篩選抗體表達細胞的方法

2023-05-07 11:33:01

專利名稱：：篩選抗體表達細胞的方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術的抗體生成領域。本發明的一個目的是設計一種篩選抗體生成細胞的方法以及對細胞系穩定性進行評估的方法。篩選相對於非抗體生成細胞的抗體生成細胞，特別是篩選一種高效抗體生成細胞系在任何生物過程的研發過程均是非常重要的第一步。對於由動物細胞生成蛋白質，這些傳統上篩選出的細胞系已經經過多輪有限稀釋克隆以及隨後的產品分析所分離出來。這種傳統過程非常耗時而且比較昂貴。為了提高克隆的理論可信度需要進行兩輪克隆。克隆對於避免由於低生成力變種所導致的高產細胞的過度生長是很重要的，所述低生成力變種通常具有比高產細胞還要高的生長率。總體上，完成傳統過程需要超過8個月的時間。而且，實際需要考慮的事項限制了事實上所篩選出的細胞數，這就使得只能憑運氣才能檢測出低豐度的高產細胞克隆。在研發過程中，對細胞系穩定性進行評價需要進一步的分析克隆，其需要花費6到7個星期的時間。另外，分析克隆涉及對200-300個克隆進行評估，與可以藉助流式細胞術對數千個克隆所進行的分析相比，其提供了一個關於非生成群體的大小的更加詳細和準確的圖象。以前所報導的分泌檢測的靈敏度較低，不足以對不同的亞種群進行分辨，從而不能對不同的亞種群進行量化。流式細胞術(FC)使得對大量細胞的生產力進行監測成為可能，並且可以分離出適當的單個細胞。流式細胞術需要用螢光團標記細胞，在流式細胞術中對細胞的螢光進行定量，並且與所需要的特性相關聯。然而，在細胞系表面所顯示的膜結合抗體的數量與該細胞系的可溶性抗體的分泌率之間的相關性不是很好(Meilhoc等，流式細胞計數測量表面IgG在低血清或無血清培養基中的鼠雜交瘤細胞系合成和分泌單克隆抗體的動力學分析中的應用(ApplicationofflowcytometricmeasurementofsurfaceIgGinkineticanalysisofmonoclonalantibodysynthesisandsecretionbymurinehybridomacell-lineinlowserumandserum-freemedia)，Hybridoma9，67-175)。因此，簡單地用檢測抗體對所顯示的抗體進行染色不能有效地分離出高產的細胞克隆。為了解決該問題，選擇了兩個本質上完全不同的方法，以直接篩選分泌抗體的高效生成細胞。在第一種方法中，單個細胞及其分泌的抗體被包囊在凝膠滴中。然後對整個凝膠滴進行標記，並通過FC進行分類。該方法的缺點在於，該方法對用戶來說不是很友好，即為了確保凝膠滴中只含有單個細胞，只有5％的凝膠滴中包含一個細胞，而所分析的大約95％的凝膠顆粒中不含細胞。另外，包囊/去包囊可以導致一些通常用於重組蛋白質表達的細胞類型的生存能力降低，最顯著的是骨髓瘤(meyeloma)NSO細胞。在第二種方法中，通過在細胞表面人工製造出親合位點或受體，以保留所分泌的受體，然後用FC評估所分泌的抗體數量。Holmes等(J.ofImmunol.methods，230(1999)，141-147)描述了一種在室溫下對質膜蛋白進行生物素化的分析方法。生物素促進第一抗生物素蛋白和第二生物素化捕獲抗體的結合。所述捕獲抗體識別NSO細胞系所分泌的抗體，並將所述抗體固定於細胞表面。將帶有被捕獲的分泌抗體的細胞與第三個用螢光標記的檢測抗體一起培養，用FC進行螢光檢測並對低豐度高產出的細胞克隆進行細胞分類。向培養基中加入一種粘性劑例如膠質以防止克隆之間發生幹擾(即生成細胞所產生的分泌抗體擴散和結合到非生成細胞或者低生成細胞)已經公開的方法的主要缺點在於，其對區分高產和低產細胞，以及對低豐度高產細胞的精確分類具有相對較低的靈敏度。採用已公開的方法不可能檢測到給定細胞系所分泌的嵌合抗體通過捕獲抗體結合到細胞表面。另外，這種捕獲抗體必須來自包括胎兒血清在內的哺乳動物細胞培養物，並且通常用牛血清白蛋白進行穩定，並用作商業抗體製品。因此，使用捕獲抗體會導致克隆細胞培養物有可能被病毒或BSE汙染的風險。本發明的目的是設計出另外一種方法，能有效地從細胞克隆庫中檢測和篩選出適宜的表達抗體的單個細胞。此目的可以通過獨立權利要求1所述的方法達到。附圖中顯示了本發明的可能實施例圖1a分泌抗體的捕獲和檢測原理的示意圖，b捕獲抗體和A蛋白的結合能力的比較圖2對本發明的分泌檢測的樣品進行螢光細胞計數(FC)分析。圖3對分泌檢測的樣品進行螢光細胞計數(FC)分析，其中比較了A蛋白和抗人IgG抗體捕獲分泌抗體的效果。根據本發明，用於篩選分泌第一抗體的細胞的方法包括以下步驟a)將抗生物素蛋白連接至細胞的細胞表面；b)將細胞與一種生物素化多肽進行培養，所述多肽至少包括一個G蛋白或A蛋白的功能性抗體結合域；c)將細胞與第二抗體進行培養，所述第二抗體用螢光標記，其識別並結合第一抗體的抗原表位，培養後，將未結合的第二抗體衝洗掉；d)篩選出結合有一定量的第二抗體的螢光標記的細胞，螢光分析流式細胞術(FC)是優選且方便的。FC允許隨後對螢光標記的細胞進行分類。分泌抗體的生成細胞可以是任何用來分泌抗體的細胞，例如淋巴細胞雜交瘤、骨髓瘤或者CHO細胞。更優選地是，生成細胞是一種骨髓瘤細胞系，最優選地是，它是一種NSO細胞系。因此，抗體可以是任何天然生成的抗體或基因工程抗體或者抗體片段，例如嵌合或單價或雙特異性抗體，包括近期公知的駱駝和羊駝的單重鏈抗體(TrendsBiochem.Scien.(2001)，26，230)。根據本發明，這些抗體優選含有高親和力細菌G蛋白或A蛋白的結合位點，正如不同類(IgG，IgA，IgE，IgM)免疫球蛋白(Ig)的天然Fc部分的位點。優選地，根據本發明的抗體包含IgG的Fc部分。最優選地是，根據本發明的抗體是IgG或者是包含IgG的至少一個重鏈。根據本發明的抗生物素蛋白是常規的鳥類抗生物素蛋白(大約67kD)，或者其它任何功能性的、即結合生物素的同源物質，例如來自鏈黴菌屬的鏈黴抗生物素(60kD)，或任何天然生成的抗生物素的化學或基因工程變種。這些變種的一個例子是Neutravidin(Pierce，Pockford/IL)，該物質為不含糖的去糖基抗生物素蛋白，pI在6-7之間，可以對其進行進一步的改造使其不包含鏈黴抗生物素的三肽RYD區域，所述區域可以介導細胞表面受體的非特異性結合。優選地是，根據本發明的抗生物素蛋白是鳥類抗生物素蛋白，去糖基化的鳥類抗生物素蛋白，或是一種neutravidine。最佳的是，根據本發明的抗生物素蛋白是neutravidine。這些neutravidine顯示具有最大的生物素結合能力，其結合能力大約為14微克生物素/毫克蛋白。抗生物素蛋白能通過例如交聯的方法連接到細胞表面。可以使用本領域公知的常見的雙功能交聯劑，其包含反應基團例如環氧乙烷，乙醛，琥珀酸亞胺或者光反應化合物，例如N-[N-4-疊氮基-四氟苯甲醯基]生物胞素氧基，SAND(磺基琥珀醯亞胺基2-[間疊氮基-鄰硝基苯甲醯氨基]-乙基-1，3-二硫代丙酸)。不言而喻的是，或者是與脂質的活性基團(例如磷酸絲氨酸的羥基官能團)，或者更可能的是與膜蛋白表面上的反應基團發生所述交聯。在一個優選實施例中，抗生物素蛋白通過帶有生物素標記的單功能交聯劑，將生物素部分共價地連接到細胞表面，然後非共價地附著到細胞表面上。抗生物素蛋白識別和結合至細胞表面的生物素部分。更優選地是，上述生物素化過程在低於10℃的溫度下完成，最佳是在大約4℃或者更低。在此溫度下，生物素化的效率隨著時間的延長而增加。有利地是，細胞表面的生物素化的反應時間在30-60分鐘內。如果抗生物素蛋白通過細胞表面的生物素標記被捕獲到細胞表面，更加優選地是這些細胞在含有至少50μg/ml，更優選地是100μg/ml的抗生物素蛋白溶液中進行培養，術語「抗生物素蛋白」是指根據本發明的抗生物素蛋白。抗生物素蛋白分子通常具有4個生物素結合位點。如果用生物素標記對細胞表面進行包被，然後以超出共價連接於細胞表面的生物素標記的量，培養抗生物素蛋白，一個生物素標記將結合一個抗生物素分子，留有三個空著的生物素標記結合位點。進一步優選地是，將共價連接於細胞表面並使抗生物素蛋白非共價地固定在細胞表面上的生物素部分通過間隔基部分連接至細胞表面，所述間隔部分例如直鏈烷基鏈，其延伸超過10，更優選地是至少20，最佳的是至少30。根據本發明的方法的下一步驟中，將包含至少一個抗體結合域的生物素化多肽與抗生物素蛋白標記的細胞進行培養，並且結合至連接在細胞表面上的抗生物素蛋白。根據本發明，抗體結合域並不是衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的抗原結合部位或其互補的決定部位。它是一種非免疫球蛋白源的抗體結合多肽。這種多肽可以例如是A蛋白(Surolia，A.等，1982，A蛋白天然的遍在抗體(ProteinANature’sunversal，antibody)，TIBS7，74-76；Langone，J.，1982，金黃色葡萄球菌的A蛋白和相關的免疫球蛋白受體(ProteinAofstaphylococcusaureusandrelatedimmoglobulinreceptors)，Adv.inImmunology，32p156-241)，G蛋白或蛋白L。蛋白L來自於鏈球菌屬，其具有通過k輕鏈的相互作用而結合的能力，而不對抗體的抗原結合位點產生幹擾(Kastern，W.等，1992，L蛋白的結構和重複的免疫球蛋白輕鏈結合域的鑑定(StructureofproteinLandidentificationofarepeatedimmunoglobulinlight-chainbindingdomain)，J.Biol.chem..267，12820-12825)，因而其可以結合所有種類的Ig，也可以結合單鏈可變片段(ScFv)和Fab片段。根據本發明，使用包含多肽的上述抗體結合域可以增強分泌檢測的靈敏度，能夠從低產細胞或非生成細胞中充分地區分出高產細胞克隆。本發明的分泌檢測方法也能夠簡便、快速地評價細胞系的穩定性。在細胞系的開發過程中進行常規的細胞系穩定性評價需要對200-300個克隆進行克隆分析，這需要6到7個星期的時間。與流式細胞術相結合，作為本申請主題的檢測方法具有足夠的靈敏度，可以對數以千計的低產或非生成細胞的亞群體進行分辨和定量，從而可以在僅僅5小時內給出關於細胞系穩定性的信息。優選地抗體結合域來自A蛋白或G蛋白。葡萄球菌屬的A蛋白和鏈球菌屬的G蛋白是眾所周知的可特異性結合於抗體Fc段的蛋白質試劑(Boyle，M.，細菌免疫球蛋白結合蛋白(BacterialImmunoglobulin-Bindingproteins)，學術出版社，聖地牙哥1990)。它們在幾乎所有動物物種或亞綱的IgG親和純化的生物技術中具有廣泛的應用。葡萄球菌屬的A蛋白與IgGFc片段的結合位點與鏈球菌屬的G蛋白相似，其包括兩種情況，例如Deisenhofer等(1981，Biochemistry202361-2370)和Sauer-Eriksson等(1995，Structure3，265-278)表述的人IgG-Fc殘基252-254，433-435和311。而且，WO00/7428中描述了一種能結合細菌G蛋白的B1域多肽的分離抗體，其能結合IgG的Fab片段，但是不能結合IgG的Fc片段。使用B1域是本發明另一個優選實施例。通常，根據本發明的抗體結合域被用作分離結合域或者其它多肽部分的融合蛋白。其也可以融合例如A蛋白，G，L的幾個抗體結合域，或者是融合經胺基酸取代、缺失、插入而人工製成的功能性變種的幾個抗體結合域。也可能採用例如A蛋白、G、L等各自的變種，所述變種帶有缺失或被截短。優選地，所述多肽不含有或僅含有1-2個糖基位點，更優選地是它不含有任何糖類。優選地，在本發明中採用含有至少四個抗體結合點的多肽，最佳地是具有42kD分子量的完整的A蛋白。這些完整的A蛋白具有4-5個針對IgGFc片段的強親合力結合位點。與針對生物素部分的多價抗生物素蛋白一起，所述多肽使所結合的分泌抗體的量顯著放大，從而使信號得到放大。多肽的生物素化可以通過以上所描述的細胞表面生物素化的任一方法來獲得。另外，也可以將生物素部分結合至酪胺上，然後將其共價連接至多肽上，所述過程是在過氧化氫存在的條件下，由過氧化氫酶所產生的氧自由基催化所形成的。本發明的另一個目的是可以直接採用一種多肽-抗生物素蛋白複合物，其中多肽帶有至少一個A蛋白或G蛋白的抗體結合域。多肽和蛋白質部分的交聯在生化領域是眾所周知的，可以通過很多試劑來完成。(Fasold等，交聯蛋白質的雙功能試劑(bifunctionalreagentsforthecrosslinkingofproteins)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1971)，10795-801)。例如，通過N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯偶聯到賴氨酸的氨基上是本領域所公知的。本發明的定義和優選實施例同樣適用此目的。優選地，生物素部分通過間隔基連至多肽上，間隔臂的長度至少是15，優選地至少22，最佳是至少30。適宜的間隔臂為例如直鏈烷基部分。當幾種生物素化分子結合到一種抗生物素複合物上時，這種延伸的間隔臂減少了位阻現象。更加優選地是，本發明的包含多肽的抗體結合域至少攜帶有3個生物素部分，所述生物素部分共價結合於多肽或蛋白質上，更優選地是每個多肽或蛋白質各自有至少6個生物素部分，最佳地是6-10個生物素分子。多肽的這種生物素化程度的大小很容易由多肽中反應基團的數目(例如賴氨酸的氨基，半胱氨酸的巰基)，以及生物素試劑與進行生物素化的多肽的比例來控制。根據本發明的第二檢測抗體可以是任何常見的，用螢光標記的抗體或抗體片段，其能特異性地結合所分泌的第一抗體，其細胞克隆的表達通過本發明的方法進行監控。在本發明範圍內，「檢測抗體」也可以解釋為含有第一和第二檢測抗體的任何適當的組合，而其中只有後者進行了螢光標記，這在相關技術中是經常採用的，例如ELISA技術。同樣地，被第一分泌抗體識別的用螢光標記的抗原也可以用於檢測。有利地是，在本發明的步驟b和步驟c之間，在細胞培養基中一段較短的幹涉培養期間可以使細胞表面上的人工製得的抗體結合位點全部為分泌的抗體所飽和。優選地，根據本發明的方法，在用生物素化多肽培養細胞的過程中或者最遲在培養之後，將這些細胞在含有增粘劑的培養基中進行培養。通過人為地增加培養物的粘度，從而防止細胞之間發生交叉幹擾。這些試劑可以是例如甲基纖維素，PEG，澱粉，藻類多糖，細菌或植物，或膠質。在一個優選實施例中，使用濃度至少為10％(w/w)的膠質。在另一個優選實施例中，根據本發明的方法，在用生物素化多肽培養細胞的過程中或者最遲在培養之後，在用螢光標記的抗原或抗體進行細胞染色之前，將細胞在含有非生物素化A蛋白的培養基中進行培養，或者在含有本發明的另一種非捕獲性的、包含多肽的競爭性抗體結合域的培養基中進行培養，其濃度至少為0.5μg/ml，更優選地是濃度至少為4μg/ml，最優選地是濃度至少為8μg/ml。有利地是，上述非捕獲性的、競爭性A蛋白或類似物與增粘劑一起結合使用，從而防止細胞之間發生交叉幹擾。優選地是，根據本發明的方法，在用螢光標記的抗原或抗體進行細胞染色之前，在使所分泌的抗體結合至已固定在細胞表面上的生物素化多肽之後，在細胞中加入第三封閉抗體，例如其濃度至少為0.5到5μg/ml。所述第三封閉抗體能夠結合至生物素化多肽的剩餘抗體結合位點上，但是其不能被檢測中所使用的、用螢光標記的第二抗原或抗體識別和結合。這種措施有利於進一步消除克隆之間的後期交叉幹擾，因而提高了本發明檢測的靈敏度和識別力。不言而喻，上述措施可以與其他措施結合使用，例如為了共同增強檢測的識別能力和靈敏度，聯合使用增粘劑和/或競爭性非生物素化A蛋白及其類似物。實施例在所有實驗中，細胞都取自批培養細胞的指數生長階段，用標準的細胞染色計數技術進行分析，它們的存活能力超過95％。1.對比實驗採用由NSO骨髓瘤細胞系衍生的6A1(100)3細胞系。它是一種GS-轉染的細胞系(Bebbington，C.等，1992，以穀氨酸合成酶(GS)基因作為可擴增的選擇標記的來自骨髓瘤細胞的重組抗體的高水平表達(High-levelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetase(GS)geneasanamplifiableselectablemarker)，Bio/Technology10169-175)，其分泌人類嵌合IgG抗體cB372.3，所述抗體特異性結合於乳腺癌腫瘤抗原TAG73。按照Holmes等人(ibd)所公開的方法對這些細胞進行處理。然而結果令人失望，所述分泌細胞以及未經處理的陰性對照細胞系(NSO細胞系，ECACCNo.85110503)在螢光強度上並沒有觀察到可重複的、具有顯著意義的差別。同樣，對非生成性GS轉染的骨髓瘤細胞系，以及在細胞外部加入人IgG進行實驗，也沒有觀察到在平均螢光強度上存在有顯著差異。2.分泌檢測2.1分泌抗體的捕獲圖1對分泌抗體的捕獲和檢測原理進行了示意性地描述。分泌嵌合抗體cB72.3的6A1(100)3細胞系再次被篩選作為實驗模型。分泌基質的組成如下。用25mL，pH8的PBS對1076A1(100)3細胞系進行衝洗，然後重懸浮於1mL含有1mg/mlNHS-LC-生物素的生理學標準PBS(pH8)溶液中(目錄號為21336，琥珀醯亞胺基-6-(生物素胺基酸)正己酸酯；Pierce，羅克福德，IL/U.S.A)。接著在4℃下培養40分鐘，用PBS(pH7)衝洗兩次，重新懸浮於1mLPBS(pH7)中。加入128ul1mg/ml的neutravidinTM的溶液，在室溫下培養細胞15分鐘，接著進一步用50mLPBS(pH)洗滌。重懸浮於1mLpH7的PBS中，然後加入非生物素化的A蛋白至終濃度為1μg/mL，在室溫下培養5分鐘。接著加入52ul1mg/ml生物素化的A蛋白(Pierce，羅克福德，IL/U.S.A.；每個蛋白質攜帶6-10個生物素標記)溶液，在室溫下再培養15分鐘。用於培養的生物素化A蛋白的濃度並不是飽和的。獨立實驗證實，即使生物素化A蛋白的濃度為120μg/mL，結合仍未達到飽和(數據未顯示)。接著用適當體積的純化cB72.3IgG配製陽性對照樣品，濃度為6.6μg/mL。用作陰性對照的樣品由不含生物素/抗生物素蛋白/捕獲A蛋白親和基質的細胞組成。這些樣品像其它樣品一樣進行處理，即先在分泌基質中進行培養。所有用於分泌檢測的樣品都進行以下程序細胞重懸於10mL分泌基質中(細胞培養基，如Holmes，P等人在「通過高產量親合捕獲表面展示技術篩選高分泌者的改進的細胞系發展」(Improvedcelllinedevelopmentbyahighthroughputaffinitycapturesurfacedisplaytechniquetoselectforhighsecretors)，J.ofImmunologicalmethods，230(1999)，141-147中所述的富含10％明膠的用於培養NSO6A1(100)-3細胞系的培養基)。該培養基還含有8μg/mL的非生物素化A蛋白(Sigma，UK)，用以捕獲從生成細胞擴散出的抗體，從而防止它們結合到非生成細胞上。細胞於4℃在分泌培養基中培養15分鐘。2.2螢光標記用最終稀釋為1/500的鼠抗人κ輕鏈FITC複合物(Sigma，UK)檢測所結合的分泌抗體。按照2.1進行處理的細胞在25mLPBS(pH7)中洗滌一次，加入320ul1mg/ml的鼠IgG封閉抗體(Sigma，UK)，與細胞混合，並培養5分鐘。接著用25mLPBS(pH7)對細胞進行第二次洗滌，並重懸於1mLPBS中。加入5ul1mg/ml鼠抗人κ輕鏈FITC檢測抗體(Sigma，UK)，培養15分鐘，在25mLPBS中再次洗滌後，細胞重懸於1mLPBS中，用流式細胞術進行分析。2.3流式細胞術在對細胞進行如上文所述的染色後，採用激發和檢測波長為488nm和515nm的CoulterEpicsEliteflow流式細胞儀對細胞進行分析。採用側向散射光和前向散射光來確定進入的存活細胞群，測量該細胞群的螢光水平(和抗體結合數量)。(A)陰性對照(也就是沒有親和基質)、(B)具有被親和基質捕獲的分泌抗體的細胞、(C)在細胞外部加入被親和基質捕獲的純化IgG而進行培養的陽性對照細胞都在圖2中以細胞計數和螢光強度顯示出來。分泌細胞B的平均螢光為19.3，其與陰性對照A相比平均螢光增加了50倍。陽性對照C的平均值為59.5，與陰性對照相比增加了125倍。表1給出了根據圖2的平均螢光數值。表13.對比實施例對與細胞表面分泌抗體相結合的生物素化捕獲抗體的效力與生物素化A蛋白的效力進行了比較。在比較實驗中，除了在培養中使用不含有任何增粘劑的PBS，以替代所有樣品的分泌基質，其他嚴格按照第二部分進行分泌檢測，。除了之前描述的標準陰性對照(A)，陽性對照(C)，和cB72.3分泌性細胞(D)指外，用生物素化鼠抗人IgGFc特異性捕獲抗體(Sigma，UK)取代生物素化A蛋白製備出另一樣品(B)，其濃度為50μg/ml，培養15分鐘後固定到細胞表面，該濃度接近於飽和濃度，可以與前面實驗中使用的A蛋白的量進行比較。接著，樣品(B)與外源加入的人IgG一起進行培養，按照上文所述的對陽性對照進行處理的步驟對樣品(B)進行處理。在圖3中顯示了所有樣品的分布，與圖2一樣，用流式細胞儀進行螢光分析，顯示細胞計數和螢光強度(圖3A陰性對照，B捕獲抗體，C陽性對照，A蛋白，D分泌的cB72.3，A蛋白)。根據圖3中的分布，在表2中列出螢光強度的平均數值。人IgG模型產品(樣品B)的捕獲抗體的使用與陰性對照細胞相比，平均螢光增加5倍。然而，當使用A蛋白(樣品C)時，平均螢光增加80倍，因此證明了A蛋白比捕獲抗體更加有效。當此技術用於捕獲和檢測所分泌的cB72.3時，A蛋白也非常有效，與陰性對照相比，平均螢光大約增加55倍。嚴格按照Holmes等人(ibd)所述而製得的樣品與陰性對照相比，沒有增加(沒有給出數據)。表2比較實驗B與C，D的數據，清楚地看出用A蛋白取代捕獲抗體使得檢測的靈敏度和結合能力顯著提高。理論上，與捕獲抗體相比，A蛋白應該具有兩個多餘的結合位點(總數4)，因而允許有雙倍的分泌抗體發生結合至A蛋白上(理論上，強度增強2倍)。由於強親和力結合抗體超出A蛋白的結合親和力大約一階，該期望值就構成了一個理論最大值。相反，令人驚奇的是，由於尚未知曉的原因，實際所觀察到的A蛋白對捕獲抗體的強度增強大約為15-20倍，大大超過了理論預期值。圖1b比較了捕獲抗體結合外源性加入的IgGFc部分的結合能力，以及A蛋白結合該外源性IgG的結合能力。樣品基本按照本節本部分的描述進行製備，所不同的是，用於培養的捕獲抗體和A蛋白的量都加倍了，以確保飽和結合。在確定體積的細胞團中加入純化IgG抗體，以確保培養過程加入準確的預定濃度的外源IgG。權利要求1.篩選分泌第一抗體的細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟a)將抗生物素蛋白連接到細胞的細胞表面；b)將所述細胞與含有至少一個功能性抗體結合域的生物素化多肽一起培養；c)將細胞與第二抗體或抗原一起培養，該第二抗體或抗原是螢光標記的並且識別和結合第一抗體上的抗原表位；d)篩選結合了一定量第二抗體的螢光標記的細胞，優選通過螢光分析流式細胞術進行篩選。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物素化多肽為G蛋白或A蛋白。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在細胞表面被共價生物素化後，優選在低於10℃進行生物素化後，將抗生物素蛋白結合到細胞表面。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在與生物素化多肽一起進行培養期間或最遲在培養之後，將細胞培養在含有增粘劑的培養基中。5.篩選分泌第一抗體的細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟a)將抗生物素蛋白連接到細胞的細胞表面，其中，抗生物素蛋白結合於含有至少一個功能性抗體結合域的多肽，所述結構域優選來自G蛋白或A蛋白；b)將細胞與第二抗體或抗原一起培養，該第二抗體或抗原是螢光標記的並且識別和結合第一抗體上的抗原表位；c)篩選結合了一定量第二抗體的螢光標記的細胞，優選通過螢光分析流式細胞術進行篩選。全文摘要一種篩選高水平抗體生成細胞的方法，包括將A蛋白或G蛋白附著於細胞表面上的步驟，從而捕獲所分泌的可溶性抗體。通過常規的方法對捕獲抗體進行螢光染色，然後進行FACS分析，從而篩選出低豐度高產單細胞。文檔編號G01N33/53GK1545621SQ02814754公開日2004年11月10日申請日期2002年7月19日優先權日2001年7月27日發明者A·雷切爾,R·辛格,A雷切爾申請人:隆薩集團股份公司