一種人外周血單個核細胞中白細胞介素-9轉錄本螢光定量pcr檢測方法
2023-05-07 13:22:16
專利名稱：：一種人外周血單個核細胞中白細胞介素-9轉錄本螢光定量pcr檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種人外周血單個核細胞中白細胞介素-9(IL-9)轉錄本螢光定量PCR檢測方法。屬於生物
技術領域：
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背景技術：
：天然CD4+T細胞是包括許多亞群的異質性細胞。在體內微環境的作用下，能分化成不同類型具有不同免疫功能的細胞群。經典的觀點認為它在體內分化為Thl和Th2兩種細胞群體。Thl主要分泌IFN-Y、IL-2、TNF-e,主要介導細胞免疫。而Th2主要分泌IL-4和IL-5，介導體液免疫和抗寄生蟲感染。後來人們又提出了兩個新亞群——調節性T細胞(Treg細胞)及TH17細胞Treg細胞在體內調節Th細胞和Tc細胞使之處於動態平衡從而維護機體的免疫自身穩定；Harrington等根據分泌的細胞因子不同又發現了一種新的CD4+T細胞亞群——Thl7細胞，此細胞分泌的效應因子主要是IL-17，其在自身免疫性疾病的發生及抗感染中其重要的作用。最近《NatureImmunology》登載了兩篇獨立鑑定出"Th9"細胞(即分泌IL-9的Th細胞)的文章，為已有的Tli細胞亞群，又添新成員。原認為是Th2類細胞因子的IL-9，現認為由Th9細胞這樣一群細胞分泌，因此檢測淋巴細胞中IL-9的表達為研究Th9細胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎症、腫瘤等疾病中的作用有著重要的臨床和科研意義。細胞因子的檢測方法以目前技術手段主要有三種其一是利用螢光標記的抗細胞因子抗體，通過流式細胞儀從蛋白水平來檢測。此方法儘管特異性強，但因操作過程中繁瑣且代價較高，故難於推廣。第二是利用ELISA方法，但其測定的往往是血清中的蛋白水平，很難反映細胞內的情況。第三是利用聚合酶鏈反應(PCR)技術從基因水平來檢測。常規PCR只能定性且靈敏度低、汙染程度高，而螢光定量PCR具有靈敏度高、特異性強、無汙染且實時、定量、快速等特點。但螢光定量PCR技術對特異性要求較高，目前，還沒有實時、快速、準確地檢測人外周血單個核細胞中IL-9mRNA的檢測方法。
發明內容為了填補人外周血單個核細胞中IL-9在檢測方法方面的空白。本發明採用螢光定量PCR技術提供了一種能夠實時、準確、快速檢測人外周血白介素-9(IL-9)的檢測方法。鑑於螢光定量PCR技術對檢測過程中特異性要求較高，本發明是通過以下方法來提高檢測特異性的(1)利用01igo6.0和Primerprimer5.0軟體設計多對引物，並進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳，選取目的條帶單一且產量最多的引物作為螢光定量PCR引物。(2)優化PCR反應體系，如通過改變引物濃度、提高退火溫度等方法減少非特異性擴增，提高特異性。(3)根據引物二聚體和目的基因Tm值不同，按照螢光定量PCR四步法收集螢光，排除引物二聚體對檢測結果乾擾，提高反應特異性。本發明所採用的技術方案如下-一種人外周血單個核細胞中IL-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法，是首先設計特異性螢光定量引物，然後建立實時定量PCR反應體系和反應程序，製備含有目的片段的質粒作為標準質粒繪製標準曲線，之後將待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣品中目的基因的拷貝數。其中特異性螢光定量引物，其序列如下正向引物5，-CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC-3，反向引物5，-TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG-3,其中標準質粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.l所示。本發明檢測方法中，所述螢光定量PCR反應體系由下列組分構成12.5ylPlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDG，5ixM正向引物、反向引物各0.5ixl，ROX0.05u1，1U1標準質粒或樣本cDNA，補充DEPC處理水至於25u1。本發明檢測方法中，所述PCR反應程序為50。C2min,95°C2min，95°c15sec，60°C30sec，82°C15sec收集螢光，擴增40個循環。本發明利用螢光定量PCR技術提供了一種能夠實時、快速、準確地檢測人外周血單個核細胞中IL-9mRNA的檢測方法，從而填補了該細胞因子在檢測方法方面的空白。圖1為螢光定量PCR標準品擴增的融解曲線圖中橫坐標代表解鏈溫度圖中縱坐標代表相對螢光強度圖中平行於縱坐標的直線所對應橫坐標的溫度為收集螢光信號的溫度(82。C)圖中的曲線從上至下依次代表標準品拷貝數為107、106、105、104、103、102copies/u1及以DEPC處理水作為模板的空白對照的融解曲線圖2為螢光定量PCR標準品擴增的螢光信號中橫坐標代表循環數圖中縱坐標代表相對螢光強度圖中平行於橫坐標的直線代表循環閾值圖中的曲線從左向右依次代表標準品拷貝數為107、106、105、104、103、102、copies/U1及以DEPC處理水作為模板的空白對照的螢光信號圖3為螢光定量PCR擴增的標準曲線y=-3.2771og(conc)+38.66圖中橫坐標代表標準質粒的拷貝數(copies/u1)圖中縱坐標代表循環數注cone為標準質粒或樣本cDNAcopies/ul具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步闡述本發明，但應當理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍。材料Ficoll淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技術有限公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(ToYoBo公司)，PlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDG(Invitrogen公司)，rTaq酶、dNTP、10XBuffer、pMD18誦T(TakaRa公司)，StratageneMx3000P(Stratagene公司)，PMA、Inomycin(Sigma公司)實施例1:製備含IL-9目的基因的標準曲線1.引物設計與合成先從http:〃www.ncbi.nlm.nig.gov/GenBank中查找人IL-9序列(NM000590),然後根據人IL-9mRNA保守序列(CDS區域)，利用Oligo6.0和Primerprimer5.0軟體設計引物，最後通過NCBI中BLAST從中挑選最佳引物送上海生物工程有限公司合成。引物、模板序列如下正向引物5，-CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC-3，(SEQ.ID.N0.2)反向引物5，-TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG-3，(SEQ.ID.N0.3)模板(SEQ.ID.NO.l)5'-CCAGCTTCCAAGTGCCACTGCAGTGCTAATGTGACCAGTTGTCTCTGTTTGGGACCAATACCACCATGCA-3'2.刺激培養人外周血單個核細胞(PBMC)取人外周靜脈血2ml經肝素抗凝後，用人的淋巴細胞分離液(Ficoll分離液)按照產品說明書操作分離單個核細胞。此單個核細胞用RPMI1640培養基(含終濃度為50ng/mlPMA和終濃度為lPg/ml離子黴素)調整細胞密度為lX10Vml，放入24孔板，每孔1X106細胞數，於5%C0237。C刺激培養，5h後收集細胞。3.提取人外周血單個核細胞總RNA收集上述經剌激培養後的外周血單個核細胞。加入細胞裂解液Trizol,裂解細胞，然後按照Trizol說明書提取總RNA。4.逆轉錄單個核細胞總RNA利用逆轉錄酶MMLV將上述人外周血單個核細胞總RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄反應體系為4ul5XRTBuffer、2pldNTPmixture(各lOmM)、lulRNaseInhibitor(10U/Ul)、oligo(dT)加隨機引物、lul逆轉錄酶(ReverTraAce)、1ixg總RNA,其餘用RnaseFreeH20補足至20ul，於PCR儀上42。C20min、99°C5min、4°C5min。5.構建標準質粒l)PCR條件優化在20u1反應體系中以前述的cDNA為模板，加入dNTP、10XBuffer、前述特異性上、下遊引物、rTaq酶和滅菌水以不同的退火溫度擴增30個循環，PCR反應結束後取5P1產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳,最後EB染料染色，凝膠圖像分析儀上觀察。選取目的條帶最亮而又無非特異性條帶的退火溫度作為最佳退火溫度。2)T-A克隆按上述的PCR反應條件擴增IL-9基因，PCR產物經純化後，同pMD18-T載體(2692bp)按一定的比例混合，於16。C連接30min，然後該連接產物轉化感受態細胞DH5ci菌。根據藍白斑篩選挑取陽性克隆。然後用鹼裂解法抽提質粒，通過PCR和酶切鑑定，如鑑定陽性，則送公司測序。3)稀釋標準質粒測定上述測序正確的陽性質粒的核酸濃度，並計算出其拷貝數/ul，然後將陽性質粒先稀釋成1X10"c叩ies/u1，然後按10倍依次倍比稀釋成1X109、1X108、1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、lX102copies/u1。6.制定標準曲線以上述稀釋的標準質粒作為模板，利用SYBRGrrenl能嵌合到雙鏈DNA,結合螢光定量PCR儀能夠實時檢測螢光強度的特點來制定標準曲線。螢光定量PCR反應體系如下在25ul反應體系中加入稀釋的標準質粒各lul、12.5ylPlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDG,5uM正向引物、反向引物各0.5ul，ROX0.05ul，補充DEPC處理水至於25n1。在螢光定量PCR儀上進行擴增，擴增條件為50°C2min，95°C2min，95°c15sec，60。C30sec，82°C15sec(收集螢光，此步驟為基於SYBRGrrenl的螢光定量PCR檢測的6四步法，即在通用的三步法延伸之後增加一個短暫的螢光收集步驟以消除引物二聚體對檢測結果的幹擾)，擴增40個循環，最後進行融解曲線分析以確定PCR反應的特異性。標準品的融解曲線圖參見圖1,標準品的螢光信號圖參見圖2，標準品的標準曲線圖參見圖3。樣本外周血單個核細胞IL-9轉錄本的檢測外周血單個核細胞按前述的方法製備成cDNA,然後與標準質粒同時進行PCR反應，最後根據標準曲線來確定樣本中IL-9轉錄本的拷貝數。正常人(ND)和過敏性鼻炎(allergicrhinitis,AR)及甲亢(Gravesdisease,GD)患者外周血單個核細胞IL-9轉錄本的檢測。7例正常人，7例過敏性鼻炎及6例甲亢患者外周血單個核細胞IL-9轉錄本相對表達(以P-actin作為內參照基因)的檢測結果如下tableseeoriginaldocumentpage714tableseeoriginaldocumentpage8SEQUENCELISTING江蘇大學—種人外周血單個核細胞中IL-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法3Patentlnversion3.51125DNAHomosapiens1ccagcttccaagtgccactgcagtgctaatgtgaccagttgtctctgtttgggcattccc60tctgacaactgcaccagaccatgcttcagtgagagactgtctcagatgaccaataccacc120atgca125221DNA人工序列29ccagcttccaagtgccactgc21323DNA人工序列3tgcatggtggtattggtcatctg2310權利要求1、一種人外周血單個核細胞中IL-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，首先設計特異性螢光定量PCR引物，然後建立螢光定量PCR反應體系和反應程序，製備含有目的片段IL-9的質粒作為標準質粒繪製標準曲線，最後待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣品目的基因拷貝數。2、根據權利要求1所述的一種人外周血單個核細胞中IL-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，其中特異性螢光定量引物，其序列如下正向引物5，陽CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC-3，反向引物5，誦TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG-3，其中標準質粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.l所示。3、根據權利要求1所述的一種人外周血單個核細胞中IL-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，上述螢光定量PCR反應體系由下列組分構成12.5ulPlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDG,5umol/L正向引物、反向引物各0.5u1，ROX0.05ul，lix1標準質粒或樣本cDNA，補充DEPC處理水至於25u1。4、根據權利要求1所述的一種人外周血單個核細胞中IL-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，PCR反應程序為50。C2min,95。C2min,95°c15sec,60°C30sec,82eC15sec收集螢光，擴增40個循環。全文摘要本發明涉及一種人外周血單個核細胞中白細胞介素-9轉錄本螢光定量PCR檢測方法。其特徵在於首先設計特異性螢光定量PCR引物，然後建立螢光定量PCR反應體系和反應程序，製備含有目的片段IL-9的質粒作為標準質粒繪製標準曲線，最後待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣品目的基因的拷貝數。本發明由於利用了螢光定量PCR具有靈敏度高，特性強，無汙染且實時、準確、快速的特點，從而填補了該基因在檢測方法方面的空白，為研究TH9細胞分化提供了一個實用方法。文檔編號C12Q1/68GK101538608SQ20091003116公開日2009年9月23日申請日期2009年4月24日優先權日2009年4月24日發明者燁史,呂力為,楊先知,王勝軍,潔田,蘇兆亮,許化溪,斌馬申請人:江蘇大學