羥基羧酸類的生產方法

2023-05-07 03:50:51 3

專利名稱：羥基羧酸類的生產方法
技術領域：
本發明涉及生產以羥基乙酸為代表的羥基羧酸的微生物及使用該微生物的以羥基乙酸為代表的羥基羧酸的生產方法。
背景技術：
羥基羧酸類作為聚合物原料或醫藥中間體有用，要求開發出有效的生產方法。
作為其一例可以舉出羥基乙酸(α-羥基乙酸)。羥基乙酸作為清洗劑、化妝品原料被利用，近年，作為氣體隔離性聚合物或醫療用聚合物有用的聚羥基乙酸的原料而被關注。作為氣體隔離性材料被關注的原因是聚羥基乙酸層具有高氧氣隔離性，具備作為在氧氣存在下用於包裝易變質的食品或碳酸飲料的材料的性能。
為了將來工業規模實際生產聚羥基乙酸，必須高純度且廉價地提供其原料羥基乙酸。但是，很多現行市售的化學合成品的羥基乙酸含有雜質，作為聚合物原料存在純度上的問題。原因在於上述雜質不僅阻礙羥基乙酸的脫水縮合反應，雜質之一的甲氧基乙酸是具有致癌可能性的化合物，不適合包含在食品或飲料的包裝材料中。當然，技術上可以通過提純除去雜質，但實際上上述提純品價格變高，作為廉價的包裝材料原料是不現實的。
為了避免化學合成品的羥基乙酸中可見的上述問題，正在嘗試通過以乙二醇(以下稱為EG)為原料的生物學方法製備羥基乙酸。特開平10-174593號公報及特開平10-174594號公報公開了利用微生物得到羥基乙酸的生產方法，其特點在於，在含有乙二醇的培養基中培養屬於畢赤酵母(Pichia)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、擲孢酵母(Sporobolomyces)屬、克魯維酵母(Kluyveromyces)屬、球擬酵母(Torulopsis)屬的酵母，屬於諾卡氏菌(Nocardia)屬的菌株，屬於紅球菌(Rhodococcus)屬的菌株或大腸桿菌B(Escherichia coli B)株，從培養液中分離·提取羥基乙酸。另外，關於大腸桿菌K12(Escherichia coli K12)株公開了羥基乙酸收率低的問題。特開平10-174593號公報及特開平10-174594號公報的實施例中記載的羥基乙酸的生產方法中，羥基乙酸蓄積濃度最高的是使用長西氏畢赤酵母(Pichia naganishii)的方法，經過30小時的反應能得到35.3g/L的羥基乙酸。文獻(Kataoka，M.，et.al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vol.65(10)，pp.2265-2270(2001))報導在使用長西氏畢赤酵母的羥基乙酸生產中進一步改善反應條件，經過120小時的反應能夠得到105g/L羥基乙酸。總之，使用長西氏畢赤酵母的生產方法中，從乙二醇生成羥基乙酸的反應時間長達120小時，由於該情況會導致羥基乙酸製造成本增加，故假定在工業規模的實際生產情況下必須進一步縮短反應時間。並且還存在下述問題在該生產方法中混入了所使用的微生物產生的副產物有機酸，阻礙之後的提純工序或脫水縮合反應。
關於利用微生物的從乙二醇生成羥基乙酸的代謝反應，公開了Boronat等人利用大腸桿菌的研究結果(Boronat，A.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.153(1)，pp.134-139，(1983))。即為從乙二醇生成羥基乙醛的反應和從羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的兩個階段的代謝途徑。Boronat等人著眼於從1，2-丙二醇(以下稱為PDO)生成乳醛的反應催化酶丙二醇氧化還原酶(以下稱為PDO氧化還原酶)也以乙二醇作為基質(Boronat，A.，et.al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.672，pp.98-107，(1981))。在PDO氧化還原酶活性通過突變增強的菌株中，分離出從羥基乙醛生成羥基乙酸的反應催化酶羥基乙醛脫氫酶(以下稱為GAL脫氫酶)的活性增強的菌株。需要說明的是，下表(表1)引用自Boronat等人的論文。
表1

對象株大腸桿菌G1株不能同化(assimilating)1，2-丙二醇和乙二醇中的任一種。與之相對，PDO氧化還原酶活性顯著增強的突變株G3株雖然獲得了PDO同化能卻仍然無法同化EG。基於該結果，Boronat等人推論G3株不能同化EG的原因是GAL脫氫酶活性不足，無法進行從羥基乙醛生成羥基乙酸的反應。分離出GAL脫氫酶活性顯著增強的突變株EG3株，該菌株同化EG，從而驗證了他們的推論。換言之，Boronat等人認為為了從EG生成羥基乙酸，GAL脫氫酶活性必須充分存在。
本說明書所公開的新知識是為了從EG生成羥基乙酸，未必增強GAL脫氫酶的活性，只增強PDO氧化還原酶的活性即可。產生上述差異的原因可以舉出Boronat等人僅著眼於在EG3株中GAL脫氫酶活性增強，沒有注意到PDO氧化還原酶的活性也同時增強。基於我們的知識，重新考察Boronat等人的試驗結果，得出EG3株能獲得EG3同化能力並非因為GAL脫氫酶的活性增強，而是由於PDO氧化還原酶的活性增強的結論。
Boronat等人的報告還顯示了EG3株中在基質EG與羥基乙酸同時存在的條件下中間體羥基乙醛發生蓄積。即表示通過使用大腸桿菌的生物學方法以EG為原料製備羥基乙酸時，出現中間體羥基乙醛作為雜質蓄積之類不良情況。
由此可知，過去的知識表明使用大腸桿菌從EG製備羥基乙酸時，GAL脫氫酶活性的增強是必不可少的、及製得的羥基乙酸中蓄積有中間體羥基乙醛。基於上述理由可知，即便是本領域技術人員也無法容易地推測在不增強GAL脫氫酶活性的狀態下可選擇性地製備羥基乙酸、並且可以不含有中間體羥基乙醛、高效地製備羥基乙酸。
作為羥基乙酸之外的羥基羧酸的例子，也對甘油酸的各種製備方法進行了研究。其中，關於以廉價的甘油為原料製備甘油酸的方法，特開平5-331100號公報公開了使用Pt催化劑的化學合成法，特開平1-168292號公報公開了利用葡糖桿菌(Gluconobacter)屬微生物的生物學方法。前者的使用Pt催化劑的方法中反應的選擇率為80％左右，非常不充分，生成相當量的副產物，且必須嚴密控制反應溫度。後者的生物學方法中記載以甘油為原料的D-甘油酸的製法，但是該製法存在菌體的調製及反應需要4天之久的時間的問題，而且可以容易想像製得的甘油酸中混有相當量的來自使用的微生物的副產物有機酸。也未公開關於L-甘油酸的製造方法。
關於利用作為羥基羧酸之一例的羥基乙氧基乙酸的生物學方法的製備方法，特開昭59-85296號公報公開了在含有乙二醇的培養基中培養屬於假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母(Torulopsis)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、漢遜酵母(Hansenula)屬、德巴利酵母(Debaryomyces)屬、隱球酵母(Cryptococcus)屬、畢赤酵母(Pichia)屬的酵母，從培養基中分離·提取羥基乙氧基乙酸的方法。該生產方法需要長時間培養，而且還副生成了相當量的二羥乙酸，容易想像分離提純羥基乙氧基乙酸需要大量的勞力。
專利文獻1特開平10-174593號公報專利文獻2特開平10-174594號公報專利文獻3特開平5-331100號公報專利文獻4特開平1-168292號公報專利文獻5特開昭59-85296號公報非專利文獻1Kataoka，M.，et.al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vol.65(10)，pp.2265-2270，(2001)非專利文獻2Boronat，A.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.153(1)，pp.134-139，(1983)非專利文獻3Boronat，A.，et.al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.672，pp.98-107，(1981)

發明內容
如上所述，現有的以羥基乙酸為代表的各種羥基羧酸的生產方法的缺點總的說來是通過化學合成法得到的羥基羧酸含有大量的雜質，純度低，通過生物學方法生產則反應時間長，生產設備的每單位時間內的生產率降低，生產成本升高，並且混有副生成的有機酸。鑑於以上幾點，本發明所解決的問題為在短時間內廉價且大量提供以羥基乙酸為代表的羥基羧酸類，並且使副產物減少提高純度。
作為用於解決上述問題的改善方法，本發明人等發現利用通過以質粒的形態導入編碼催化從乙二醇生成羥基乙醛反應的酶的基因等方法改變的、僅充分增強了該酶活性的微生物，代替通過現有生物學方法生產羥基乙酸時使用的從自然界篩選出的微生物，從乙二醇生產羥基乙酸的方法能夠實現本發明的目的。還發現通過利用以質粒的形態導入編碼催化乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶和催化羥基乙醛生成羥基乙酸反應的酶這2種酶的基因增強了上述二種酶的活性的微生物，與只增強催化乙二醇生成羥基乙醛反應的酶的微生物相比，得到能減少菌體培養所需要的葡萄糖量之類意料之外的理想效果。關於上述微生物，還發現通過降低催化羥基乙酸生成乙醛酸反應的酶及/或催化丙酮酸生成甲酸反應的酶的活性，能夠減少乙二酸或乙酸之類副生成的有機酸，生產更高純度(副生成的有機酸少)的羥基乙酸，具體原因不明，但上述兩種酶活性降低使得細胞內的狀況更適合生產羥基乙酸，羥基乙酸的生產率顯著提高。另外，上述微生物還可以用於生產羥基乙酸之外的羥基羧酸的方法中。
即，本發明涉及下述[1]～[9]所述發明。
一種以末端具有羥基的脂肪族多元醇類為基質的羥基羧酸類的生產方法，其特徵在於，利用賦予或增強了催化乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶的活性的微生物。
如[1]所述的生產方法，其特徵在於，通過將編碼[1]所述的酶的基因以質粒的形態導入而賦予或增強了微生物的該酶的活性。
一種以末端具有羥基的脂肪族多元醇類為基質的羥基羧酸類的生產方法，其特徵在於，利用通過將編碼下述2種酶的基因以質粒的形態導入而賦予或增強了所述2種酶的活性的微生物，所述2種酶為催化乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶與催化羥基乙醛生成羥基乙酸的酶。
如[2]或[3]所述的生產方法，其特徵在於，所述生產方法利用下述微生物，所述微生物通過功能性地連接使編碼催化乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶的基因及/或編碼催化羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的酶的基因與負責和糖酵解體系、核酸生物合成體系或胺基酸生物合成體系有關的蛋白質的表達的基因的啟動子而表達該酶。
如[1]～[4]中的任一項所述的生產方法，其中，催化乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶為乳醛還原酶，催化羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的酶為乳醛脫氫酶。
如[1]～[5]中的任一項所述的生產方法，其特徵在於，利用特徵為該微生物本身具有的羥基乙酸氧化酶活性失活或下降、且/或丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate-lyase)活性失活或下降的微生物。
如[1]～[6]中的任一項所述的生產方法，其特徵在於，羥基羧酸為具有光學活性的羥基羧酸。
一種用於[1]～[7]中的任一項所述的生產方法的微生物。
一種羥基乙酸水溶液，所述羥基乙酸水溶液為採用[6]中所述的方法，以乙二醇為基質，以95％以上的收率、2g/L/小時以上的生產速度得到的羥基乙酸水溶液。
根據本發明，開發出以遠遠少於目前已知的時間高生產率地生產雜質少的羥基乙酸的微生物，可以廉價地以工業規模生產可用於聚合物原料用途的高純度的羥基乙酸。另外，也可以通過應用上述生產方法生產羥基乙酸之外的羥基羧酸。
關於羥基乙酸的生產，由於與公知信息相反，應增強活性的目標酶僅為1種即可高生產率地生產羥基乙酸，因此可以減少增強酶活性所必須的勞力，同時，可以避免以由於人為的增強多種酶活性所產生的應激(stress)使得導入的基因脫落為代表的對宿主微生物的不良影響。
另外，本發明提供通過減少用於生產羥基羧酸類的微生物的培養所必需的葡萄糖而降低製備成本的方法。


表示實施例3的反應液中的羥基乙酸蓄積量的經時變化圖。圖中，△表示大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株的結果，○表示大腸桿菌MG1655野生株的結果。
表示實施例4的反應液中的羥基乙酸蓄積量的經時變化圖。圖中，□表示大腸桿菌MG1655/pGAPfucO-aldA株的結果，○表示大腸桿菌MG1655野生株的結果。
具體實施例方式
以下詳細說明本發明。
本發明中催化乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶只要是能夠以乙二醇為反應基質生成羥基乙醛的酶即可，沒有特別限定，上述酶全部包含在其定義中。作為上述酶，列舉乳醛還原酶。
作為本發明中被賦予了某目標酶的活性的微生物是指通過某種方法使完全沒有該酶活性的該微生物具有該酶活性的微生物，本發明中的增強了某目標酶活性的微生物指與野生型的該微生物相比顯著提高了該酶活性的微生物。上述微生物可以通過例如採用基因重組技術向野生型微生物(或重組前的微生物)中導入編碼該酶的基因等方法來得到。作為向野生型微生物(或重組前微生物)中導入該基因的方法，可以舉出將該基因以質粒的形態導入微生物的方法。向微生物中導入基因時所用的染色體組DNA的調製、質粒的調製、DNA的切斷及連接、轉化、PCR(polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的設計、合成等方法，可以採用本領域技術人員公知的常用方法進行。上述方法記載在Sambrook，J.，et.al.，「Molecular Cloning ALaboratory Manual，Second Edition」，ColdSpring Harbor LaboratoryPress，(1989)等中。
本發明的微生物是不論是否原本擁有從末端具有羥基的脂肪族多元醇生產羥基羧酸的能力，通過採用某種手段即可得到從末端具有羥基的脂肪族多元醇生產羥基羧酸的能力的微生物的總稱。作為上述微生物，列舉大腸桿菌。
本發明中，作為末端具有羥基的脂肪族多元醇類，只要是碳鏈的末端具有羥基、且分子內具有2個以上羥基的脂肪族化合物即可，對其結構沒有特別限定，作為上述化合物，可以舉出乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、甘油、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2，4-丁三醇等。
本發明中的將編碼某目標酶的基因導入微生物時的「以質粒的形態」指將該基因連接在載體上製作重組質粒，用轉化等方法將其導入該微生物。另外，如本發明的實施例所述，功能性地連接在微生物內恆久發揮作用的強啟動子與目標基因時，通過利用因質粒具有的複製子的性質而使得每個微生物細胞的拷貝數通常較少的質粒也能達到本發明的目的。作為具有上述複製子的質粒，可以列舉pACYC184(GenBank accession number X06403)等。
作為本發明中的催化由羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的酶，只要是能夠以羥基乙醛作為反應基質生成羥基乙酸的酶即可，沒有特別限定，上述酶全部包含在其定義中。作為上述酶，列舉乳醛脫氫酶。
本發明的表達與糖酵解體系、核酸生物合成體系或胺基酸生物合成體系相關的蛋白質的基因的啟動子為在微生物內恆久地發揮作用的強啟動子，且在葡萄糖存在下其表達也難以被抑制的啟動子，具體地可以列舉甘油醛3-磷酸脫氫酶(以下稱為GAPDH)的啟動子或絲氨酸羥甲基轉移酶的啟動子。
本發明的啟動子是指具有σ因子的RNA聚合酶接合、開始轉錄的部位。例如，來自大腸桿菌的GAPDH啟動子在GenBank accessionnumber X02662的鹼基序列信息中標記在397-440位。
本發明中，基因與啟動子功能性地連接指該基因與啟動子接合，使該基因處於啟動子的控制下，基因的表達受啟動子的控制。
本發明的乳醛還原酶是遵照國際生化學聯合(I.U.B.)酶委員會報告分類為酶編號1.1.1.77、在作為輔酶的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可逆地催化從1，2-丙二醇生成乳醛的反應的酶的總稱。
本發明的乳醛脫氫酶是遵照國際生化學聯合(I.U.B.)酶委員會報告分類為酶編號1.2.1.22、在作為輔酶的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的存在下催化從乳醛生成乳酸的反應的酶的總稱，同時也指遵照國際生化學聯合(I.U.B.)酶委員會報告分類為酶編號1.2.1.21、在作為輔酶的氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的存在下催化從羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的酶羥基乙醛脫氫酶的總稱。原因在於，在使用大腸菌的現有文獻中報導了乳醛脫氫酶與羥基乙醛脫氫酶為相同的酶(Caballero，E.，et.al.，J.Biol.Chem.，258(12)，7788-7792(1983))。
本發明的羥基乙酸氧化酶(以下稱為glcDEF)是遵照國際生化學聯合(I.U.B.)酶委員會報告分類為酶編號1.1.3.15、可逆地催化由羥基乙酸生成二羥乙酸的反應的酶的總稱。
本發明的丙酮酸甲酸裂解酶(以下稱為pflB)是遵照國際生化學聯合(I.U.B.)酶委員會報告分類為酶編號2.3.1.54、可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反應的酶的總稱。
本發明的glcDEF或pflB的酶機能失活指該酶活性完全消失。本發明的glcDEF或pflB的酶機能的降低指該酶活性部分消失。為了使酶機能的失活或降低可以採用下述方法在編碼該蛋白質的基因中引入變異或使其缺失；或添加特異地使該蛋白質失活的藥劑；照射紫外線等。具體地可以列舉大腸桿菌MT-11023株因glcDEF基因與pflB基因被破壞導致上述酶機能失活的微生物。
由於大腸桿菌MT-11023株因基因破壞導致glcDEF、pflB失活，故使用該菌株能容易地實施本發明。該菌株的保藏編號為FERM BP-10293，基於國際承認用於專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約，於平成17年3月10日保藏在茨城縣筑波市東1條1番1號中央第6獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心。
實施本發明的生產方法時，通常使用培養基培養賦予或增強了催化從乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶活性的微生物，使其增殖，得到必要量的微生物菌體。
本發明的培養所用的培養基，只要是含有碳源、氮源、無機離子及根據需要含有的其他有機微量成分的培養基即可，沒有特別限定。作為碳源，可以適當地使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類，富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸，甲醇、乙醇、甘油等醇類及其他。作為氮源，可以適當使用有機銨鹽、無機銨鹽、氨氣、氨水等無機氮源，及蛋白質水解產物等有機氮源及其他。作為無機離子，可以根據需要適當使用鎂離子、磷酸根離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其他。作為有機微量成分，可以適當使用維生素、胺基酸等及含有上述維生素或胺基酸的酵母提取液、蛋白腖、玉米漿、酪蛋白分解物及其他。
需要說明的是，作為本發明培養中所使用的培養基，如果從用於工業生產的方面考慮則優選液體培養基。
培養本發明的微生物時，培養條件沒有特別限定，例如，在需氧條件下、pH6～8、溫度為25℃～40℃的範圍內邊適當地控制pH與溫度邊培養時，培養所需要的時間為50小時以內。
本發明的生產羥基羧酸的反應中所用的反應液為能添加(或含有)作為基質的末端具有羥基的脂肪族多元醇的液體即可，沒有特別限定，可以列舉磷酸鉀緩衝液等緩衝液、上述微生物的培養中使用的培養基及純水。本發明中，使預先培養得到的微生物菌體接觸上述液體進行反應。對於微生物菌體，除了使用培養結束後的培養液本身之外，還可以舉出從培養液中僅回收菌體進行使用的方法。
進行本發明的羥基羧酸類的生產方法中的反應時，反應條件沒有特別限定，例如，優選在pH6～9、溫度為20℃～40℃的範圍內邊適當控制pH及溫度邊進行反應。
作為回收如上所述得到的反應液中蓄積的羥基羧酸的方法，沒有特別限定，例如利用離心分離等從反應液除去菌體後，可以採用使用合成吸附樹脂的方法或使用沉澱劑的方法、利用其他通常的提取分離方法分離羥基羧酸的方法。
實施例1來自大腸桿菌的乳醛還原酶表達載體及該表達載體轉化體的構建已報導了大腸桿菌的乳醛還原酶的胺基酸序列及基因(以下，省略為fucO)的鹼基序列(GenBank accession number M31059)。為了取得fucO，使用大腸桿菌MG1655株的染色體組DNA作為模板，按照CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG(序列號1)、及GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(序列號2)採用PCR法進行擴增，用限制酶EcoRI及HindIII消化所得的DNA片段，得到約1.2kbp的fucO片段。進一步為了取得甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH)啟動子，使用大腸桿菌MG1655株的染色體組DNA作為模板，按照AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列號3)、及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列號4)採用PCR法進行擴增，用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段，得到約100bp的編碼GAPDH啟動子的DNA片段。混合上述2個DNA片段與用限制酶EcoRI及HindIII消化質粒pUC18所得的片段，使用連接酶接合後，轉化至大腸桿菌DH5株，得到在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中在37℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAPfucO。該質粒pGAPfucO轉化至大腸桿菌MG1655株，在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板中在37℃下培養一夜得到MG1655/pGAPfucO株。
需要說明的是，大腸桿菌MG1655株、大腸桿菌DH5株均可從美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection)購得。
實施例2
乳醛還原酶、乳醛脫氫酶同時表達載體及該表達載體轉化體的構建已報導了大腸桿菌的乳醛還原酶的胺基酸序列及基因(以下，省略為fucO)的鹼基序列(GenBank accession number M31059)。另外，也報導了大腸桿菌的乳醛脫氫酶的胺基酸序列及基因(以下，省略為aldA)的鹼基序列(GenBank accession number M64541)。為了取得fucO，使用大腸桿菌MG1655株的染色體組DNA作為模板，按照GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG(序列號5)、及GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(序列號2)採用PCR法進行擴增，用限制酶XbaI及HindIII消化所得的DNA片段，得到約1.2kbp的fucO片段。進一步為了取得aldA，使用大腸桿菌MG1655株的染色體組DNA作為模板，按照CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC(序列號6)、及GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG(序列號7)採用PCR法進行擴增，用限制酶EcoRI及XbaI消化得到的DNA片段，得到約1.5kbp的aldA片段。再與實施例1相同地得到編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH)啟動子的片段。混合上述3個DNA片段與用限制酶EcoRI及HindIII消化質粒pUC18得到的片段，使用連接酶接合後，轉化至大腸桿菌DH5株，得到在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中在37℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAPfucO-aldA。將該質粒pGAPfucO-aldA轉化至大腸桿菌MG1655株，在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板中，在37℃下培養一夜得到MG1655/pGAPfucO-aldA株。
實施例3由大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株、大腸桿菌MG1655野生株生產羥基乙酸作為前培養將實施例1中得到的大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株、大腸桿菌MG1655野生株植入放在三角燒瓶中的25mL LB Broth，Miller培養液(Difco244620)中，在培養溫度為35℃、120rpm的條件下攪拌培養一夜。將各種前培養液全部移入裝有475g如表2(表2)所示組成的培養基的容積為1L的培養槽(ABLE社制培養裝置BMJ-01)中，進行培養。培養在大氣壓下、通氣量為1vvm、攪拌速度為800rpm、培養溫度為35℃、pH7.2(用氨水溶液調節)下進行。離心分離(8000rpm、20分鐘)培養開始24小時後的菌體，收集菌體，用pH7.2的1mM磷酸鉀緩衝液清洗後，用相同的緩衝液混懸，將最終溶液量定量為500ml。將懸濁液移入ABLE社制培養裝置BMJ-01培養槽中，以5g/小時的速度添加乙二醇，反應22小時。反應在大氣壓下、通氣量為1vvm、攪拌速度為800rpm、反應溫度為35℃、pH7.2(用氨水溶液調節)下進行。用HPLC根據定量法測定得到的反應液中的羥基乙酸蓄積量。結果如圖1(圖1)所示。
確認了在大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株中經22小時蓄積了106g/L羥基乙酸，未檢出作為從乙二醇生成羥基乙酸的中間體的羥基乙醛。另一方面，野生株中即使在反應22小時後也未檢出羥基乙酸。
表2培養基組成

(其餘部分水)實施例4由大腸桿菌MG1655/pGAPfucO-a1dA株、大腸桿菌MG1655野生株生產羥基乙酸與實施例3相同地培養實施例2得到的大腸桿菌MG1655/pGAPfucO-aldA株、大腸桿菌MG1655野生株。培養開始24小時後，直接在培養中的培養槽中以5g/小時的速度經22小時添加乙二醇，進行反應。用HPLC根據定量法測定得到的培養液中的羥基乙酸蓄積量。結果如圖2(圖2)所示。
確認了在大腸桿菌MG1655/pGAPfucO-aldA株中開始添加乙二醇22小時後蓄積了110g/L羥基乙酸，未檢出作為從乙二醇生成羥基乙酸的中間體的羥基乙醛。另一方面，野生株中即使開始添加乙二醇22小時後也未檢出羥基乙酸。
實施例5製作大腸桿菌MG1655aldA缺失株已報導了大腸桿菌的染色體組DNA的全部鹼基序列(GenBankaccession number U00096)。也已報導了大腸桿菌的乳醛脫氫酶的胺基酸序列及基因(以下省略為aldA)的鹼基序列(GenBank accessionnumber M64541)。使用基於大腸桿菌MG1655株的染色體組DNA的aldA附近區域的基因信息製得的TACTGCAGTGATCCTTGCAGGCAATGC(序列號8)及GGTCTAGAATCATCAGAGAGACGGAATCG(序列號9)、GGTCTAGAATGAGTGAAAGAGGCGGAG(序列號10)及AAGGTACCGATGCTGGTGCGAAGAAGG(序列號11)進行PCR。分別用限制酶PstI與XbaI、XbaI與KpnI消化得到的DNA片段，分別得到約800bp、700bp的片段。混合該DNA片段與用PstI、KpnI消化溫度感受性克隆載體pTH18cs1(GenBank accession numberAB019610)[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用連接酶連接後，在30℃下轉化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒。
在30℃下將該質粒轉化至大腸桿菌MG1655株，將其在30℃下在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中培養一夜，得到轉化體。將得到的轉化體接種在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中，在30℃下培養一夜。然後塗布在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上以得到上述培養菌體，得到在42℃下繁殖的菌落。將得到的菌落在不含有藥劑的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，進一步塗布在不含有藥劑的LB瓊脂平板上，得到在42℃下繁殖的菌落。
從出現的菌落中隨機選取100菌落，使其分別在不含有藥劑的LB瓊脂平板與含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖，選擇僅在不含有藥劑的LB瓊脂平板中繁殖的氯黴素感受性克隆。進一步從上述目標克隆的染色體DNA通過PCR擴增含有aldA的約3.2kb的斷片，選出aldA缺失株，將得到的株命名為MG1655aldA缺失株(以下省略為ΔaldA)。
實施例6ΔaldA/pGAPfucO株的構建將實施例1得到的質粒pGAPfucO轉化至實施例得到的ΔaldA株，在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板中在37℃下培養一夜，得到ΔaldA/pGAPfucO株。
實施例7由ΔaldA/pGAPfucO株生產羥基乙酸與實施例3相同地分別培養ΔaldA/pGAPfucO株、MG1655/pGAPfucO株，收集菌體、清洗後，與實施例3相同地向得到的菌體中添加乙二醇，反應10小時。確認了通過反應在ΔaldA/pGAPfucO株中蓄積了64.8g羥基乙酸，在MG1655/pGAPfucO株中蓄積了64.2g羥基乙酸。顯示了在羥基乙酸的生產中未必需要乳醛脫氫酶。
實施例8大腸桿菌MG1655/pGAPfucO-aldA株與大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株的菌體增殖比較與實施例3相同地培養實施例2得到的大腸桿菌MG1655/pGAPfucO-aldA株、實施例1得到的大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株。其中，將表1(表1)所示的培養基組成中的葡萄糖量改為70g/L進行培養。培養24小時後，通過離心分離全部培養液收集菌體，測定得到的溼菌體重量。另外，根據定量法測定培養基中殘留的葡萄糖量，計算菌體增殖所需要的葡萄糖量。結果如表3(表3)所示。
表明儘管2種菌株之間得到的菌體重量大致相同，但此時所需的葡萄糖量在MGl655/pGAPfucO-aldA株中減少了2成以上。實施例7中顯示生產羥基乙酸未必需要乳醛脫氫酶，但是確認其通過增強該酶活性具有減少在羥基乙酸生產中所需的葡萄糖量的效果。
表3

實施例9將大腸桿菌MG1655株染色體組上的fucO啟動子置換成GAPDH啟動子大腸桿菌的染色體組DNA的全部鹼基序列(GenBank accessionnumber U00096)已公知，也報導了大腸桿菌fucO的鹼基序列(GenBank accession number M31059)。使用基於大腸桿菌MG1655株的fucO的5』附近區域的基因信息製得的GCTCTAGACCTTCTCCTTGTTGCTTTACG(序列號12)與AACTGCAGAGAGAGGTAGCTAATGGAACG(序列號13)，以大腸桿菌染色體組DNA為模板進行PCR，擴增約650bp的DNA片段。
另外，基於大腸桿菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子的序列信息製得的GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCG(序列號14)與基於大腸桿菌MG1655株的fucO的序列信息製得的CAGGTACCATCCTTATCACCAGCAACC(序列號15)，以實施例1製作的表達載體pGAPfucO為模板進行PCR，得到由GAPDH啟動子與fucO的起始密碼子附近區域構成的約730bp的DNA片段。
分別使用限制酶PstI與XbaI、XbaI與KpnI消化上述得到的片段，混合該片段與使用PstI和KpnI消化溫度感受性質粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用連接酶連接後，在30℃下轉化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒。在30℃下將該質粒轉化至大腸桿菌MG1655株，在30℃下在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中培養一夜，得到轉化體。將該得到的轉化體接種在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中，在30℃下培養一夜。然後塗布在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上以得到上述培養菌體，得到在42℃下繁殖的菌落。將得到的菌落在不合有藥劑的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，再塗布在不含有藥劑的LB瓊脂平板上，得到在42℃下繁殖的菌落。
從出現的菌落中隨機選取100個菌落，使其分別在不含有藥劑的LB瓊脂平板與含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖，選擇氯黴素感受性克隆。進一步從上述目標克隆的染色體DNA通過PCR擴增含有GAPDH啟動子與fucO部分序列的約730bp的斷片，選出fucO啟動子區域被置換成GAPDH啟動子的菌株，將滿足上述條件的克隆命名為MG1655fucO缺失GAPpfucO染色體組插入株。
實施例10由MG1655fucO缺失GAPpfucO染色體組插入株生產羥基乙酸與實施例3相同地培養大腸桿菌MG1655fucO缺失GAPpfucO染色體組插入株，收集菌體、清洗後，與實施例3相同地向得到的菌體中添加乙二醇，反應24小時。未確認蓄積羥基乙酸。
實施例11使用低拷貝載體構建fucO表達載體使用基於大腸桿菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子的序列信息製得的AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列號3)與基於大腸桿菌MG1655株的fucO序列信息製得的GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(序列號2)，以實施例1中製作的表達載體pGAPfucO為模板進行PCR，得到由GAPDH啟動子與fucO構成的約1300bp的DNA片段。
混合該DNA片段與用限制酶HincII消化質粒pACYC184(GenBank accession number X06403)得到的片段，使用接合酶連接後，轉化至大腸桿菌DH5株，得到在含有20μg/mL氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有20μg/mL氯黴素的LB液體培養基中在37℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pACYCfucO。將該質粒pACYCfucO轉化至大腸桿菌MG1655株，在含有20μg/mL氯黴素的LB瓊脂平板中，在37℃下培養一夜，得到MG1655/pACYCfucO株。
實施例12由MG1655/pACYCfucO株生產羥基乙酸與實施例3相同地培養大腸桿菌MG1655/pACYCfucO株，收集菌體、清洗後，與實施例3相同地向得到的菌體中添加乙二醇，反應9小時。通過反應蓄積了28g羥基乙酸。
實施例13測定MG1655野生株、MG1655fucO缺失GAPpfucO染色體組插入株、MG1655/pACYCfucO株、MG1655/pGAPfucO株的乳醛還原酶的活性。
與實施例3相同地培養各菌株。收集培養後的菌體並清洗後，混懸在pH7.4的50mM磷酸鉀緩衝液中，進行超聲波破碎。離心分離破碎後的菌體提取液，將上清液用於乳醛還原酶的活性測定。使用乙二醇作為基質，通過用分光光度計測定反應生成的還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的增加實施活性測定。計算每單位重量用於反應的可溶性蛋白質在1分鐘內的還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的生成量，MG1655野生株的值為1時的結果如表4(表4)所示。
顯示了MG1655fucO缺失GAPpfucO染色體組插入株中，乳醛還原酶活性顯著上升為MG1655野生株的18倍，但是，對羥基乙酸的生產而言其活性增強並不充分，至少通過導入低拷貝載體而增強活性時將活性增強1700倍左右對利用乳醛還原酶單獨增強生產羥基乙酸而言是必要的。
表4

實施例14由大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株、大腸桿菌MG1655野生株生產L-甘油酸與實施例3相同地培養大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株及大腸桿菌MG1655野生株，收集菌體、清洗後，向得到的菌體中一次性添加甘油至濃度為150g/L代替在實施例3中添加乙二醇，最終液體量為500ml，反應24小時。使用光學異構體分離用柱經HPLC根據定量法測定得到的培養液中的L-甘油酸的蓄積量。確認了在大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株中經24小時蓄積了67g/L的L-甘油酸。未確認在大腸桿菌MG1655野生株中蓄積有L-甘油酸。
實施例15利用大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株、大腸桿菌MG1655野生株生產羥基乙氧基乙酸與實施例3相同地培養大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株及大腸桿菌MG1655野生株。通過離心分離(8000rpm、20分鐘)收集培養開始24小時後的菌體，用pH7.2的1mM磷酸鉀緩衝液清洗。用相同緩衝液混懸清洗後的約300mg菌體，在最終濃度為100mM的二甘醇的存在下，以4ml最終溶液量反應18小時。在大氣壓下、反應溫度為37℃下通過磁力攪拌器邊攪拌邊進行反應。利用HPLC根據定量法測定得到的反應液中的羥基乙氧基乙酸。確認了在大腸桿菌MG1655/pGAPfucO株中蓄積有1g/L的羥基乙氧基乙酸。未檢出以二甘醇酸為代表的來自二甘醇的副產物。另外，未確認在大腸桿菌MG1655野生株中蓄積羥基乙氧基乙酸。
實施例16製作大腸桿菌MG1655glcDEF基因缺失株大腸桿菌的染色體組DNA的全部鹼基序列(GenBank accessionnumber U00096)已公知，也已報導了大腸桿菌的glcDEF基因的鹼基序列(GenBank accession number L43490)。使用基於大腸桿菌MG1655株的染色體組DNA的glcDEF基因附近區域的基因信息製得的TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG(序列號16)與TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG(序列號17)、GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG(序列號18)與AACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC(序列號19)進行PCR。使用限制酶KpnI與XbaI、XbaI與PstI消化所得的DNA片段，分別得到約670bp、790bp的片段。混合該DNA片段和使用KpnI、PstI消化溫度感受性克隆載體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用連接酶連接後，在30℃下轉化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒。將該質粒命名為pTHΔglcDEF。
在30℃下將該質粒pTHΔglcDEF轉化至大腸桿菌MG1655株，在30℃下在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中培養一夜，得到轉化體。將得到的轉化體接種在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中，在30℃下培養一夜。然後塗布在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上以得到上述培養菌體，得到在42℃下繁殖的菌落。將得到的菌落在不含有藥劑的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，進一步塗布在不含有藥劑的LB瓊脂平板中，得到在42℃下繁殖的菌落。
從出現的菌落中隨機地選取100個菌落，使其分別在不合有藥劑的LB瓊脂平板與含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖，選擇僅在不含有藥劑的LB瓊脂平板中繁殖的氯黴素感受性克隆。進一步從上述目標克隆的染色體DNA通過PCR使其擴增含有glcDEF基因的約3.8kb的斷片，選出glcDEF基因區域缺失的菌株，將得到的菌株命名為MG1655glcDEF基因缺失株(以下省略為ΔglcDEF株)。
實施例17製作大腸桿菌MG1655pflB基因缺失株已報導了大腸桿菌的pflB基因的鹼基序列(GenBank accessionnumber X08035)。使用基於MG1655株的染色體DNA的pflB基因附近區域的基因信息製得的GCACGAAAGCTTTGATTACG(序列號20)與TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(序列號21)、TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(序列號22)與AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(序列號23)進行PCR。分別使用限制酶HindIII與SphI、SphI與PstI消化得到的DNA片段，分別得到約1770bp、約1340bp的片段。混合該DNA片段與使用HindIII、PstI消化溫度感受性克隆載體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用連接酶連接後，在30℃下轉化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖的轉化體。將得到的菌落在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒。在30℃下該質粒轉化至大腸桿菌MG1655株，在30℃下在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中培養一夜，得到轉化體。將得到的轉化體接種在含有10μg/ml氯黴素的LB液體培養基中，將其在30℃下培養一夜。然後塗布在含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上以得到上述培養菌體，得到在42℃下繁殖的菌落。將得到的菌落在不含有藥劑的LB液體培養基中在30℃下培養一夜，進一步塗布在不含有藥劑的LB瓊脂平板中，得到在42℃下繁殖的菌落。
從出現的菌落中隨機地選取100個菌落，使其分別在不含有藥劑的LB瓊脂平板與含有10μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板中繁殖，選擇僅在不含有藥劑的LB瓊脂平板中繁殖的氯黴素感受性克隆。進一步從上述目標克隆的染色體DNA通過PCR使其擴增含有pflB基因的約2.0kb的斷片，選出pflB基因區域缺失的菌株，將得到的菌株命名為MG1655plfB基因缺失株(以下省略為ΔpflB株)。
實施例18製作大腸桿菌MG1655pflBglcDEF基因缺失株將實施例16得到的質粒pTHΔglcDEF轉化至ΔpflB株，最終得到MG1655pflBglcDEF基因缺失株(以下省略為ΔpflBΔglcDEF株)。詳細的方法遵照實施例16所述的方法。
實施例19構建ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔplfB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株將實施例1得到的質粒pGAPfucO轉化至實施例16得到的ΔglcDEF株、實施例17得到的ΔplfB株及實施例18得到的ΔplLBΔglcDEF株，通過在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板中，在37℃下培養一夜，得到ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔplfB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株。
實施例20由ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔplfB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株生產羥基乙酸與實施例3相同地培養實施例3得到的MG1655/pGAPfucO株、實施例19得到的ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔplfB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株。通過離心分離(8000rpm、20分鐘)收集培養24小時後的菌體，用蒸餾水清洗。稱量75g清洗後的集菌體，將其與150g乙二醇一同混懸在蒸餾水中，最終溶液量為1500ml。將混懸液移入ABLE社制培養裝置DPC-2的培養槽中，反應22小時。反應在大氣壓下、通氣量為0.7vvm、攪拌速度為800rpm、反應溫度為35℃、pH7.2(用氨水調節)下進行。用HPLC根據定量法測定得到的反應液中的羥基乙酸及乙二酸、乙酸的蓄積量、乙二醇的殘留量。結果如表5(表5)所示。glcDEF基因及/或pflB基因的缺失可使乙二酸、乙酸之類副生成的有機酸減少，且提高乙二醇的轉化率，顯著提高羥基乙酸的生產率。
表5

序列表110三井化學株式會社120羥基羧酸類的生產方法130F00044316023210121144212DNA213人工序列220
223PCR引物4001cgaattccgg agaaagtctt atgatggcta acagaatgat tctg 44210221129212DNA213人工序列220
223PCR引物4002gtgaagcttg catttaccag gcggtatgg 29210321130212DNA213人工序列220
223PCR引物4003aacgaattct cgcaatgatt gacacgattc 30210421132212DNA213人工序列220
223PCR引物4004acagaattcg ctatttgtta gtgaataaaa gg 32210521145212DNA213人工序列220
223PCR引物4005gctctagacg gagaaagtct tatgatggct aacagaatga ttctg 45210621143212DNA213人工序列220
223PCR引物
4006cgaattccgg agaaagtctt atgtcagtac ccgttcaaca tcc 43210721129212DNA213人工序列220
223PCR引物4007gctctagact ctttcactca ttaagactg 29210821127212DNA213人工序列220
223PCR引物4008tactgcagtg atccttgcag gcaatgc 27210921129212DNA213人工序列220
223PCR引物4009ggtctagaat catcagagag acggaatcg 292101021127212DNA213人工序列220
223PCR引物40010ggtctagaat gagtgaaaga ggcggag 272101121127212DNA213人工序列220
223PCR引物40011aaggtaccga tgctggtgcg aagaagg 272101221129212DNA213人工序列220
223PCR引物40012gctctagacc ttctccttgt tgctttacg 29
2101321129212DNA213人工序列220
223PCR引物40013aactgcagag agaggtagct aatggaacg 292101421128212DNA213人工序列220
223PCR引物40014ggtctagagc aatgattgac acgattcg 282101521127212DNA213人工序列220
223PCR引物40015caggtaccat ccttatcacc agcaacc 272101621126212DNA213人工序列220
223PCR引物40016ttggtaccgt tctgccagcaa ctgacg 262101721128212DNA213人工序列220
223PCR引物40017tgtctagagt acctctgtgc gtcactgg 282101821128212DNA213人工序列220
223PCR引物40018gctctagacg ctttgttgtg ttgtgtgg 282101921128212DNA213人工序列
220
223PCR引物40019aactgcagga tcggtcaatg attgcagc 282102021120212DNA213人工序列220
223PCR引物40020gcacgaaagc tttgattacg 202102121130212DNA213人工序列220
223PCR引物40021ttattgcatg cttagatttg actgaaatcg 302102221130212DNA213人工序列220
223PCR引物40022ttattgcatg cttatttact gcgtacttcg 302102321121212DNA213人工序列220
223PCR引物40023aaggcctacg aaaagctgca g 2權利要求
1.一種以末端具有羥基的脂肪族多元醇類為基質的羥基羧酸類的生產方法，其特徵在於，該生產方法利用下述微生物，該微生物被賦予或增強了催化由乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶的活性。
2.如權利要求1所述的生產方法，其特徵在於，通過以質粒的形態導入編碼權利要求1所述的酶的基因而賦予或增強微生物的該酶活性。
3.一種以末端具有羥基的脂肪族多元醇類為基質的羥基羧酸類的生產方法，其特徵在於，該生產方法利用下述微生物，所述微生物通過以質粒的形態導入編碼催化由乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶與催化由羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的酶這樣2種酶的基因而賦予或增強了所述2種酶的活性。
4.如權利要求2或3所述的生產方法，其特徵在於，所述生產方法利用下述微生物，該微生物通過功能性地連接編碼催化由乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶的基因及/或編碼催化由羥基乙醛生成羥基乙酸反應的酶的基因與負責和糖酵解體系、核酸生物合成體系或胺基酸生物合成體系有關的蛋白質的表達的基因的啟動子而表達該酶。
5.如權利要求1～4中的任一項所述的生產方法，其中，催化由乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶為乳醛還原酶，催化由羥基乙醛生成羥基乙酸的反應的酶為乳醛脫氫酶。
6.如權利要求1～5中的任一項所述的生產方法，其特徵在於，該生產方法利用特點為該微生物本來具有的羥基乙酸氧化酶活性失活或下降、且/或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活或下降的微生物。
7.如權利要求1～6中的任一項所述的生產方法，其特徵在於，羥基羧酸為具有光學活性的羥基羧酸。
8.一種用於權利要求1～7中的任一項所述的生產方法的微生物。
9.一種羥基乙酸水溶液，所述羥基乙酸水溶液是在權利要求6所述的生產方法中，以乙二醇為基質，以95％以上的收率、2g/L/小時以上的生產速度得到的羥基乙酸水溶液。
全文摘要
以羥基乙酸為代表的羥基羧酸是有望作為聚合物原料或醫藥中間體的化合物。但是迄今為止所知的羥基羧酸的生產方法存在無法廉價地提供高純度的羥基羧酸的問題。本發明的目的在於創造出在短時間內高產率地生產出雜質少的羥基羧酸的微生物、提供使用該微生物的以羥基乙酸為代表的羥基羧酸的製造方法。創造出賦予或增強了催化從乙二醇生成羥基乙醛的反應的酶活性的微生物，使用該微生物在短時間內高產率地生產雜質少的以羥基乙酸為代表的羥基羧酸。根據該生產方法，可以廉價地提供高純度的羥基羧酸。
文檔編號C12N1/20GK1954078SQ200580013210
公開日2007年4月25日 申請日期2005年4月19日 優先權日2004年4月27日
發明者和田光史, 望月大資, 高橋均, 森重敬, 高橋克幸 申請人:三井化學株式會社