Grg31和grg36epsp合酶的定向進化的製作方法

2023-05-07 11:37:21

專利名稱:Grg31和grg36 epsp合酶的定向進化的製作方法
GRG31和GRG36EPSP合酶的定向進化
發明領域
本發明涉及植物分子生物學，特別是賦予提高的除草劑草甘膦抗性或耐受性的新 EPSP合酶多肽。
發明背景
N-膦醯基甲基甘氨酸通常稱為草甘膦，是一種重要的農事化學品。草甘膦抑制將 磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)轉化成5-烯醇丙酮醯-3-磷酸莽草酸的酶。 對該酶(5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合酶；本文稱為「EPSP合酶」或「EPSPS」)的抑制通 過關閉莽草酸路徑、由此抑制芳族胺基酸生物合成而殺死植物細胞。
由於草甘膦類除草劑抑制芳族胺基酸生物合成，故它們不僅殺死植物細胞，而且 還對細菌細胞有毒。草甘膦抑制許多細菌EPSP合酶，因而對這些細菌有毒。不過，某些細 菌EPSP合酶對草甘膦具有高耐受性。
植物細胞對草甘膦毒性的抗性可以通過轉化植物細胞使之表達抗草甘膦的細 菌EPSP合酶而產生。特別地，來自根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)CP4株的該 細菌基因已經用來繼在植物中表達後賦予植物細胞除草劑抗性。來自鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium) CT7株的突變EPSP合酶賦予細菌細胞草甘膦抗性，並賦予植物 細胞草甘膦抗性(美國專利No. 4，535，060 ；4, 769，061 ；和5，094，945)。
美國專利6，040, 497報導了突變玉米EPSP合酶，具有102位蘇氨酸至異亮氨酸 取代、以及106位脯氨酸至絲氨酸取代(「TIPS」突變)。這些改變賦予所述玉米酶草甘膦 抗性。來自鼠傷寒沙門氏菌CT7株的突變EPSP合酶賦予細菌細胞草甘膦抗性，而且據報 道賦予植物細胞草甘膦抗性(美國專利No. 4，535，060 ；4, 769，061 ；和5，094，945)。He等 人((2001)Biochim etBiophysica Acta 1568:1-6)通過誘變以及重組大腸桿菌和鼠傷寒 沙門氏菌EPSP合酶基因，開發了草甘膦耐受性增加的EPSP合酶，並提出42位(T42M)和 230位(Q230K)的突變很可能是造成所觀察到的抗性的原因。隨後的工作(He等人(2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67 =1405-1409)表明，T42M突變(蘇氨酸突變為甲硫氨酸)足以 提高大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌酶的耐受性。由於除草劑抗性植物提供許多優勢，期望除 草劑抗性基因提高的草甘膦抗性活性。
其他的誘變方法描述在2006年6月13日遞交的、發明名稱為「全排列誘變」的美 國專利 No. 60/813，095 中。
發明概述
本文提供了賦予抗性或耐受性的組合物和方法。組合物包括抗草甘膦除草劑的 EPSP合酶，編碼此類酶的核酸分子，含有那些核酸分子的載體，以及含有載體的宿主細胞。 組合物包括編碼除草劑抗性多肽的核酸分子，包括編碼SEQ ID NO :2和4的多肽變體的那 些核酸分子。在多個實施方案中，多肽變體如SEQ ID N0:7-28所示。這些編碼序列可用在 DNA構建體或表達盒中，用於轉化生物體，包括微生物和植物，及在其中表達。組合物還包括 通過將本發明組合物引入生物體基因組中而呈草甘膦抗性的轉化細菌、植物、植物細胞、組 織和種子。在生物體是植物的情況下，引入所述序列允許對所述植物施加含草甘膦的除草
7劑，以選擇性地殺死草甘膦敏感性雜草或其他未轉化的植物，而非轉化的生物體。這些序列 還可以用作為標記，以選擇在草甘膦條件下生長的植物細胞。
另外還提供了鑑定具有草甘膦抗性活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括基於 本發明結構域的存在來鑑定具有草甘膦抗性的其他EPSP合酶序列。
發明詳述
現在將於下文參照
附圖更充分地描述本發明，附圖中顯示了一些但非所有的本發 明的實施方案。事實上，本發明可以有多種不同形式的實施方案，故而不應闡釋為局限於本 文所闡釋的實施方案；相反，這些實施方案是為了使發明公開滿足適用的法律要求而提供 的。通篇相似的數值適用於相似的要素。
在得益於前述說明以及所附附圖中所給出的教導的情況下，本發明所屬領域的技 術人員自然會想到本文所闡釋的本發明的許多變動和其他實施方案。所以，應當理解本發 明不局限於所公開的具體實施方案，且變動和其他實施方案旨在落入所附權利要求
書的範 圍之內。雖然本文採用了具體術語，但其僅僅是在一般性和描述性意義上使用的，而不是為 了構成限制。
本發明涉及調控生物特別是植物或植物細胞的除草劑抗性的組合物和方法。所述 方法包括用編碼本發明草甘膦抗性基因的核苷酸序列轉化生物體。本發明的核苷酸序列可 用於製備對除草劑草甘膦顯示出增加的耐受性的植物。因而，本發明的「草甘膦抗性」或「草 甘膦耐受性」基因旨在指編碼SEQ ID NO :7-28中任一所示胺基酸序列的核苷酸序列，及其 編碼草甘膦抗性或耐受性多肽的片段和變體。同樣，本發明的「草甘膦抗性」或「草甘膦耐 受性」多肽是指具有SEQ ID NO :7-28所示胺基酸序列的多肽，及其賦予宿主細胞草甘膦抗 性或草甘膦耐受性的片段和變體。
A.分離的多核苷酸及其變體和片段
在一些實施方案中，本發明包括分離的、重組的或純化的多核苷酸。「分離的」或 「純化的」多核苷酸或多肽或其生物活性片段，當通過重組技術生產時基本上不含其它細胞 材料或培養基，或當通過化學合成時基本上不含化學前體或其他化學品。「生物活性」表示 擁有天然多肽的期望生物活性，即，保留除草劑抗性活性。「分離的」多核苷酸可以不含在所 述多核苷酸來源生物體的基因組DNA中天然位於所述核酸側翼的序列(即，位於所述核酸 5』和3』端的序列)(例如，蛋白質編碼序列)。出於本發明的目的，「分離的」在用來述及多 核苷酸時不包括分離的染色體。例如，在多個實施方案中，分離的草甘膦抗性編碼多核苷酸 可以含有少於約5吐、4吐、3吐、2吐、1吐、0. 5kb或0. lkb的在所述多核苷酸來源細胞的基因 組DNA中天然位於所述多核苷酸側翼的核苷酸序列。
本發明的多核苷酸包括編碼作為SEQ ID NO :2和4的變體的草甘膦抗性多肽的那 些多核苷酸。特別是，多核苷酸編碼SEQ ID NO :2的變體，在對應於SEQ ID NO :2胺基酸殘 基75、77、77、78、81、82、86、87、88和95的位置上具有一個或多個取代，或在對應於SEQ ID NO 4胺基酸位置90、145、350或410的一個或多個位置上具有取代。在一些實施方案中， 變體包含如下一個或多個與SEQ ID NO 2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基； 與SEQ ID N0:2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；與SEQ ID NO 2胺基酸位 置77相對應位置上的天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；與SEQ ID NO :2胺基酸位 置78相對應位置上的絲氨酸殘基；與SEQ ID NO 2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；與SEQ ID NO :2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯 丙氨酸殘基 』與SEQ ID NO 2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；與SEQ ID NO 2 胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；與SEQ ID NO 2胺基酸位置88相對應位置上 的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨酸殘基；與SEQ ID NO :2胺基酸位置95相對應位置上的 絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；與SEQ ID NO 2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、 絲氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；與SEQ ID NO :2胺基酸位置215相對應位 置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基；與SEQ ID NO :4胺基酸位置90相 對應位置上的異亮氨酸殘基；與SEQ ID NO 4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘 基；與SEQ ID NO 4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和與SEQ ID NO 4氨基 酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基。在多個實施方案中，變體選自SEQ ID NO 7-28 中任一，以及SEQ ID NO 29或30所示的合成核苷酸序列。
「草甘膦」表示N-膦醯基甲基甘氨酸(包括其任何鹽)的任何除草劑形式以及導 致在植物中(in planta)產生草甘膦陰離子的其他形式。「除草劑抗性蛋白質」或由「除草 劑抗性編碼核酸分子」的表達而產生的蛋白質，包括賦予細胞如下能力的蛋白質，即，與不 表達該蛋白質的細胞相比耐受更高濃度除草劑的能力、或與不表達該蛋白質的細胞相比更 長時間地耐受一定濃度的除草劑的能力。「草甘膦抗性蛋白質」包括賦予細胞如下能力的蛋 白質，即，與不表達該蛋白質的細胞相比耐受更高濃度的草甘膦、或與不表達該蛋白質的細 胞相比更長時間地耐受一定濃度的草甘膦的能力。「耐受」或「耐受性」是指，以不易區別於 未處理細胞的方式，存活、或者執行基本細胞功能，例如蛋白質合成和呼吸。
本發明還考慮本文所述多核苷酸的變體和片段。多核苷酸的「片段」可以編碼多 肽的生物活性部分，或者其可以是能夠在本文別處所公開的方法中用作雜交探針或PCR引 物的片段。作為多核苷酸片段的多核苷酸包含至少約15、20、50、75、100、200、300、350、400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、 1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950 個連續核 苷酸，或多達本文所公開的全長多核苷酸中存在的核苷酸數，這取決於目的用途(例如，包 含SEQ ID N0:1的EPSP合酶多核苷酸)。「連續」核苷酸表示彼此緊鄰的核苷酸殘基。
本發明的多核苷酸片段一般將編碼保留全長草甘膦抗性蛋白質的生物活性、即除 草劑抗性活性的多肽片段。「保留除草劑抗性活性」是指，片段將具有本文所公開的如SEQ ID NO :2或4的全長草甘膦抗性蛋白質的除草劑抗性活性的至少約30%、至少約50%、至少 約 70 %、至少約 80 %、85 %、90 %、95 %、100 %、110 %、125 %、150 %、175 %、200 %、250 %、 至少約300%或更高。測量除草劑抗性活性的方法在本領域公知。參見例如美國專利 No. 4，535，060和5，188，642，每一篇在此全文併入作為參考。
編碼本發明多肽的生物活性部分的多核苷酸片段將編碼至少約15、25、30、50、75、 100、125、150、175、200、250、300、350、400個連續胺基酸，或多達本發明全長多肽中存在的
胺基酸總數。
本發明還包括如前文所述的變體多核苷酸。多核苷酸的「變體」還包括編碼本文 所公開的多肽、但是由於遺傳密碼的簡併性而存在保守性差別的那些序列，以及足夠相同 的那些序列。
術語「足夠相同」是指，利用比對程序之一，使用標準參數，多肽或多核苷酸序列與
9參照序列相比具有至少約60%或65%序列同一性，約70%或75%序列同一性，約80%或 85%序列同一性，約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一 性。本領域技術人員將會意識到，可以通過考慮密碼子簡併性、胺基酸相似性、讀框定位等 等，適當地調整這些數值，以確定兩個多核苷酸所編碼的多肽的相應同一性。
細菌基因常常在鄰近開放讀框起點處具有多個甲硫氨酸起始密碼子。通常在這些 起始密碼子的一個或多個處的起始翻譯會導致產生功能蛋白質。這些起始密碼子可以包括 ATG密碼子。不過，細菌例如芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)也識別密碼子GTG作為起始 密碼子，在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質含有甲硫氨酸作為第一個胺基酸。此外，不是常 常能先驗性地確定這些密碼子中哪個天然地在細菌中使用。因而，可以理解，這些可選甲硫 氨酸密碼子之一的使用可能導致產生賦予除草劑抗性的變體。這些除草劑抗性蛋白質涵蓋 在本發明之中，並且可以用在本發明的方法之中。
天然存在的等位變體可以用公知的分子生物學技術來鑑定，例如下文所述的聚合 酶鏈式反應(PCR)和雜交技術。變體多核苷酸也包括合成來源的、已經例如利用定點或其 他誘變策略生成的、但仍然編碼具有期望生物活性的多肽的多核苷酸。
技術人員還會理解，可以通過進一步突變本發明的多核苷酸而引入變化，由此引 起所編碼多肽的胺基酸序列的進一步變化，而不改變多肽的生物活性。因而，分離的變體多 核苷酸可以通過在編碼如本文所公開的EPSP合酶結構域的相應多核苷酸中引入一個或多 個另外的核苷酸取代、添加或缺失而產生，從而在編碼的多肽中引入一個或多個胺基酸取 代、添加或缺失。進一步的突變可通過標準技術引入，例如定點誘變和PCR介導的誘變或者 基因改組技術。此類變體多核苷酸也涵蓋在本發明之中。
變體多核苷酸可以通過沿編碼序列的全長或部分隨機引入突變(例如通過飽和 誘變)而製備，可以篩選所得突變體賦予除草劑抗性活性的能力，以鑑定保留活性的突變 體。
基因改組或有性PCR方法(例如，Smith(1994)Nature 370 :324_325 ；美國專利 No. 5，837，458 ；5, 830, 721 ；5, 811, 238和5，733，731，每一篇都在此併入作為參考)可用來 進一步修飾或增強本文公開的多核苷酸和多肽(例如，賦予草甘膦抗性的多肽)。基因改組 包括隨機片段化若干突變體DNA，接著通過PCR將它們重組裝成全長分子。多種基因改組方 法的實例包括但不限於在DNA酶處理後組裝、交錯延伸方法(STEP)以及體外隨機引發重 組。在DNA酶介導的方法中，分離自一組陽性突變體的DNA區段以DNasel切割成隨機片段， 並進行多輪PCR而不添加引物。隨著PCR循環的執行，隨機片段的長度接近未切割區段的長 度，導致不同克隆中的突變在一些所得序列中混合和累積。通過多個選擇和改組循環，已經 導致了若干酶的功能性增強(Stemmer(1994)Nature 370 :389_391 ；Stemmer(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747_10751 ；Crameri 等(1996)Nat. Biotechnol. 14 :315_319 ； Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504-4509 以及 Crameri 等(1997)Nat. Biotechnol. 15 =436-438)。可對例如編碼本文公開多肽的多核苷酸實施此類方法。
生成變體的其他方法包括使表達本文公開蛋白質(或其文庫)的細胞接觸對蛋白 質的活性造成脅迫的特定條件。特定條件可包括(但不限於)溫度改變、PH改變、及底物 或抑制劑濃度的改變。蛋白質文庫可在蛋白質表達期間(例如在大腸桿菌或其他宿主中)、 或在製備蛋白質提取物之後、或在蛋白質純化之後接觸這些條件。[0030]已經接觸過脅迫條件的蛋白質文庫的功能或酶促活性可隨之與野生型蛋白質進 行比較，以鑑定具有改善性能的蛋白質。活性比較可以作為生長篩選的一部分、或可選地作 為定量蛋白質活性的酶測定法的一部分來實施。可鑑定為改善的性能可以包括草甘膦耐受 性、動力學常數(包括1011、燈^111 )、蛋白質穩定性、蛋白質熱穩定性、或蛋白質最適溫度的變化。
B.分離的蛋白質及其變體和片段
除草劑抗性多肽也涵蓋在本發明之中。基本上不含細胞物質的除草劑抗性多肽包 括具有少於約30%、20%、10%或5% (以乾重計)非除草劑抗性多肽(本文也稱為「雜質 蛋白質」)的多肽製品。在本發明中，「除草劑抗性蛋白質」表示本文公開的EPSP合酶多肽。 也提供了其片段、生物活性部分及變體，並且它們可以用來實施本發明的方法。
「片段」或「生物活性部分」包括這樣的多肽片段，其包含編碼除草劑抗性蛋白質的 胺基酸序列的一部分、且保留除草劑抗性活性。例如，除草劑抗性蛋白質的生物活性部分可 以是長度10、25、50、100個或更多胺基酸的多肽。此類生物活性部分可通過重組技術製備， 並評估其除草劑抗性活性。
「變體」表示這樣的蛋白質或多肽，其具有與SEQ ID NO :7_28中任一至少約60%、 65%、約 70%、75%、約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的胺基酸序列。本領域技術人員將會意識到，可以考慮密碼子簡併性、胺基酸相似 性、讀框定位等等，對這些數值進行適當的調整，以確定兩個多核苷酸所編碼的多肽的相應 同一性。
例如，可在一個或多個非必需胺基酸殘基處進行保守胺基酸取代。「非必需」氨基 酸殘基是能夠自多肽野生型序列改變而不影響生物活性的殘基，而「必需」胺基酸殘基是生 物活性所必需的。「保守胺基酸取代」是指將胺基酸殘基替換為具有相似側鏈的胺基酸殘 基。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本領域已經定義。這些家族包括具有鹼性側鏈(例 如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈 (例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例 如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3分枝側鏈 (例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸) 的胺基酸。可非保守區進行保留功能的胺基酸取代。一般，不對多肽活性所必需的保守氨 基酸殘基或位於保守基序中的胺基酸殘基進行此取代。不過，本領域技術人員將會理解，功 能變體可以在保守殘基處具有微小的保守或非保守改變。
本發明也涵蓋本發明多肽或其變體或片段的抗體。產生抗體的方法在本領域公知 (參見例如，Harlow 禾口 Lane (1988) Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；美國專利 No. 4，196，265)。
C.多核苷酸構建體
可修飾編碼本發明EPSP合酶多肽的多核苷酸，以獲得或增強在植物細胞中的表 達。編碼本文鑑定的多肽的多核苷酸可以在表達盒中提供，以用於在目的植物中表達。「植 物表達盒」包括能夠引起多核苷酸在植物細胞中表達的DNA構建體，包括重組DNA構建體。 盒可以，按5』 -3』轉錄方向，包括有效連接於一個或多個目的多核苷酸的在植物中有功能 的轉錄起始區域(即啟動子，尤其是異源啟動子)，和/或翻譯及轉錄終止區(即終止區)。盒可以另外含有至少一個待引入生物體的其他多核苷酸，例如可選擇標記基因。可選地，該 其他多核苷酸可以在多個表達盒上提供。這樣的表達盒提供有多個限制性位點，用來插入 多核苷酸，使之處於調控區域的轉錄調控之下。
「異源」一般指，多核苷酸或多肽並非細胞內源的、或者對於其所存在於的天然 基因組中的位置而言並非內源的，並且已經通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊 (microprojection)等而添加到細胞中。「有效連接」表示兩個多核苷酸之間的功能性連 接。例如，當啟動子有效連接於DNA序列時，啟動子序列起始和介導DNA序列的轉錄。公認， 有效連接的多核苷酸可以是或者可以不是連續的，並且當用來述及兩個多肽編碼區的連接 時，所述多肽在相同的讀框中表達。
啟動子可以是在選擇的植物細胞、植物部分或植物中顯示出轉錄活性的任何多核 苷酸序列。啟動子對於植物宿主和/或本發明的DNA序列可以是天然的或同源的、或者外 來的或異源的。啟動子對於植物宿主是「天然的」或「同源的」，表示啟動子見於該啟動子 所引入的天然植物中。啟動子對於本發明的DNA序列是「外來的」或「異源的」，表示啟動 子對於有效連接的本發明DNA序列並非是天然的或天然存在的啟動子。啟動子可以是誘導 型或組成型的。其可以是天然存在的，可以由多個天然存在啟動子的部分組成，或者可以 部分或全部是合成的。通過啟動子結構的研究提供了啟動子的設計指南，例如Harley和 Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15 :2343_2361。此外，可以優化啟動子相對於轉錄起 點的定位。參見例如 Roberts 等(1979)Proc. Natl. Acad. Sci. USA，76 :760_764。許多在植 物中使用的適宜啟動子在本領域公知。
例如，在植物中使用的適宜組成型啟動子包括來自植物病毒的啟動子，例如花生 退綠條死病花椰菜花葉病毒(PC1SV)啟動子(美國專利No. 5，850，019)；來自花椰菜花葉 病毒(CaMV)的35S啟動子(Ode 11等(1985)Nature 313 :810_812)；小球藻病毒甲基轉移 酶基因的啟動子(美國專利No. 5，563，328)以及來自玄參花葉病毒(FMV)的全長轉錄物 啟動子(美國專利No. 5，378，619)；來自諸如稻肌動蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen 等(1989)Plant Mol. Biol. 12 :619_632 和 Christensen 等(1992)Plant Mol. Biol. 18 :675_689) ；pEMU(Last 等(1991)Theor. Appl. Genet. 81 581-588) ；MAS(Velten等(1984)EMB0 J. 3 :2723_2730)；玉米H3組蛋白(L印etit等(1992) Mol.Gen.Genet. 231:276-285and Atanassova 等(1992)Plant J. 2(3) :291_300)；歐洲 油菜(Brassica napus) ALS3 (PCT申請W0 97/41228)等基因的啟動子；以及各種農桿菌 (Agrobacterium)基因的啟動子(參見美國專利 No. 4，771，002 ；5，102，796 ；5，182，200 ；和 5，428，147)。
在植物中使用的適宜誘導型啟動子包括來自ACE1系統的響應銅的啟動子(Mett 等(1993)PNAS 90:4567-4571)；玉米In2基因的響應苯磺醯胺除草劑安全劑的啟動子 (Hershey 等(1991)Mol. Gen. Genetics227 :229_237 和 Gatz 等(1994)Mol. Gen. Genetics 243:32-38)；以及來自 Tn 10 Tet 阻遏物的啟動子(Gatz 等(1991)Mol. Gen. Genet. 227 229-237)。在植物中使用的另一種誘導型啟動子是響應植物通常不響應的誘導劑的啟動 子。例示性的此類誘導型啟動子是來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，其轉錄活性受 糖皮質激素誘導(Schena 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10421)；或最近應用的 嵌合轉錄激活物XVE，用於受雌二醇激活的、基於雌激素受體的誘導型植物表達系統(Zuo等(2000) Plant J.，24 :265_273)。其他在植物中使用的誘導型啟動子在EP 332104、PCT W093/21334和PCT W0 97/06269中描述，在此將其整體併入併入作為參考。還可以使用由 其他啟動子的部分組成的啟動子，以及部分或全部合成的啟動子。參見例如Ni等(1995) Plant J. 7 :661-676和PCT W0 95/14098，描述了在植物中使用的此類啟動子。
啟動子可以包括，或者經修飾而包括，一個或多個增強子元件。在一些實施方案 中，啟動子可以包括多個增強子元件。含有增強子元件的啟動子與不含它們的啟動子相比 可以確保更高水平的轉錄。在植物中使用的適宜增強子元件包括PC1SV增強子元件(美國 專利 No. 5，850, 019)、CaMV35S增強子元件(美國專利No. 5，106, 739和 5，164，316)以及FMV 增強子元件(Maiti 等(1997) Transgenic Res. 6 143-156)。還請參見 PCT W096/23898。
通常此類構建體可以含有5』和3』非翻譯區。此類構建體可以含有「信號序列」 或「前導序列」以利於目的肽向某個細胞內結構如葉綠體(或其他質體)、內質網或高爾基 體的共翻譯或翻譯後轉運，或者分泌。例如，可以工程化設計構建體以含有信號肽，以利於 肽轉運到內質網。「信號序列」是指，已知會或者懷疑會引起跨細胞膜的共翻譯或翻譯後肽 轉運的序列。在真核細胞中，這一般涉及分泌到高爾基體中以及由此的一定糖基化。「前導 序列，，是指，任何在翻譯後產生如下胺基酸序列的序列，所述胺基酸序列足以觸發肽鏈共翻 譯轉運到亞細胞器。因而，這包括通過穿運進入內質網、進入液泡、質體(包括葉綠體)、線 粒體等而靶向轉運和/或糖基化的前導序列。還可以優選工程化設計植物表達盒以含有內 含子，以便內含子的mRNA加工是表達所必需的。
「3』非翻譯區」表示位於編碼序列下遊的多核苷酸。多聚腺苷酸化信號序列及其他 編碼能夠影響多聚腺苷酸尾添加到mRNA前體3』端的調控信號的序列是3』非翻譯區。「5』 非翻譯區」表示位於編碼序列上遊的多核苷酸。
其他上遊或下遊非翻譯元件包括增強子。增強子是發揮作用以增加啟動子區表達 的多核苷酸。增強子在本領域公知，並且包括但不限於SV40增強子區和35S增強子元件。
終止區可以對於轉錄起始區而言是天然的，可以對本發明的序列而言是天然的， 或者可以來自其他來源。便利的終止區可以來自根癌農桿菌(A.tumefaciens)!!質粒，例 如章魚鹼合酶和胭脂鹼合酶終止區。參見例如Guerineau等(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot(1991)Cell64 671-674 ；Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 141-149 ； Mogen 等(1990)Plant Cell 2 1261-1272 ;Munroe 等(1990)Gene 91 151-158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891_7903 和 Joshi 等(1987)NucleicAcidRes. 15 9627-9639。
在本發明的一方面，針對給定多肽，例如本發明的多肽，設計合成的DNA序列。合 成DNA序列的開放讀框在細胞中的表達導致產生本發明的多肽。合成DNA序列可用於簡單 地去除不想要的限制性核酸內切酶位點以利於DNA克隆策略，改變或去除任何潛在的密碼 子偏好，改變或改善GC含量，去除或改變可變讀框，和/或改變或去除可能存在於天然DNA 序列之中的內含子/外顯子剪接識別位點、多聚腺苷酸化位點、Shine-Delgarno序列、不 想要的啟動子元件等等。也有可能合成的DNA序列可以用來向DNA序列中引入其他改進， 例如引入內含子序列、創建以與細胞器靶向序列(例如葉綠體轉運肽、質外體/液泡靶向 肽、或導致所得肽滯留在內質網中的肽序列)融合的蛋白質形式表達的DNA序列。合成的 基因還可以利用宿主細胞偏好的密碼子合成以提高表達，或者以宿主偏好的密碼子使用頻率使用密碼子合成。參見例如Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol. 92 :1_11 ；美國專 利 No. 6，320，100 ；6，075，185 ；5，380，831 和 5，436，391，美國公開申請 No. 20040005600 和 20010003849，以及 Murray 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :477_498，在此併入作為參考。
在一個實施方案中，目的多核苷酸靶向葉綠體進行表達。在這種方式中，在目 的多核苷酸不直接插入到葉綠體中的情況下，表達盒將另外含有編碼轉運肽的多核苷酸 以指導目的核苷酸進入葉綠體。這樣的轉運肽在本領域已知。參見例如Von Heijne等 (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9 104-126 ；Clark 等(1989) J. Biol. Chem. 264 17544-17550 ； Della-Cioppa 等(1987)Plant Physiol. 84 :965_968 ;Romer 等(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 :1414-1421 和 Shah 等(1986)Science 233 :478_481。
可以考慮植物細胞核和該細胞器之間密碼子使用的差異，對待靶向葉綠體的目的 多核苷酸進行優化以在葉綠體中表達。在這種方式中，目的多核苷酸可以利用葉綠體偏好 的密碼子來合成。參見例如美國專利No. 5，380，831，在此併入作為參考。
該植物表達盒可以插入到植物轉化載體中。「轉化載體」表示允許轉化細胞的DNA 分子。這樣的分子可以由一個或多個表達盒組成，並且可以組織成一個以上的載體DNA分 子。例如，雙元載體是植物轉化載體，利用兩個不連續的DNA載體編碼轉化植物細胞所必 需的所有順式和反式功能(Hellens 和 Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5 446-451)。「載體」是指設計用於在不同宿主細胞之間轉移的多核苷酸構建體。「表達載體」 是指具有在外來細胞中摻入、整合和表達異源DNA序列或片段的能力的載體。
植物轉化載體包括一個或多個用於實現植物轉化的DNA載體。例如，本領域常見 的做法是利用含有一個以上連續DNA區段的植物轉化載體。這些載體在本領域往往稱為雙 元載體。雙元載體以及伴有輔助質粒的載體最常用於農桿菌介導的轉化，其中實現有效轉 化所需的DNA區段的大小和複雜度相當大，故而將功能分割到分開的DNA分子上是有利的。 雙元載體一般包括這樣的質粒載體，其含有T-DNA轉移所需的順式作用序列(例如左邊界 和右邊界)、經工程化設計能夠在植物細胞中表達的可選擇標記、以及「目的多核苷酸」(經 工程化設計能夠在期望生成轉基因植物的植物細胞中表達的多核苷酸)。還存在於該質粒 載體上的有細菌複製所需的序列。這些順式作用序列以允許有效轉移到植物細胞中並在 其中表達的方式排列。例如，可選擇標記序列和目的序列位於左右邊界之間。通常第二質 粒載體含有介導T-DNA從農桿菌轉移到植物細胞中的反式作用因子。該質粒往往含有毒 力功能(Vir基因)，允許農桿菌感染植物細胞，並通過邊界序列處的切割和vir介導的DNA 轉移而轉移DNA，如本領域所理解的那樣(Hellens和Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5 :446_451)。若干類型的農桿菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105 等)可用於植物轉化。第二質粒載體對於通過其他方法例如微粒轟擊、顯微注射、電穿孔、 聚乙二醇等向植物中引入多核苷酸而言並不是必需的。
D.植物轉化
本發明的方法包括向植物中引入核苷酸構建體。「引入」表示以構建體獲得進入 植物細胞內部的方式將核苷酸構建體呈遞給植物。本發明的方法不要求使用特定的方法將 核苷酸構建體引入到植物中，僅僅是要求核苷酸構建體獲得進入植物的至少一個細胞的內 部。將核苷酸構建體引入到植物中的方法在本領域已知，包括但不限於穩定轉化方法、瞬時 轉化方法以及病毒介導的方法。[0055]一般而言，植物轉化方法包括將異源DNA轉移到靶植物細胞中(例如，未成熟或成 熟的胚、懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體等)，接著施加最大閾值水平的適宜選擇 (取決於可選擇標記基因，在本案中是「草甘膦」)，以從未轉化的細胞團中回收轉化的植物 細胞。外植體一般被轉移到新鮮供應的相同培養基中並常規培養。隨後，轉化的細胞在置於 補充有最大閾值水平選擇劑(例如「草甘膦」)的再生培養基中之後分化出芽。芽隨之轉移 到選擇性生根培養基中，以回收生根的芽或小植株。轉基因小植株隨之長成成熟植株，並產 生可育種子(例如 Hiei 等(1994) The Plant Journal6 :271_282 ；Ishida 等(1996) Nature Biotechnology 14 :745_750)。外植體一般轉移到新鮮供應的相同培養基中並常規培養。 有關生成轉基因植物的技術和方法的一般說明見Ayres和Park (1994) Critical Reviews in PlantScience 13 :219_239 以及 Bommineni 禾口 Jauhar (1997)Maydica 42:107—120。由 於轉化的材料含有許多細胞；轉化的以及未轉化的細胞皆存在於任何一塊的靶受試愈傷組 織或者組織或細胞群中。殺死未轉化的細胞並允許轉化的細胞增殖的能力將導致轉化的植 物培養物。通常，去除未轉化細胞的能力對於快速回收轉化的植物細胞和成功生成轉基因 植物是一種限制。可利用分子和生化方法來確認轉基因植物基因組中整合的異源目的基因 的存在。
生成轉基因植物可以通過若干方法之一來實施，包括但不限於，通過農桿菌將異 源DNA引入到植物細胞之中(農桿菌介導的轉化)、用附於粒子上的異源外來DNA轟擊植 物細胞、以及多種其他非粒子直接介導的方法(例如，Hiei等(1994)The Plant Journal 6 271-282 ；Ishida 等(1996)NatureBiotechnology 14 745-750 ；Ayres 和 Park(1994) Critical Reviews in PlantScience 13 219~239 ；Bommineni 禾口 Jauhar(1997)Maydica 42 :107-120)以轉移 DNA。
葉綠體轉化方法在本領域已知。參見例如Svab等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :913_917 ；Svab 和 Maiiga (1993) EMB0 J. 12 :601_606。該方法依賴於基因槍遞送含可選擇標記的DNA，以及通 過同源重組使DNA靶向該質體基因組。另外，質體轉化可通過核編碼的、質體定向的RNA聚 合酶的組織偏好型表達，通過反式激活沉默的質體攜帶的轉基因而實現。這樣的系統已經 在 McBride 等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :7301_7305 中報導。
已經轉化的細胞可以按照常規方法培養成植物。參見例如McCormick等(1986) Plant Cell Reports 5 :81_84。隨之可以生長這些植物，並用相同的轉化的株系或不同的 株系授粉，鑑定組成型表達期望的表型特徵的所得雜種。可以栽培兩代或更多代，以確保該 期望表型特徵的表達得以穩定維持和遺傳，然後收穫種子以確保已經實現期望表型特徵的 表達。以這種方式，本發明提供了具有穩定摻入至其基因組中的本發明核苷酸構建體[例 如本發明的表達盒]的轉化的種子(也稱為「轉基因種子」)。
E.植物轉化評價
在將異源外來DNA引入到植物細胞中之後，該異源基因在植物基因組中的轉化或 整合可以通過多種方法來確認，例如分析與整合基因相關的核酸、蛋白質以及代謝物。
PCR分析是一種在移植入土壤之前的較早階段篩選存在摻入的基因的轉化細 胞、組織或芽的快速方法(Sambrook 禾口 Russell (2001)MolecularCloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY))。PCR 利用特異於目的基因或農桿菌載體背景等的寡核苷酸引物進行。
植物轉化可以通過基因組DNA的Southern印跡分析來確認(Sambrook和 Russell (2001)同前)。一般而言，從轉化株中提取總DNA，用適宜的限制性酶消化，在瓊脂 糖凝膠上分級分離，並轉至硝基纖維素或尼龍膜上。膜或「斑點」隨之可以按照標準技術用 例如放射標記的32P靶DNA片段探測，以確認引入基因在植物基因組中的整合(Sambrook和 Russell, 2001,同前)。
在Northern分析中，按照本領域常規使用的標準方法，從轉化株的特定組織中分 離RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中分級分離，並印跡到尼龍濾膜上(Sambrook和Russell (2001) 同前)。本發明grg序列所編碼的RNA的表達隨之可以利用本領域已知的方法通過使濾膜 與源自⑶C的放射性探針雜交來檢驗(Sambrook和Russell (2001)同前)。
可以通過標準方法(Sambrook和Russell (2001)同前)，利用與除草劑抗性蛋白質 上存在的一個或多個表位結合的抗體，對轉基因植株進行Western印跡和生化測定等，以 確定除草劑抗性基因所編碼的蛋白質的存在。
在本發明的一個方面，本文所述的grg基因可用作標記來評估細菌或植物細胞的轉化。
F.植物和植物部分
「植物」是指，整個植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、 胚及其子代。植物細胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質 體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。本發明可以用來將多核苷酸引入到任何植物物種 中，包括但不限於單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的實例包括但不限於玉米(玉蜀 黍)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、 甘蔗、菸草、大麥、和油菜籽油菜、芸苔屬物種(Brassicasp.)、苜蓿、黑麥、粟、紅花、花生、 甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘屬果樹、可可、茶樹、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄 欖、木瓜、腰果、澳大利亞堅果、杏、燕麥、蔬菜類、觀賞植物類以及針葉樹類。
蔬菜類包括但不限於番茄、萵苣、綠豆、菜豆、豌豆、以及甜瓜屬(Curcumis)的成 員，例如黃瓜、甜瓜和香瓜。觀賞植物類包括但不限於杜鵑、繡球屬植物、木槿屬植物、薔薇 屬植物、鬱金香屬植物、水仙、矮牽牛屬植物、康乃馨、大戟屬植物和菊屬植物。作物植物也 有重要意義，包括例如玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴 薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥、油菜籽油菜等。
本發明適合於任何單子葉植物家族的成員，包括但不限於玉蜀黍、稻、大麥、燕 麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、薯蕷、洋蔥、香蕉、椰子和棗。
G.增加植物產量的方法
本發明提供了增加植物產量的方法。所述方法包括向植物或植物細胞中引入含本 文所公開的grg序列的多核苷酸。如本文所定義的那樣，植物「產量」是指植物所產生的生 物質的質量和/或數量。「生物質」是指任何測量到的植物產品。生物質產出的增加可以是 所測量的該植物產品的產量方面的任何改進。增加的植物產量具有若干商業應用。例如， 增加植物葉生物質可以增加人或動物所消耗的葉類蔬菜的產量。另外，可以通過增加葉生 物質，增加植物來源的藥用或工業產品的產出。產量增加可以包括任何統計學顯著的增加， 包括但不限於至少的增加、至少3%的增加、至少5%的增加、至少10%的增加、至少
1620%的增加、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更高的增加。
在特定方法中，用有效濃度的除草劑處理植物，其中除草劑施用導致增強的植物 產量。「有效濃度」表示允許植物產量增加的濃度。目的除草劑的此類有效濃度在本領域普 遍已知。可以在出苗前或者出苗後，按照除草劑施用的通常技術對大田施用除草劑，所述大 田包含已經因異源表達本發明的grg基因而對除草劑具有抗性的作物。
本發明還提供了對植物或植物部分賦予除草劑抗性的方法。在此類方法中，將本 文公開的grg多核苷酸引入到植物中，其中多核苷酸的表達導致草甘膦耐受性或抗性。借 助該方法產生的植物能夠用有效濃度的除草劑處理，並展示出對該除草劑的增加的耐受 性。本申請中除草劑的「有效濃度」是足以使天然不具有除草劑抗性或未曾被賦予除草劑 抗性的植物或植物部分的生長減慢或停止的量。
H.控制大田中雜草的方法
本發明還提供了選擇性地控制含植物的大田中的雜草的方法。在一個實施方案 中，植物種子或植物由於所述植物種子或植物中插入了本文公開的grg多核苷酸而為草甘 膦抗性的。在一個特定方法中，用有效濃度的除草劑處理植物，其中除草劑施用導致選擇性 地控制雜草或其他未轉化的植物。「有效濃度，，是指，控制雜草或其他未轉化植物的生長或 擴散、而不會顯著影響草甘膦抗性植物或植物種子的濃度。目的除草劑的此有效濃度在本 領域普遍已知。可以在出苗前或者出苗後，按照除草劑施用的通常技術，對大田施用除草 劑，其中所述大田包含已經被賦予了抗除草劑抗性的植物或植物種子。
I.溫度譜
已經進行了植物中草甘膦代謝的若干研究，並揭示植物不代謝草甘膦或者代謝 極其緩慢。草甘膦可以迅速穿透角質層，並經過一個相當長的時間轉移到整個植株(在 Kearney 禾口 Kaufman 編輯(1988)Herbicides ；Chemistry, Degradation & Mode of Action Marcel Dekker, Inc.，New York, 3 :1_70，以及 Grossbard 禾口 Atkinson 編輯(1985)The Herbicide GlyphosateButterworths，London，25-34 頁中綜述)。因而，很可能在農業經濟 意義植物中在接觸草甘膦後持續的一段時間內草甘膦耐受性是必要的。在生長季期間溫度 頻繁超過30°C的情況下，採用在升高溫度時維持活性的草甘膦耐受性EPSP合酶將是有利 的。
在本發明的一個實施方案中，EPSP合酶在高於或低於周圍環境溫度的溫度時呈現 出熱穩定性。「熱穩定性」表示酶在高於或低於周圍環境溫度的溫度時比在該溫度並非熱穩 定的EPSP合酶在更長的時間階段內具有活性。例如，熱穩定的EPSP合酶在高於或低於周 圍環境溫度的溫度時在大於約1小時、大於約2小時、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、 約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約25小時或更長的時間內具有酶活。出於本 發明的目的，「周圍」環境溫度為約30°C。在一些實施方案中，高於周圍溫度是是指等於或 高於約 32°C、約 34°C、約 37°C、約 40 °C、約 45°C、約 50°C、約 55°C、約 60°C、約 65°C 或更高 的溫度。低於周圍溫度是指等於或低於約28°C、低於約27°C、約26°C、約25°C、約23°C、約 20°C、約18°C、約15°C、約10°C、或等於或低於約5°C，或0°C左右的溫度。測定EPSP合酶活 性的方法在本文別處更詳細地討論。出於本發明的目的，熱穩定的EPSP合酶在以於該酶最 適溫度觀察到的最大活性水平的約90%至100%、約80%至約90%、約70%至約80%、約 60%至約70%、或約50%至約60%發揮功能時視為有活性。
17[0079]因而，本文提供了增加在高於周圍環境溫度的溫度時的草甘膦耐受性的方法和組 合物。在一個實施方案中，所述方法包括向植物中引入編碼SEQ ID NO :7-28中任一所示草 甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列，並在高於周圍環境溫度的溫度培養植物。在具體實施 方案中，在植物生長季，培養溫度高於周圍環境溫度平均至少約2小時/天、至少約3小時 /天、至少約4小時/天、至少約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約14、約16、約 18、約20、至少約22小時/天或高達約24小時/天。
在另一實施方案中，所述方法包括向植物中引入編碼SEQ ID N0:7_28中任一所示 草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列，使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸，並在向 植物施用草甘膦之後，以至少1小時、至少約2小時、至少約3、至少約4或更長小時/天，在 超過周圍環境溫度的溫度培養植物，為期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20或更多天，其中溫度超過周圍環境溫度的天出現在植物生長季期間。
提供如下實施例作為舉例說明而非限制。
實驗
實施例1. GRG31的Q環華標
2007年1月10日遞交的美國專利申請No. 11/651，752 (在此併入作為參考)公開 了 Q環是賦予EPSP合酶草甘膦抗性的重要區域。Q環定義為自對應於SEQ ID N0:5(GRG1) 胺基酸位置81的丙氨酸至對應於SEQ IDN0 5胺基酸位置102的亮氨酸的區域，其中Q環 的「核心」定義為SEQ IDN0 5的胺基酸位置84-99。
本文對此核心區域中的胺基酸給予位置編號，以簡化對此區域每個胺基酸的引 述。因而，GRG31Q 環核心(I-D-I-G-P-A-G-T-A-M-R-F-L-T-A-Y)的位置對應於 GRG31 (SEQ ID N0:2)的胺基酸73-88，並在本文指定如下
表1. Q環核心胺基酸的位置坐標的指定
18
實施例2. SynRrR31設計和表汰
設計併合成編碼GRG31蛋白(美國專利申請No. 11/760, 570，2007年6月8 日遞交，在此全文併入作為參考)的新基因序列。此序列在本文提供為SEQ ID NO 6。此開放讀框在本文命名為「Syngrg31」，通過本領域已知的方法克隆到表達載體 pRSFlb (Invitrogen)中。
實施例3. GRG31的定點誘變
美國專利申請No. 11/762，580，2008年6月13日遞交，在此全文併入作為參考，描 述了產生多樣性的方法。此方法在本文稱為「全排列誘變」(permutational mutagenesis)。 利用其他草甘膦抗性EPSPS酶中存在的Q環多樣性設計了 GRG31的全排列文庫。
開發了草甘膦生長篩選法。發現含有GRG31表達構建體(pAX1945 ;GRG31在 pRSFlb中)的BL21女DE3細胞在含有高達50mM草甘膦的瓊脂板(1XM63基本培養基； 0. 05mM IPTG ；50ug/ml卡那黴素)上生長。將文庫1克隆到pAX1945的Mfel和AlwNl限 制性位點之間。
克隆pAX3625含有grg31變體，其具有符合讀框的終止密碼子，該密碼子破壞了GRG31的開放讀框。因而，pAX3625並不賦予草甘膦抗性。利用pAX3625作為載體進行GRG31 文庫的後續克隆和篩選，因為含PAX3625的大腸桿菌細胞不會在含草甘膦的瓊脂板上生 長，除非pAX3625的Q環盒已被替換為草甘膦抗性Q環。
將文庫1克隆到pAX3625中，將130，000個克隆鋪到含50mM草甘膦的板上。1. 5 天后，由在草甘膦板上的生長，選擇到三十一個(31)草甘膦抗性克隆。製備提取物並通過 在小量草甘膦濃度(0、1和2mM草甘膦)存在下測定活性來評估草甘膦抗性。在此預篩 中，6 個克隆鑑定為具有最好活性GRG31pm3all、GRG31pm3a6、GRG31pm3a8、GRG31pm3b8、 GRG31pm3b9 和 GRG31pm3d3(分別是 SEQ ID NO :7、8、9、10、11 和 12)。
這些克隆共有在Q環位置3上異亮氨酸到半胱氨酸的取代。有意思的是，GRG1在 此位置上也含有半胱氨酸。對來自這6個克隆的提取物測定在一系列PEP濃度(0、20、50 和100 u M PEP)時的活性。克隆3all和3b8在低PEP濃度時顯示出最好活性，並進行了純 化。克隆3b8相對於野生型GRG31顯示出提高的& (116 ii M)。
表2.克隆3b8的胺基酸變化
克隆胺基酸變化3b8175 — C ；P77 — N ；M82 — T ；
實施例4. GRG31文庫3
4個Q環位置(位置5、9、10和16)鑑定為能夠接受變異，選擇之在組合文庫中進 行隨機化。此文庫命名為文庫3。
文庫3克隆到PAX3625中，對未選擇的克隆進行測序，發現文庫中已經摻入了所述 的多樣性。
11萬5千(115，000)個克隆鋪到含50mM草甘膦的板上，挑取了 384個草甘膦抗 性克隆進行測序。通過這些克隆的Q環區域的測序，鑑定到五十三個(53)獨特的序列。通 過測試在0和0. 2mM草甘膦時的活性進行了所述獨特克隆的&評估。根據該評估，鑑定了 具有最高草甘膦抗性增加跡象的九個(9)克隆。通過比較0、20和50yM PEP時的活性對 這9個克隆所編碼蛋白質的&進行了評估。通過這些評估鑑定了克隆L3P2bll(SEQ IDN0 13)和L3P2cll(SEQ ID NO 14)具有草甘膦抗性和低PEP濃度時的活性的最佳組合。還選 擇了克隆L3P2dll(SEQ ID NO 15)進行進一步研究。L3P2cll含有在Q環位置16上的單 個胺基酸變化
表3.
(Y88-F)。
GRG31變體的胺基酸變化
克隆胺基酸變化L3P2bllP77—Q; A81-^S; M82->L Y88 一 FL3P2cllY88—FL3P2dllM82—F; Y88一L
20[0104]實施例5. GRG31文庫4
生成了命名為文庫4的全排列文庫(permutational library)，並克隆到pAX3625 中。3萬5千個(35，000)克隆鋪到含50mM草甘膦的板上，並從篩選的該組克隆中鑑定到 二十三個(23)獨特的克隆。製備來自這23個克隆的提取物，並通過測試0、0. 2和0. 5mM草 甘膦時其編碼蛋白質的活性進行&評估。選擇了 9個克隆，並評估0、20和50 PM PEP時其 編碼蛋白質的Km。在這些測試中克隆L4ell(SEQ ID NO 16)鑑定為具有有利性能的克隆。 純化了 L4ell蛋白質，並確定了其動力學性能。與本文所述其他GRG31變體相比較，L4ell 的動力學示於表5。
實施例6. GRG31變體L5e3的分離
從其中Q環位置2、3、4、5、6、7、9、10、14、15和16誘變的GRG31變體文庫中分離了 能夠賦予對50mM草甘膦的抗性的獨特克隆。對這些變體如之前的文庫那樣測試Km和、並 對若干克隆進行更詳細的動力學表徵。一個這樣的克隆L5E3(SEQ ID NO 17)具有在GRG31 胺基酸77處脯氨酸至蘇氨酸的單個胺基酸變化。根據表1，此胺基酸改變對應於Q環位置 5。
表4. GRG31變體的胺基酸變化
實施例7. GRG31變體的動力學分析
通過如本文所述的酶測定法，表徵了 GRG31變體L3P2bll、L3P2cll和L4ell以及 L5e3，並與天然GRG31酶進行了比較。對於每種酶，確定了在幾個草甘膦濃度之每一個處的 表觀Km(Km(app))，並利用Km(app)對草甘膦濃度的曲線來計算每種酶的&。通過在37°C孵育酶 16小時來評估每種酶的熱穩定性，然後相對於4°C孵育的對照酶來定量殘留酶活(按Vmax計)。
動力學分析揭示，克隆L3P2bll、L3P2cll和L4ell相對於GRG31具有改善的動力 學性能，如表5所示。
表5.與其他GRG31變體相比較的L4ell動力學
表6. GRG31變體中Q環變化的位置
克隆L3P2bll、L3P2cll和L4ell相對於GRG31顯示出改善的Ki0
觀察表6，說明每一種動力學性能改善的GRG31Q環變體要麼具有位置16上的突變 (優選該位置上突變成苯丙氨酸)，要麼是位置5上的突變。表6中的每一種突變都具有大 為改進的&，和改進的針對磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km。這種觀察結果與這些變體中至少 部分地因PEP結合親和力提高所致的抗性機制相符。PEP受草甘膦的競爭性抑制，而提高 的PEP親和力將導致存在草甘膦時表觀Km的減小，以及由此更高的&。有意思的是，這些克 隆中的每一種都相對於GRG31具有減小的V_，與此區域改變能夠破壞蛋白質摺疊的觀察 結果相符。不過，針對這些蛋白質觀察到的Vmax仍然足以使這些蛋白質賦予大腸桿菌細胞 對高草甘膦濃度的抗性。如果期望這些變體的Vmax提高，可實施如本文所提供的誘變和篩 選策略(包括Q環外的區域)，並選擇呈現出V_提高的變體。此類策略已經證明對類似的 EPSP合酶有效(參見美國專利申請No. 11/762，526，2007年6月13日遞交，在此全文併入 作為參考)。可選地，可以產生提高EPSPS例如GRG31蛋白的摺疊和/或熱穩定性的突變，然後組合這些突變，並測試具有變體諸如L3P2bll、L3P2cll、L3P2dll、L4ell和/或L5e3的 提高的結合特性，但還具有Vmax方面的改進的變體。
為提高GRG31的熱穩定性，進行GRG31的易錯PCR誘變。4萬5千個(45，000)克 隆鋪到50mM草甘膦板上，並挑取九十五個(95)克隆。製備提取物，並測試增加的熱穩定性。 2個克隆(6b2，SEQ ID N0:18jP6e7，SEQ ID NO 19)鑑定為具有增加的熱穩定性。序列 分析顯示，相對於GRG31，克隆6b2含有兩個突變(N95S和A206V)，而克隆6e7含有1個突 變(E215K)。
表7.具有提高的熱穩定性的GRG31變體的胺基酸變化
分子建模表明，這三個突變位置位於GRG31的表面。
為進一步研究這些位置上不同取代的貢獻，在對應於GRG31胺基酸位置95、206和 215的位置上產生幾個點突變。在37°C測試了點突變體提取物的熱穩定性
表8. GRG31變體的熱穩定性
在分開的實驗中，分析了更多的殘基變化。
表9. GRG31變體的熱穩定性
23
數據表明，點突變N95S和A206V兩者均有助於增加的穩定性。
培養3 個變體(6b2、6e7、以及三聯EK(N95S A206V E215K ；SEQ IDN0 :20))，純化其 蛋白質，並更詳細地分析所述蛋白質的熱穩定性。數據(表10)表明，變體6b2、6e7以及三 聯突變體與野生型GRG31相比具有增加的熱穩定性。
表10. GRG31變體的熱穩定性
實施例9. GRG31變體的動力學
還利用純化的蛋白質確定了 6e2、6b2和三聯EK變體的動力學特性，並測試了蛋白 質的溶解性。結果示於表11。所有三個變體6e7、6b2和三聯EK編碼的蛋白質相對於GRG31 具有針對PEP的改進的(更低的)Km。而且，6e7還具有提高的V_。
表11. GRG31變體的動力學特性[0137]
克隆6e7值得注意，因為其Vmax比GRG31提高2倍。
因而，這些改進的克隆可以適於與在其他動力學性能方面(例如針對PEP的Km或 就草甘膦而言的具有改進的其他變體組合。
實施例10.組合熱穩定件改講與動力學改講
設計GRG31變體，將6e7、6b2和三聯EK突變中鑑定到的熱穩定性改進突變摻入到 L3P2bll或L3P2cll變體中。如表12所示，L3P2cll+6e7 (SEQ ID NO 21)編碼的蛋白質相 對於GRG31具有2個變化。如表12所示，L3P2bll+6e7(SEQ ID NO 22)編碼的蛋白質相對 於GRG31具有5個變化。如表12所示，L3P2cll+三聯EK(SEQ ID NO 23)編碼的蛋白質相 對於GRG31具有4個變化。如表12所示，L3P2bll+三聯EK(SEQ ID NO 24)編碼的蛋白質 相對於GRG31具有7個變化。如表12所示，L3P2cll+6b2(SEQ ID NO 25)編碼的蛋白質相 對於GRG31具有3個變化。L3P2bll+6b2(SEQ ID NO 26)編碼的蛋白質相對於GRG31具有 6個變化。
表12. GRG31變體的胺基酸變化
表13. GRG31變體的動力學
表13顯示，具有組合突變的變體的性能優於具有任一單組改變的變體。
變體GRG31(L3P2cll+6e7)和GRG31 (L3P2cll+6b2)呈現出超過4倍改進的對草甘 膦的&，大約兩倍改進的針對PEP的Km，以及大約等同於GRG31並且相對於GRG31(L3P2cll) 蛋白約4-5倍改進的Vmax。
實施例11. GRG31變體的熱穩定件
通過測量37°C的殘存活性，分析了若干GRG31變體的熱穩定性。雖說L3P2cll+三 聯EK顯示出等同於GRG31的熱穩定性，但L3P2cll+6b2和L5E3兩種均顯示出提高的穩定 性。因而，這兩個克隆具有改進的性能更高的草甘膦&，和37°C改進的熱穩定性。
表14. GRG31在37 °C的半衰期
實施例12. GRG36的改講
將編碼GRG36(SEQ ID NO :4)、優化用於植物表達的基因(稱為「syngrg36」，如 2007年6月27日遞交的美國專利申請No. 11/769，327所述)克隆到植物轉化質粒pAG3532 中。該質粒用作為模板利用Mutazyme II系統(Stratagene)進行易錯PCR，以向syngrg36 中引入隨機突變。模板在易錯PCR反應中進行1 50稀釋，且擴增進行30個循環。利用此 載體中位於syngrg36側翼(T7啟動子，T7終止子)的PCR引物。PCR產物以BamHI和sgs I在Tango緩衝液中消化，凝膠純化，並連接到細菌表達載體pRSF-lb載體中，以創建誘變了 的grg36文庫。
syngrg36DNA文庫轉化到大腸桿菌菌株BL21 * DE3 star (Invitrogen)中以誘導 蛋白質表達。轉化後，將單菌落鋪到含25mM草甘膦的1XM63培養基中，以選擇保留酶活和 生長耐受性的克隆。挑取單菌落，並排列到384孔板中，以創建誘變了的文庫進行酶活篩 選。以這種方式創建2個384孔板。酶活篩選進行如下將文庫克隆種在含LB培養基的 96孔深孔板中，並培養至A600 = 0. 6。然後添加IPTG(0. 5mM)，並在20°C過夜孵育深孔板， 以誘導蛋白質表達。接下來，利用POPCULTURE 試劑(Novagen)由各單個培養物制 備蛋白質提取物，並如2007年1月10日遞交的美國專利申請No. 11/651，752 (在此全文併入作為參考)所公開的那樣測量酶活。通過這種方法，鑑定到6個提取物，其擁有的酶活比 一同測試的野生型GRG36樣品的平均值高2個標準差。對這些克隆中的每一個進行DNA測 序，並發現每一個都在GRG36中攜帶突變。選擇這6個進行進一步表徵。
6個改進克隆中的每一個都在250mL LB培養液中培養和誘導。誘導後，每一種 GRG36蛋白變體都通過親和層析純化到鈷樹脂(Novagen)上。純化的蛋白質在37°C加熱 0、4和6小時後測試酶活。一種GRG36蛋白質變體，稱為GRG36 (ace7) (SEQ ID NO 27)，由 syngrg36 (ace7) (SEQ IDN0 29)編碼，發現在37°C擁有比野生型GRG36酶高7. 5倍的熱穩 定性。另一種 GRG36 蛋白質變體，稱為 GRG36 (ace8) (SEQ ID NO 28)，由 syngrg36 (ace8) (SEQ ID NO 30)編碼，發現擁有比野生型GRG36高2. 5倍的熱穩定性。結果總結於表15
表15.GRG36酶在37°C的半衰期
另外，進行酶測定試驗，以計算底物結合親和力(KJ、草甘膦結合og以及酶速率 (Vfflax)的動力學常數。簡言之，用底物磷酸烯醇式丙酮酸滴定每一種酶，並相對於底物濃度 繪製線性酶速率曲線圖。通過此曲線擬合Michaelis-Menton方程，以計算產生半數最大速 率的底物濃度(KJ，且用飽和底物時獲得的最大速率除以酶濃度以得出V_。接下來，在不 同的草甘膦濃度進行另外的底物滴定，並相對於草甘膦濃度，繪製在每種草甘膦濃度時的 表觀結合常數(K。bs)的圖，得到直線。&測量為(-)x-截距。對於酶GRG36(ace7)，未進行 完整的&測量，但在ImM草甘膦時觀察到GRG36和GRG36 (ace7)之間非常相似的活性，提 示這兩種酶擁有相似的草甘膦結合性能。
表16. GRG36酶的動力學數值
t施徹丨13. grg奪體至付首物表汰念中
對於本文所述的每一種grg變體，通過PCR從全長DNA模板擴增開放讀框(0RF)。 PCR期間在0RF的每一端添加Hind III限制性位點。另外，在緊鄰基因起始密碼子的
275，處添加核苷酸序列ACC，以增加翻譯效率(Kozak(1987)NucleicAcids Research 15: 8125-8148 Joshi (1987) NucleicAcids Research 15 :6643_6653)。PCR 產物利用本領域公 知的技術進行克隆和測序，以確保PCR期間不引入突變。
含PCR產物的質粒用Hind III消化，並分離含完整0RF的片段。此片段克隆到 質粒的Hind III位點，所述質粒例如pAX200，一種含有稻肌動蛋白啟動子(McElroy等 (1991)Molec. Gen. Genet. 231 150-160)和 Pinll 終止子(An 等(1989)The Plant Cell 1 115-122)的植物表達載體。然後將來自此中間質粒的啟動子-基因-終止子片段亞克隆到 質粒pSBllCJapanTobacco，Inc.)中，以形成最終基於pSBll的質粒。在一些情況下，可能 優選生成備選構建體，其中葉綠體前導序列以與grg構建體N-端的融合物形式編碼。這些 基於PSB11的質粒一般這樣組織，從而含有啟動子_基因-終止子構建體或啟動子_葉綠 體前導序列_基因-終止子構建體的DNA片段，可以通過限制性酶如Kpnl和Pmel的雙消 化而被切出，並通過氣溶膠束注射而轉化到植物中。所得基於PSB11的克隆的結構通過限 制性消化和凝膠電泳以及通過跨各克隆接合點的測序來驗證。
利用本領域公知的三親交配法，將質粒轉移到還持有質粒pSBl的根癌農桿菌菌 株LBA4404(Japan Tobacco, Inc.)中，並鋪到含壯觀黴素的培養基板上。基於pSBll的質 粒克隆攜帶壯觀黴素抗性，但屬於窄宿主範圍質粒，不能夠在農桿菌中複製。當基於pSBll 的質粒通過同源重組整合到寬宿主範圍質粒pSBl中時，產生壯觀黴素抗性菌落。pSBl和基 於pSBll的質粒的共整合產物通過Southern雜交來驗證。持有所述共整合體的農桿菌菌 株用來通過本領域已知的方法轉化玉蜀黍，例如像Purelntro法(JapanTobacco)。
實施例14.通過農桿菌介導的轉化法轉化植物細胞
玉米穗最好在授粉後8-12天收集。從穗中分離胚，並優選0. 8-1. 5mm大小的那些 胚用於轉化。胚盾片面向上放在適宜的孵育培養基上，例如DN62A5S培養基(3.98g/L N6 鹽；lml/L(1000X貯液)N6維生素；800mg/LL-天冬醯胺；100mg/L肌醇；1. 4g/L L-脯氨 酸；100mg/L酪蛋白胺基酸；50g/L蔗糖；lml/L (lmg/ml貯液)2，4_D)。不過，除DN62A5S之 外的培養基和鹽也適宜，並且是本領域已知的。胚在黑暗中25°C孵育過夜。不過，本質上並 不需要孵育胚過夜。
所得的外植體轉移到載網(30-40/板)上，轉移到滲透培養基上約30-45分鐘，然 後轉移到beaming plate上(參見例如PCT公開號W0/0138514和美國專利No. 5，240，842)。
設計用來在植物細胞中表達本發明GRG蛋白質的DNA構建體，利用基本上如PCT 公開號W0/0138514中所述的條件，利用氣溶膠束加速器加速進入到植物組織中。氣溶膠束 處理後，胚在滲透培養基上孵育約30分鐘，然後置於孵育培養基上25°C黑暗過夜。為避免 過度地損傷經氣溶膠束處理的外植體，在向恢復培養基轉移之前孵育至少24小時。然後將 胚鋪在恢復期培養基上，25°C黑暗約5天，然後轉移到選擇培養基中。外植體在選擇培養基 中孵育長達8周，這取決於所利用的具體選擇的性質和特徵。選擇期之後，將所得的愈傷組 織轉移到胚成熟培養基中，直至觀察到形成成熟的體細胞胚。所得的成熟體細胞胚隨之置 於低光照條件下，並通過本領域已知的方法起始再生過程。允許所得的芽在生根培養基上 生根，並將所得的植株轉移到育苗盆中，作為轉基因植物繁殖。
材料
DN62A5S 培養基[0171]
用IN K0H/1N KC1 調整溶液 pH 至 pH 5. 8，添加 Gelrite (Sigma)至 3g/L，並高壓 滅菌。冷卻到50°C之後，添加2ml/L的5mg/ml硝酸銀貯液(Phytotechnology Labs)。所 述配方支持約20個板。
實施徹丨is. mH^m^mmimm EPSP
穗最好在授粉後8-12天收集。從穗中分離胚，並優選0. 8-1. 5mm大小的那些胚用 於轉化。胚盾片面向上置於適宜的孵育培養基中，並在黑暗中25°C孵育過夜。
不過，本身並不需要過夜孵育胚。胚與含有具有本發明EPSP合酶的適當載體的 農桿菌菌株接觸，進行Ti質粒介導的轉移約5-10分鐘，然後鋪在共培養培養基上約3天 (25°C黑暗中)。共培養後，外植體轉移到恢復期培養基中約5天(25°C黑暗中)。外植體在 選擇培養基中孵育長達8周，這取決於所利用的具體選擇的性質和特徵。選擇期之後，將所 得的愈傷組織轉移到胚成熟培養基中，直至觀察到形成成熟的體細胞胚。所得的成熟體細 胞胚隨之置於低光照條件下，並如本領域已知的那樣起始再生過程。允許所得的芽在生根 培養基上生根，並將所得的植株轉移到育苗盆中，作為轉基因植物繁殖。
本說明書中提及的所有出版物和專利申請指示了本發明所述領域技術人員的技 術水平。所有出版物和專利申請在此併入作為參考，就如同每一篇單獨出版物或專利申請 明確單獨地說明併入作為參考一樣。
雖然出于澄清理解的目的，已經通過舉例說明和實施例的方式對前述發明進行了 一些詳細的說明，但是顯然可以在所附權利要求
書的範圍內進行某些變化和改動。
權利要求
由編碼草甘膦耐受性EPSP合酶的分離的核酸分子組成的組合物，其中所述核酸分子選自下組a)編碼SEQ ID NO2的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一或多個殘基i)與SEQ ID NO2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基；ii)與SEQ ID NO2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；iii)與SEQ ID NO2胺基酸位置77相對應位置上的天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；iv)與SEQ ID NO2胺基酸位置78相對應位置上的絲氨酸殘基；v)與SEQ ID NO2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；vi)與SEQ ID NO2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；vii)與SEQ ID NO2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；viii)與SEQ ID NO2胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；ix)與SEQ ID NO2胺基酸位置88相對應位置上的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨酸殘基；x)與SEQ ID NO2胺基酸位置95相對應位置上的絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；xi)與SEQ ID NO2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；和xii)與SEQ ID NO2胺基酸位置215相對應位置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基；和b)編碼SEQ ID NO4的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一或多個殘基i)與SEQ ID NO4胺基酸位置90相對應位置上的異亮氨酸殘基；ii)與SEQ ID NO4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘基；iii)與SEQ ID NO4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和iv)與SEQ ID NO4胺基酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基。
2.權利要求
1的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已經設計用於在植物中表達 的合成序列。
3.含有權利要求
1的核酸分子的載體。
4.含有權利要求
3的載體的宿主細胞。
5.權利要求
4的宿主細胞，其為細菌宿主細胞或植物宿主細胞。
6.含有權利要求
1的核酸分子的轉基因種子。
7.由分離的多肽組成的組合物，所述多肽包含選自下組的草甘膦耐受性EPSP合酶 a) SEQ ID NO 2的變體，其中所述變體包含如下一個或多個殘基i)與SEQID NO 2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基；ii)與SEQID NO 2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；iii)與SEQID NO :2胺基酸位置77相對應位置上的天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇 氨酸殘基；iv)與SEQID NO 2胺基酸位置78相對應位置上的絲氨酸殘基；ν)與SEQ ID NO 2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；vi)與SEQID NO :2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯丙氨 酸殘基；vii)與SEQID NO 2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；viii)與SEQID NO 2胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；ix)與SEQID NO :2胺基酸位置88相對應位置上的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨 酸殘基；x)與SEQID NO 2胺基酸位置95相對應位置上的絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；xi)與SEQID NO 2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯 胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；和xii)與SEQID NO :2胺基酸位置215相對應位置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨 酸或蘇氨酸殘基；和b)SEQ ID NO :4的變體，其中所述變體包含如下一個或多個殘基i)與SEQID NO 4胺基酸位置90相對應位置上的異亮氨酸殘基；ii)與SEQID NO 4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘基；iii)與SEQID NO 4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和iv)與SEQID NO :4胺基酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基。
8.由具有穩定整合至其基因組中的DNA構建體的植物組成的組合物，所述DNA構建體 含有編碼具有草甘膦耐受性活性的蛋白質的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自下組a)編碼SEQID NO 2的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基i)與SEQID NO 2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基；ii)與SEQID NO 2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；iii)與SEQID NO :2胺基酸位置77相對應位置上的天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇 氨酸殘基；iv)與SEQID NO 2胺基酸位置78相對應位置上的絲氨酸殘基；ν)與SEQ ID NO 2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；vi)與SEQID NO :2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯丙氨 酸殘基；vii)與SEQID NO 2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；viii)與SEQID NO 2胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；ix)與SEQID NO :2胺基酸位置88相對應位置上的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨 酸殘基；x)與SEQID NO 2胺基酸位置95相對應位置上的絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；xi)與SEQID NO 2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯 胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；和xii)與SEQID NO :2胺基酸位置215相對應位置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨 酸或蘇氨酸殘基；和b)編碼SEQID NO :4的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基i)與SEQID NO 4胺基酸位置90相對應位置上的異亮氨酸殘基；ii)與SEQID NO 4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘基；iii)與SEQID NO 4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和iv)與SEQID NO :4胺基酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基；其中所述核苷酸序列有效連接於驅動編碼序列在植物細胞中表達的啟動子上。
9.權利要求
8的組合物，其中所述植物是植物細胞。
10.權利要求
9的組合物，其中所述植物選自下組玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、番茄、 十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥和油菜籽油菜。
11.權利要求
1-10中任一項的組合物，其中所述SEQID NO :2的變體選自下組SEQ ID NO :7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 和 26。
12.權利要求
1-10中任一項的組合物，其中所述SEQID NO :4的變體選自SEQ ID NO: 27 或 28。
13.產生具有草甘膦耐受性活性的多肽的方法，包括在編碼所述多肽的核酸分子表達 的條件下培養權利要求
4的宿主細胞。
14.賦予植物草甘膦耐受性的方法，所述方法包括用DNA構建體轉化所述植物，所述構 建體含有驅動在植物細胞中表達的啟動子，所述啟動子有效連接於編碼草甘膦耐受性EPSP 合酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自下組a)編碼SEQID NO 2的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基i)與SEQID NO 2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基；ii)與SEQID NO 2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；iii)與SEQID NO :2胺基酸位置77相對應位置的上天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇 氨酸殘基；iv)與SEQID NO 2胺基酸位置78相對應位置上的絲氨酸殘基；ν)與SEQ ID NO 2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；vi)與SEQID NO :2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯丙氨 酸殘基；vii)與SEQID NO 2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；viii)與SEQID NO 2胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；ix)與SEQID NO :2胺基酸位置88相對應位置上的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨 酸殘基；x)與SEQID NO 2胺基酸位置95相對應位置上的絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；xi)與SEQID NO 2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯 胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；和xii)與SEQID NO :2胺基酸位置215相對應位置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨 酸或蘇氨酸殘基；和b)編碼SEQID NO :4的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基i)與SEQID NO 4胺基酸位置90相對應位置上的異亮氨酸殘基；ii)與SEQID NO 4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘基；iii)與SEQID NO 4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和iv)與SEQID NO :4胺基酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基；和再生轉化的植物。
15.增加植物活力或產量的方法，包括a)向所述植物中引入包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼具有高於周圍 環境溫度的最適溫度的草甘膦耐受性EPSP合酶，其中所述核苷酸序列選自下組i)編碼SEQ ID NO 2的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基1)與SEQID NO 2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基；2)與SEQID NO 2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；3)與SEQID NO :2胺基酸位置77相對應位置上的天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇氨 酸殘基；4)與SEQID NO 2胺基酸位置78相對應位置上的絲氨酸殘基；5)與SEQID NO 2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；6)與SEQID NO :2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；7)與SEQID NO 2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；8)與SEQID NO 2胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；9)與SEQID NO :2胺基酸位置88相對應位置上的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨酸 殘基；10)與SEQID NO :2胺基酸位置95相對應位置上的絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；11)與SEQID NO :2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯 胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；和12)與SEQID NO :2胺基酸位置215相對應位置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨 酸或蘇氨酸殘基；和 )編碼SEQ ID NO :4的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基1)與SEQID NO 4胺基酸位置90相對應位置上的異亮氨酸殘基；2)與SEQID NO 4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘基；3)與SEQID NO 4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和4)與SEQID NO 4胺基酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基；b)使所述植物與有效濃度的草甘膦接觸；和c)在接觸所述草甘膦之後，在每天至少連續2小時溫度高於周圍環境溫度的條件下培 養所述植物至少4天，其中所述接觸後的天數在植物的生長季內，其中所述植物的活力或產量與表達最適溫度不高於周圍環境溫度的草甘膦耐受性 EPSP合酶的植物的活力或產量相比更高。
16.賦予植物草甘膦抗性的方法，包括a)向所述植物中引入包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼草甘膦耐受性 EPSP合酶，其中所述核苷酸序列選自下組i)編碼SEQ ID NO 2的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基1)與SEQID NO 2胺基酸位置75相對應位置上的半胱氨酸殘基；2)與SEQID NO 2胺基酸位置76相對應位置上的天冬氨酸殘基；3)與SEQID NO :2胺基酸位置77相對應位置上的天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺或蘇氨 酸殘基；4)與SEQID NO 2胺基酸位置78相對應位置上的絲氨酸殘基；5)與SEQID NO 2胺基酸位置81相對應位置上的絲氨酸或甘氨酸殘基；6)與SEQID NO :2胺基酸位置82相對應位置上的纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸殘基；7)與SEQID NO 2胺基酸位置86相對應位置上的丙氨酸殘基；8)與SEQID NO 2胺基酸位置87相對應位置上的甘氨酸殘基；9)與SEQID NO :2胺基酸位置88相對應位置上的苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或組氨酸 殘基；10)與SEQID NO 2胺基酸位置95相對應位置上的絲氨酸、穀氨醯胺或蘇氨酸殘基；11)與SEQID NO :2胺基酸位置206相對應位置上的纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯 胺、穀氨酸或蘇氨酸殘基；和12)與SEQID NO :2胺基酸位置215相對應位置上的賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨 酸或蘇氨酸殘基；和 )編碼SEQ ID NO :4的變體的核苷酸序列，其中所述變體包含如下一個或多個殘基1)與SEQID NO 4胺基酸位置90相對應位置上的異亮氨酸殘基；2)與SEQID NO 4胺基酸位置145相對應位置上的穀氨醯胺殘基；3)與SEQID NO 4胺基酸位置350相對應位置上的蘇氨酸殘基；和4)與SEQID NO 4胺基酸位置410相對應位置上的甲硫氨酸殘基；b)使所述植物與有效濃度的草甘膦接觸；和c)在接觸所述草甘膦之後，在每天至少連續2小時溫度高於周圍環境溫度的條件下培 養所述植物至少4天，其中所述接觸後的天數在植物的生長季內。
17.權利要求
13-16中任一項的方法，其中所述SEQID NO 2的變體選自下組SEQ ID NO :7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 和 26。
18.權利要求
13-16中任一項的方法，其中所述SEQID NO 4的變體選自SEQ ID NO 27 或 28。
19.權利要求
15、16、17或18中任一項的方法，其中步驟(c)中的溫度是約32°C至約 60 "C。
20.權利要求
19的方法，其中步驟(c)中的溫度是約37°C。
專利摘要
本發明提供賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子除草劑抗性或耐受性的組合物和方法。組合物包括編碼除草劑抗性或耐受性多肽的多核苷酸，含有那些多核苷酸的載體，以及含有載體的宿主細胞。本發明的核苷酸序列可用在DNA構建體或表達盒中用於轉化生物體，包括微生物和植物，和在其中表達。組合物還包括轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。本發明尤其是提供了編碼草甘膦抗性或耐受性多肽的分離的多核苷酸，特別是SEQ ID NO2和4的多肽變體。另外，本發明涵蓋與所述多核苷酸對應的胺基酸序列。尤其是本發明提供了分離的多核苷酸，其含有編碼SEQ ID NO7-28中所示胺基酸序列的核苷酸序列、或者SEQ ID NO29或30中所示的核苷酸序列。
文檔編號C12N9/10GKCN101932701SQ200980103634
公開日2010年12月29日 申請日期2009年1月30日
發明者B·范迪博格, L·C·斯考滕, V·海因裡希斯 申請人:阿森尼克斯公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan