開花後28天的分析情況。與圖2相比較，有更少的總聚糖被提取出來。非常有可能，至少一定程度地，這是用提取出來的纖維的重量進行樣品標準化的人工產物。在21天和28天之間，細胞壁的總質量顯著增長，但如果實際的細胞壁合成複合物在數量上基本保持穩定，那麼當以細胞壁總質量為基礎計時，它們將呈現出減少。該結果傾向於支持萃取的的假說。在圖3中，GC1-2峰16現在是GC1中甚至更主要的部分。也就是說，GC1的其它峰的豐度相對GC1-2峰16大大減小。GC2-3峰20相對於GC2-2峰22增大。這些變化在圖4中繼續，圖4代表了來自正常生長的DPL5415開花後42天(42DPA)的纖維。到此時為止，棉纖維接近成熟，只有二級細胞壁合成發生。當提取出來的聚糖總量與圖3相比為減少時(與細胞壁質量增長相一致)，蔗糖峰12仍相當大，表明植物仍在傳輸大量光合合成物到正在成熟的棉鈴中。GC2-3峰20相對於GC2-2峰22減小。最後，圖5顯示了從完全成熟的DPL5415棉鈴在開花後56天(56DPA)的纖維中提取出來的聚糖。在此時，棉鈴實質上已經死亡，光合合成物不再被傳輸至棉鈴中。所有細胞活動應該已經中止，這樣，任何被冷水提取出來的碳水化合物可能代表了在細胞死亡前未結合在細胞壁裡的剩餘的合成化合物或者代表了用提取方法分離出來的以共價鍵連接的碳水化合物的背景水平。與該圖相一致的是蔗糖峰12的高度非常低。GC114相對圖4減小，而GC218仍保持低。在解釋前述結論時，應該牢記的一個因素是上面提及的細胞壁質量問題，兩組葡糖共軛體峰看來似乎都與初級細胞壁的合成有關。當纖維接近成熟時，細胞壁物質的大部分此時代表二級細胞壁。如果兩組峰中的一組或兩組被單獨從初級細胞壁或初級細胞壁前體中提取出來，它們的表觀數量應大大減少，因為3～5毫克提取的細胞壁中只有很小一部分是初級細胞壁。與該圖相一致的是聚糖GC114代表初級和二級細胞壁合成的前體和聚糖GC218代表主要用於初級細胞壁合成的組分(可能由GC114衍生而來)。在兩周和三周之間，初級細胞壁合成到達頂峰，大約四周後，二級細胞壁合成基本上佔主導地位。因此，在正常生長條件下，GC2-3峰20大約在二級細胞壁沉積開始佔主導地位時到達其最大值。因為GC1-2峰16可能代表用於初級和二級細胞壁這兩個合成的物質，所以即使大多數初級細胞壁合成停止後，峰仍保持優勢。將在正常條件下和在極度水應力下生長的棉花的各種圖進行比較，以鑑別哪些葡糖共軛體在這些條件下改變。當來自正常灌溉的棉花品種Maxxa的成熟棉鈴與那些在乾旱應力條件下生長的棉鈴進行比較時，以下峰非常強烈地受應力影響GC1-2，GC1-3到GC1-5(很難分辨)，GC1-6，GC2-2，GC2-3和GC2-5。圖6顯示了差值圖(從正常灌溉的結果減去乾旱應力的結果)，在該圖中，上面提到的那些峰的差值很明顯。負的峰值表示在乾旱應力下的棉花比正常條件下的棉花的多出該峰。正如前面提到的，PAD檢測系統的優點之一是對於任何特定的聚糖，峰下面的面積正比於出現的聚糖數量。因為不同的糖可能產生不同的PAD檢測器響應，所以在兩種不同的聚糖之間進行定量的比較是不可能的。此外，在不同生長階段提取出的聚糖在數量上的巨大變化也難以在同一張圖上表示出來。這個問題可通過將總結果以對數形式作圖而一定程度地避免。通過這種方式，所有結果可輕易地放在一張圖上。但是，人們必須記住大變化以更高的對數周期被最小化。圖2～5中所示的DPL5415樣品在圖7中以對數形式作圖。只有被發現對生長條件有強烈反應的峰被顯示出來。代表GC1-2的軌跡42顯示出比較一致的高度，向56DPA點處稍微升高。代表GC1-3至1-5的軌跡43緊緊地跟蹤GC1-2。代表GC1-6的軌跡44在28天時顯著下降，隨後逐漸恢復。另一方面，代表峰GC2-2的軌跡46在21天和56天間顯示出一個比較恆定的下降率。該圖也顯示了代表GC2-3的軌跡48在28DPA處到達峰。這是與GC1-6相反的行為，而代表GC2-5的軌跡50下降得略微更迅速一點。圖7的結果應與圖8進行比較，圖8代表另一棉花品種PimaS-6的類似圖。該品種在略微次佳的溫度條件下生長。此處代表GC1-2的軌跡42顯示出總體下降率略大些。代表GC1-3到1-5的軌跡43非常緊密地跟蹤軌跡42(GC1-2)，正如圖6中所示。代表GC1-6的軌跡44類似於圖7，但大約在42天顯得稍微有點下降。代表GC2-2的軌跡46在大約42天顯示增大，而代表GC2-3的軌跡48比較類似於圖7。最後，與圖7相比較，代表GC2-5的軌跡50在56天稍微有點升高。這些數據表明這樣葡糖共軛體的峰圖是生長條件的靈敏顯示器。寡糖/葡糖共軛體峰的變化在圖9中甚至更顯著，圖9顯示了在次佳的寒冷晨溫下生長的處於生長季節早期的棉花品種DES119。通常，棉花需要高生長溫度，尤其是溫暖的晚間溫度。在圖9中，代表GC1-2的軌跡42在較早的時間點上顯著下降，在較晚的時間點上增大。代表GC1-6的軌跡44在28天時沒有出現通常的谷值。代表GC1-3到1-5的軌跡43不象圖7中那樣跟蹤GC1-2。代表GC2-2的軌跡46與圖7相比略微下降。代表GC2-3的軌跡48略微升高，而代表GC2-5的軌跡50顯示升高，尤其在21天和35天之間。當各種餾分的確切行為可能隨棉花品種略微變化時，很明確的是生長條件的變化會導致具有重複性的變化。在最佳生長條件下，GC1峰在較早的時間點上會比較高，並且，除了在28天時GC1-6有一個急劇下降外，生長周期的剩餘時間均保持相當恆定。這與GC1物質是初級和二級細胞壁合成兩者的正常前體，因而在正常條件下保持恆定的理論是相一致的。但是，當條件被稍微幹擾時，GC1中有一部分可能實際上從一個較低的水平開始，貫穿生長周期一直增大。GC1-6在28天時通常出現的谷值可能代表一些其它過程，例如二級細胞壁的生長的開始，它短暫地耗盡該前體。另一方面，GC2物質看來似乎更緊密地與初級細胞壁的生長相聯繫，當棉花接近成熟時下降。在受幹擾的生長條件下，GC2物質可能在比28DPA晚一些的某個時間真正達到峰值，然後下降。總之，重要因素似乎是GC1相對GC2的相對豐度，以及是否GC1組分比較恆定(正常)而GC2組分自始至終慢慢下降(正常)，或者是否GC1和GC2中的一個或兩者自始至終顯示升高(不正常)。看來棉纖維正常的生長對任何缺水都極其敏感。圖10和11顯示了來自棉花品種Maxxa在開花後8-10天(8-10DPA)的非常年輕的棉鈴的碳水化合物。兩張圖中的棉花在六月中旬都得到了正常的灌溉。下一次安排好的灌溉是在七月二十一日，樣品在七月二十五日收集，即在灌溉後僅四天。圖10中的棉花在七月二十一日得到了灌溉，而圖11中的棉花則沒有得到灌溉。正如在很早期的樣品(最大的初級細胞壁合成)中可能預計的，GC2-2和GC2-3在圖10中顯得非常突出。但四天灌溉的差別引起圖11中的棉花顯示出兩個通常不重要的峰GC2-7.2和GC2-7.3有驚人的升高。看來似乎由乾旱引起的植物新陳代謝的幹擾已經導致正常情況下不重要的葡糖共軛體的累積。大概這些化合物存在於一個周轉迅速的動態代謝庫中，可能是通過永久地插入細胞壁中而存在。水應力幹擾這個過程。這可能歸因於對光合作用的影響(也就是，碳水化合物的來源的變化)或者對因缺少脹大壓力而引起的細胞拉長(也就是，GC2寡糖的最終匯點的變化)的影響。至今還不知道圖10中的棉花是否還顯示在灌溉前乾旱應力的寡糖特性，然後在灌溉後的四天內恢復，或者在圖11中所看到的不正常是否會直到七月二十一日，即灌溉的日期之後才出現。任何一種情況，很明顯，在非常年輕的棉鈴中，GC2-7.2和GC2-7.3的測定是水應力的靈敏顯示器。應用本發明，有可能測定棉花作物的反應，以便使灌溉可以細調，以產生最佳的棉花生長，而不是僅僅按照日曆來進行灌溉。另一種觀察總結果的方法是考慮如果二級細胞壁沉積受幹擾，譬如說由於不利的生長條件，初級細胞壁在成熟纖維中的比例可能實際增大，導致GC2峰18佔主導地位。總之，本發明提供了檢測環境應力，例如水應力的靈敏方法。其它應力類型，例如光缺少或過多，礦物質養分缺少或生長溫度不恰當，預計會產生類似或相關的結果。實際上，圖8和9表明不利的生長條件，例如低晨溫確實顯示出類似結果。導致本發明的實驗應用了已知年齡的棉纖維的分析。在本發明的實際田間實踐中，比較簡單的是在花開放的日子給花作標記，以便以後可以收集已知年齡的棉鈴。或者，可以通過同時從一植株上收穫一系列棉鈴，從而收集棉鈴年齡的可比的資料。棉花作物是不確定的，當植物生長時，在越來越高的分枝上開出一系列花。因此，在任何時候，棉鈴在植物上的位置是棉鈴年齡的標誌。此外，這樣一系列的收集在一定程度上產生一個歷史記錄或在極近的過去的應力條件。也就是，一些棉鈴主要在植物經歷乾旱時生長，這一事實在從那些棉鈴中提取出來的葡糖共軛體/寡糖中將被反映出來。其它棉鈴可能主要在乾旱期之前或之後生長，因此將給出不同的葡糖共軛體結果。儘管色譜法在目前是檢測葡糖共軛體/寡糖的變化的優選方法，其它更簡單的系統正在發展。例如，可以生產單克隆的抗體，用以鑑別特定的寡糖。因此，可以發展簡單的以抗體為基礎的比色試驗，來鑑別GC2-7.3或一些類似的對應力響應的寡糖的升高。這允許農民在田間測試。因為事實上所有開花植物都有相似的細胞壁組分，預計本發明實際上可直接應用於任何植物，以檢測環境應力的存在。當然，有必要試驗各種各樣的在不同生長條件下生長的植物樣品，以便為要監測的植物種類建立一個標準圖。但是，很可能很相近的植物種類將是非常相似的。也很可能在棉花中建立的總圖中至少有一些可以直接應用於其它植物。圖12顯示了從絲蘭的細胞壁中提取出來的葡糖共軛體/寡糖的色譜圖。大量峰看上去與棉花的那些峰相似。那些本領域技術人員將認識到，可以對剛才描述的優選的實施方案進行修正和改進，而不脫離本發明的範圍和精神。因此，可以理解成除了此處特別描述的以外，本發明可以在附加的權利要求的範圍內實踐。權利要求1.一種測定環境應力在植物中的存在的方法，以便能夠在植物生長受永久影響前減輕應力，該方法包括以下步驟按預定的時間間隔收穫一系列植物組織樣品；保存植物組織樣品用於分析；在預定體積的水中提取預定重量的被保存樣品；分析從樣品中提取出來的物質，以檢測存在的碳水化合物的特性和數量；及以被檢測的碳水化合物的特性和數量為基礎測定應力。2.權利要求1的方法，其中提取出來的物質用帶季胺官能團的聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯膠乳微珠的柱進行分析。3.權利要求1的方法，其中應力的測定是將首先從柱中洗脫的第一組碳水化合物的峰與比第一組後洗脫的第二組碳水化合物的峰作比較。4.權利要求2的方法，其中應力的測定是將首先從柱中洗脫的第一組碳水化合物的峰與比第一組後洗脫的第二組碳水化合物的峰作比較。5.權利要求2的方法，其中柱用醋酸鈉梯度在氫氧化鈉中洗脫。6.權利要求4的方法，其中第一組在約14和約17分鐘之間洗脫，第二組在約18和約35分鐘之間洗脫。7.一種測定環境應力在棉花作物中的存在的方法，以便能在棉纖維的產量和質量受影響前減輕應力，該方法包括以下步驟提供在最佳條件下生長的第一個棉花作物群和在應力條件下生長的第二個棉花作物群；按預定的時間間隔，從第一群和第二群中收穫一系列棉鈴，時間間隔從每一種棉鈴開花之日開始計；保存收穫的棉鈴用於分析；從保存的棉鈴中取出棉纖維；在預定體積的水中提取出預定重量的被取出的棉纖維；分析從取出的纖維中提取出來的物質，以檢測存在的葡糖共軛體的特性和數量；根據從第一群作物的纖維中提取出來的物質的分析和從第二群作物的纖維中提取出來的物質的分析，以時間為橫坐標作圖，從而測定正常生長的作物的葡糖共軛體分布圖和在應力下生長的作物的應力葡糖共軛體分布圖；對來自未知生長條件的第三群作物收穫、保存、提取、分析和作葡糖共軛體分布圖；及確定第三張分布圖更近似第一群作物的分布圖還是第二群作物的分布圖，從而確定第三群作物是否在經受應力。8.權利要求7的方法，其中提取出的物質用帶季胺官能團的聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯膠乳微珠的交換柱進行分析。9.權利要求7的方法，其中應力的測定包括將首先從柱中洗脫的第一組葡糖共軛體的峰與比第一組後洗脫的第二組葡糖共軛體的峰進行比較。10.權利要求8的方法，其中應力的測定包括將首先從柱中洗脫的第一組葡糖共軛體的峰與比第一組後洗脫的第二組葡糖共軛體的峰進行比較。11.權利要求8的方法，其中柱用醋酸鈉梯度在氫氧化鈉中的洗脫。12.權利要求10的方法，其中第一組在約14和約17分鐘之間洗脫，第二組在約18和約35分鐘之間洗脫。13.一種測定水應力在棉花作物中的存在的方法，以便能在棉纖維的產量和質量受影響前減輕水應力，該方法包括以下步驟提供在最佳條件下生長的第一個棉花作物群和在水應力條件下生長的第二個棉花作物群；按預定的從開花之日開始計的時間間隔，從第一群作物和第二群作物中收穫一系列棉鈴；用冷凍和凍幹的方法保存收穫的棉鈴，用作分析；從凍幹的棉鈴中取出棉纖維；在預定體積的處於冰點溫度下的水中提取出預定重量的取出的纖維；用高pH陰離子交換色譜法分析從取出的纖維中提取出的物質，以檢測存在的葡糖共軛體的特性和數量；根據從第一群作物的纖維中提取出來的物質的分析和從第二群作物的纖維中提取出來的物質的分析，以時間為橫坐標作圖，從而測定正常條件下的葡糖共軛體分布圖和水應力下的葡糖共軛體分布圖；對來自未知生長條件的第三群作物進行收穫、保存、提取、分析和作葡糖共軛體分布圖；確定第三張分布圖更近似第一群作物的分布圖還是第二群作物的分布圖，從而確定第三群作物是否在經受水應力。14.權利要求13的方法，其中提取出的物質用帶季胺官能團的聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯膠乳微珠的交換柱進行分析。15.權利要求13的方法，其中應力的測定包括將首先從柱中洗脫的第一組葡糖共軛體的峰與比第一組後洗脫的第二組葡糖共軛體的峰進行比較。16.權利要求14的方法，其中應力的測定包括將首先從柱中洗脫的第一組葡糖共軛體的峰與比第一組後洗脫的第二組葡糖共軛體的峰進行比較。17.權利要求13的方法，其中柱用醋酸鈉梯度在氫氧化鈉中洗脫。18.權利要求16的方法，其中第一組在約14和約17分鐘之間洗脫，第二組在約18和約35分鐘之間洗脫。19.一種測定水應力在棉花作物中的存在的方法，以便能在棉纖維的產量和質量受影響前減輕應力，該方法包括以下步驟在預定體積的處於冰點溫度下的水中，從已知年齡的棉鈴中提取預定重量的棉纖維；用高pH陰離子交換色譜法分析從棉纖維中提取出的物質，以檢測存在的葡糖共軛體的特性和數量；鑑別先洗脫的第一組葡糖共軛體的峰和後洗脫的第二組葡糖共軛體的峰；將第一組和第二組的相對豐度與已經從已知年齡的對照棉鈴的纖維中測定出來的預期值比較，從而確定棉花作物是否在經受應力。全文摘要一種測定植物中環境應力,尤其是棉花作物中水應力的方法,該方法基於冷水提取植物組織如棉纖維。通過高pH陰離子交換色譜法分析提取物,以分離和鑑別由冷水提取的糖類、寡糖類和其它葡糖共軛體。提取的碳水化合物代表了一種用於檢測環境應力的獨特的靈敏的手段。受環境應力的植物會顯示提取碳水化合物的質和量的變化。提取的碳水化合物的變化可以用於指示什麼時候需要進行灌溉或對生長條件的其它調整。文檔編號A01G25/16GK1197370SQ96197123公開日1998年10月28日申請日期1996年8月14日優先權日1995年8月18日發明者A·K·穆雷申請人:格利科齊梅公司