一種黃麴黴毒素b的製作方法

2023-05-07 18:47:41 1

專利名稱：一種黃麴黴毒素b的製作方法
技術領域：
一種黃麴黴毒素B1金標檢測試紙盒及其製備方法，屬於生物工程產品技術領域。
背景技術：
黃麴黴毒素(Aflatoxin)是常見黴菌——黃麴黴(Aspergillus flavus)和寄生麴黴(A.parasiticus)中產毒菌株的代謝產物。黃麴黴在自然界的存在較寄生麴黴普遍，很容易汙染食品，又能在受侵染的糧食和油料作物(尤其是玉米和花生)上生長繁殖產生毒素。1960年，英國曾發生了約十萬隻火雞幼仔短短幾個月內相繼死亡的嚴重事故，後來查明是由於火雞吃了含有黴變花生餅的飼料引起的，並從黴變的花生餅中分離出黃麴黴產毒菌株。1961年已證實餵飼了含有黃麴黴毒素的花生餅可使大鼠發生原發性肝癌。大多數產毒黃典黴菌產生黃麴黴毒素B1的量比其它黃麴黴毒素多，而且黃麴黴毒素B1的毒性又最大。黃麴黴毒素B1除主要可引發肝癌外，由於毒素侵入試驗動物的途徑不同，也可引起其它部位如腎、胃、支氣管、腺體和皮下組織的癌腫。根據一些流行病學的調查和研究結果表明，世界上許多肝癌高發區，食品的黃麴黴毒素汙染率較高。江蘇省啟東市是全國肝癌發病率最高的地區，據一些專家研究顯示這與當地人們對糧食儲存方法不當，再加上氣候溫暖潮溼，糧食受黃麴黴菌汙染所致。
黃麴黴毒素是一類結構相似的化合物的總稱。其基本結構都有一個二呋南環和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)。最初根據其在紫外光下發生螢光的顏色及薄層層折時Rf值的不同分別命名為黃麴黴毒素B1、B2和G1、G2。在365nm波長下B1、B2呈藍紫色螢光；G1、G2呈黃綠色螢光。以後又發現這類毒素在動物體內的代謝產物，種類有黃麴黴毒素P1、M1、M2、CM1等等，黃麴黴毒素可溶於多種溶劑中，如氯仿、甲醇等，但不溶於己烷、石油醚與乙醚中，在紫外光照射下毒素可產生很強的螢光，此種毒素用有機溶劑提取淨化後，可在矽膠板上作薄層層析。結構如下所示。
動物攝取黃麴黴毒素B1後，在體內形成代謝物M1。M1是B1的羥基化衍生物，最初在羊奶中發現，故命名。牛、羊等動物食入含有黃麴黴毒素B1的飼料後，其奶中即有M1排出。猴攝入B1後尿中排出代謝物為P1。P1是B1的去甲基衍生物，因而代以一個酚基命名。動物攝入B1後，在奶、尿液、血液中都有B1或其它代謝物檢出。組織器官中以肝臟最為重要，各種動物肝臟均有B1或其它代謝物出現，腎、脾、腎上腺中亦可含有B1，但在肝臟中的蓄積作用顯著較其它組織高。
黃麴黴毒素與人類的健康有著密切關係，全世界都在關心食品安全問題。世界衛生組織(WHO)建議自1975年4月1日起將1970年所規定的果實及其產品中的黃麴黴毒素的「可行性標準」(「actionable level」)由20ppb降至15ppb以下，在將來隨著檢驗水平的提高，限量標準將進一步下降。國內外檢測黃麴黴毒素B1的方法有很多，其中薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和免疫化學法是目前研究較多、且受人們關注的幾個代表性方法。(一)TLC該法是常規方法，一般實驗室均可完成，但測定黃麴黴毒素B1的專一性差，且有其它螢光物質幹擾，分析時間較長。(二)HPLCHPLC法是一個靈敏快速的方法，解析度高，往往一次可同時測定多種黃麴黴毒素，可定性、定量，但儀器較昂貴，技術水平要求高，不宜推廣使用。(三)免疫分析法包括放射免疫法、酶聯免疫法和親和層析法。免疫分析法有特異性強，靈敏度高等特點，但需要檢驗人員有較高的專業知識或配有檢測儀器。以上三種方法的不足之處在於或檢測靈敏度不高、或一次不能檢測大量樣品、或需昂貴的設備、或安全性較差等缺點。

發明內容
本發明的目的是提供一種黃麴黴毒素B1金標檢測試紙盒及其製備方法，黃麴黴毒素B1金標檢測試紙條屬於生物工程產品，主要用於檢測糧食、食品、飲料、酒類、飼料等中的黃麴黴毒素B1(AFB1)的含量。
本發明的技術方案檢測原理是樣品中的黃麴黴毒素B1(AFB1)首先與膠體金顆粒表面的抗AFB1單克隆抗體反應，如果樣品中AFB1的含量超過限值，膠體金的抗體位點將不再有剩餘，當膠體金顆粒層析經過檢測線時，膠體金顆粒將不會停留在該線的所在位置，繼續上行時與控制線上噴塗的羊抗鼠IgG反應，呈現出膠體金的紅色。如果樣品中不含AFB1或AFB1含量低於限值，膠體金表面的抗體將與檢測線上的化合物反應呈現出紅色，質控線也呈現紅色。
黃麴黴毒素B1金標檢測試紙盒的結構是由盒殼體和試紙條所組成，試紙條被封裝在盒殼體內，試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端的注樣區粘貼吸附膠體金-抗黃麴黴毒素B1單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜；在試紙條中間的測試區粘貼硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜連接處有一小段重疊區，玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上，在試紙條另一端吸水區粘貼吸水紙；在硝酸纖維素膜上從注樣區到吸水區的方向，依次噴塗黃麴黴毒素B1-卵清白蛋白作檢測線，噴塗羊抗鼠IgG作質控線，然後再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；盒殼體上面開有注樣孔，觀測孔，注樣孔的位置對應於試紙條注樣區的玻璃纖維膜，觀測孔的位置對應於試紙條的測試區，使能觀察到檢測線和質控線的變色。
吸附膠體金-抗黃麴黴毒素B1單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜的製備將膠體金-抗黃麴黴毒素B1單克隆抗體結合物稀釋至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纖維膜，浸泡10-20分鐘，37℃烘乾，4-8℃保存，粘貼在背襯一端的注樣區；在背襯中間檢測區粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上噴塗濃度為100-500μg/mL黃麴黴毒素B1-卵清白蛋白作檢測線，噴塗濃度為50-200μg/mL羊抗鼠IgG作質控線，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；在背襯另一端吸水區粘貼吸水紙；所得黃麴黴毒素B1金標檢測試紙條包封在上面開有注樣孔和觀測孔的盒殼體內。硝酸纖維素膜厚度為120μm，蛋白質負載量為5-20μg/cm2，聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100μm。試紙條的尺寸約為(55-65)mm×(3-5)mm，檢測線和質控線的寬度為0.5-1mm。
本發明的有益效果本發明採用金標檢測法，用於檢測糧食、食品、飲料、酒類、飼料等中的黃麴黴毒素B1(AFB1)的含量。檢測時只需將檢測樣品滴入注樣孔中，稍許，即可在觀測區中觀察檢測線和質控線的變色情況，確定樣品中黃麴黴毒素B1含量是否超標。如果檢測線和質控線均呈紅色，則樣品中黃麴黴毒素B1含量達標，如果檢測線不變色，僅質控線變色，則樣品中黃麴黴毒素B1含量超標。與現有測試方法相比，不需要大型檢測儀器，檢測快速、準確、明顯、靈敏度高。


圖1黃麴黴毒素B1金標檢測試紙盒檢測示意圖。
圖2黃麴黴毒素B1金標檢測試紙條結構圖。
1.盒殼體，2.試紙條，3.玻璃纖維膜，4.硝酸纖維素膜，5.檢測線，6.質控線，7.吸水紙，8.注樣孔，9.觀測孔。
具體實施方法1.完全抗原AFB1-O-BSA的合成取AFB1的活化物5mg於5mL無水二甲基甲醯胺(DMF)溶解，置4℃冰箱中冷卻。取50mg碳二亞胺鹽(EDPC)溶於1.0mL蒸餾水中，取44mg牛血清白蛋白(BSA)溶於4.0mL0.01M的磷酸鹽緩衝液(PBS，PH7.4)中，冰箱中冷卻待用。在磁力攪拌的同時，將0.5mLEDPC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃攪拌，避光反應1小時。在反應液中緩慢滴加BSA溶液，繼續攪拌1小時後，再加入0.5mLEDPC溶液，4℃下反應16小時。將產物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小時，每12小時換一次透析液。最後將透析好的溶液分裝，-20℃保存。
2.黃麴黴毒素B1(AFB1)單克隆抗體的製備1)動物免疫用完全抗原AFB1-O-BSA免疫8周齡BALB/c小鼠，每鼠抗原量為200μg。第一次免疫，抗原與福氏完全佐劑1∶1乳化後，腹腔及皮下注射；第二次免疫於三周後進行，採用抗原與福氏不完全佐劑1∶1乳化後，腹腔及皮下注射；間隔三周後，進行第三次免疫，方法與第二次相同；2周後，加強免疫，直接用抗原通過尾靜脈免疫，抗原量為100μg。在免疫的過程中，監測抗體的產生情況。加強免疫72小時後，殺死小鼠，取脾臟製備脾細胞懸液。
2)細胞融合免疫小鼠脾細胞與處於對數生長期限的骨髓瘤細胞(Sp2/0)以10∶1混合，用含20％胎牛血清RPMI-1640培養液清洗細胞，4000KD聚乙二醇(PEG)為融合劑融合。離心，移去上清液。融合細胞懸浮於含20％胎牛血清的黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培養液中，稀釋至適當濃度(2×106脾細胞/mL)，加入預先製備的96孔細胞培養板(BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞為飼養細胞，2×104個/孔)，放入CO2孵育箱中37℃培養，當鏡檢雜交瘤克隆生長達1/2視野時，取上清液用間接競爭ELISA法進行篩選得到適合的雜交瘤細胞。
3)克隆化採用準確計數稀釋法，得到雜交瘤細胞株，凍存。
4)單克隆抗體的製備將培養的雜交瘤細胞離心，棄去上清液，用生理鹽水將雜交瘤細胞懸浮，並將細胞數調至2×106個/mL，每隻BALB/c小鼠腹腔注射1mL，對側腹腔注射1mL降植烷和不完全福氏佐劑，12天後收集腹水。將腹水離心(3000rpm，20min)，收集上清液。用33％飽和硫酸銨和50％飽和硫酸銨分級沉澱，得到抗AFB1單克隆抗體。
3、抗體與膠體金結合原液的製備1)膠體金的製備取0.01％的氯金酸100mL，加熱煮沸，然後快速加入1％的檸檬酸鈉1.0mL，繼續煮沸5分鐘。用0.1mol/L K2CO3和0.1mol/L HCl調整PH至8.0-8.6。
2)抗體準備抗AFB1單克隆抗體用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25脫鹽。
3)抗體與膠體金結合原液的製備用純化好的抗AFB1單克隆抗體加入膠體金液中，體積比為1∶20，終濃度為50-70μg/mL，室溫攪拌均勻。加入10％牛血清白蛋白(BSA)，終濃度為0.4％，再加入10％PEG(MW20000)，終濃度為0.2％，室溫攪拌均勻。加入與膠體金-抗體結合物液同體積的10％NaCl，靜置1小時。12000rpm離心60分鐘，沉澱溶解於適量0.01M PBS溶液中，用0.45μm的濾膜過濾，終濃度為40-50μg/mL。用0.01M PBS溶液稀釋到所需濃度0.5-2μg/mL，用於浸泡玻璃纖維膜使之吸附。
4)抗原AFB1-O-OVA的合成取AFB1的活化物1mg於1mL無水二甲基甲醯胺(DMF)溶解，置4℃冰箱中冷卻。取20mg碳二亞胺鹽(EDPC)溶於1.0mL蒸餾水中，取20mg卵清白蛋白(OVA)溶於2.0mL0.01M的磷酸鹽緩衝液(PBS，PH7.4)中，冰箱中冷卻待用。在磁力攪拌的同時，將0.5mL EDPC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃攪拌，避光反應1小時。在反應液中緩慢滴加OVA溶液，繼續攪拌1小時後，再加入0.5mL EDPC溶液，4℃下反應16小時。將產物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小時，每12小時換一次透析液。最後將透析好的溶液分裝，-20℃保存。用0.01M PBS溶液稀釋到所需濃度100-500μg/mL，用於噴塗檢測線。
5)羊抗鼠IgG購買於上海華美試劑公司。羊抗鼠IgG用0.01MPBS溶液稀釋到所需濃度50-200μg/mL，用於噴塗質控線。
權利要求
1.一種黃麴黴毒素B1金標檢測試紙盒，其特徵是由盒殼體(1)和試紙條(2)所組成，試紙條被封裝在盒殼體內，試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端的注樣區粘貼吸附膠體金-抗黃麴黴毒素B1單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜(3)；在試紙條中間的測試區粘貼硝酸纖維素膜(4)，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜連接處有一小段重疊區，玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上，在試紙條另一端吸水區粘貼吸水紙(7)；在硝酸纖維素膜上從注樣區到吸水區的方向，依次噴塗黃麴黴毒素B1-卵清白蛋白作檢測線(5)，噴塗羊抗鼠IgG作質控線(6)，然後再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；盒殼體上面開有注樣孔(8)，觀測孔(9)，注樣孔的位置對應於試紙條注樣區的玻璃纖維膜，觀測孔的位置對應於試紙條的測試區，使能觀察到檢測線和質控線的變色。
2.如權利要求1所述的檢測試紙盒的製備方法，其特徵是所述吸附膠體金-抗黃麴黴毒素B1單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜的製備將膠體金-抗黃麴黴毒素B1單克隆抗體結合物稀釋至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纖維膜，浸泡10-20分鐘，37℃烘乾，4-8℃保存，粘貼在背襯一端的注樣區；在背襯中間檢測區粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上噴塗濃度為100-500μg/mL黃麴黴毒素B1-卵清白蛋白作檢測線，噴塗濃度為50-200μg/mL羊抗鼠IgG作質控線，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；在背襯另一端吸水區粘貼吸水紙；所得黃麴黴毒素B1金標檢測試紙條包封在上面開有注樣孔和觀測孔的盒殼體內。
3.根據權利要求2所述的檢測試紙盒的製備方法，其特徵是硝酸纖維素膜厚度為120μm，蛋白質負載量為5-20μg/cm2。
4.根據權利要求2所述的檢測試紙盒的製備方法，其特徵是聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100μm。
全文摘要
一種黃麴黴毒素B
文檔編號G01N33/544GK1673748SQ20051003886
公開日2005年9月28日 申請日期2005年4月12日 優先權日2005年4月12日
發明者趙曉聯, 龔燕, 陸茂林, 孫蔚榕, 趙春城, 孫秀蘭, 湯堅, 蔡建榮, 張東升, 蔡正森 申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司