用於三維列印的粘土基水凝膠基質及其製備方法和應用與流程
2023-05-07 15:54:06 4
本發明涉及生物材料技術領域，具體涉及一種用於三維列印的粘土基水凝膠基質及其製備方法和應用。
背景技術：
水凝膠是一種通過共價鍵、氫鍵或範德華力等作用相互交聯構成的具有三維網狀結構、能在水中溶脹並保持大量水分而又不溶解的聚合物.由於天然或合成的聚合物水凝膠在結構及性能上與生物體組織相似，因此近20年來，水凝膠一直是生物醫用工程領域，特別是組織工程方面的診斷、治療、修復或替換人體組織器官或增進其功能與生長因子、藥物和基因載體等的一個研究熱點。
熱聚合、紫外聚合是水凝膠製備中較常用的聚合方法。其中熱聚合在凝膠體系中加入熱引發劑後，聚合時間不可控，需要隨時調整列印時所需壓力，或可能由於聚合過快，造成後期無法列印的問題。而採用紫外光對三維支架進行固化，則不存在上述問題，它可以在列印凝膠漿料的同時對其進行固化，但該方法對凝膠漿料的要求較高，需要其在較短時間內發生紫外交聯成膠，否則列印出的凝膠支架的結構無法良好地保持，因此大大縮小了材料的可選擇性。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供了一種可用於三維列印中紫外光固化的粘土基水凝膠基質，所述粘土基水凝膠基質包括特定配比的無機黏土、帶碳碳雙鍵的生物相容大分子、紫外光引發劑和水，其配方簡單、成分安全，所述粘土基水凝膠基質在經紫外光交聯前具有一定的預形狀，可實現先列印，後固化成膠，批量列印三維凝膠支架，大大提高了三維列印效率。
第一方面，本發明提供了一種用於三維列印的粘土基水凝膠基質，所述粘土基水凝膠基質包括如下質量百分含量的原料組分：
交聯劑：10-50％；
無機粘土：3-20％；
紫外光引發劑：0.05-0.1％；
水：30-86％；
上述各原料組分的總質量百分含量為100％；其中，所述交聯劑為帶碳碳雙鍵的生物相容大分子，所述生物相容大分子為聚乙二醇、聚乙烯醇、殼聚糖、明膠、透明質酸中的一種或多種。
本發明通過上述特定質量配比的各種原料的協同作用，獲得的所述粘土基水凝膠基質具有適宜的列印粘度和強度，在紫外光交聯前具有一定的預形狀。在常溫下可以將所述粘土基水凝膠基質列印成力學強度、拉伸性能較好的穩定三維凝膠支架前驅體，便於後期對支架前驅體進行統一的紫外光固化，得到三維凝膠支架。所述粘土基水凝膠基質適用於批量列印製得三維列印凝膠支架，大大提高了三維列印效率，非常適合工業化生產。
在紫外光的作用下，本申請的所述粘土基水凝膠基質中，所述交聯劑的碳碳雙鍵之間發生交聯，形成的聚合物長鏈穿插在無機黏土的有序片層結構中，形成三維網絡結構的水凝膠，使得凝膠形狀得以保持，同時無機粘土也充當物理交聯的作用，其與帶碳碳雙鍵的生物相容大分子之間形成的氫鍵作用、範德華力等，也使得列印出的三維凝膠支架的強度進一步提高，充分發揮物理交聯與化學交聯的協同效應。提高凝膠支架的穩定性。
所述無機粘土可以選自高嶺土、膨潤土、蒙脫土、鋰皂石(laponite，鋰藻土)、鋰蒙脫石(hectorite)、貝得石、皂石、矽鎂石、矽酸鎂鋁、其它矽酸鋁和各種其它天然和/或合成的粘土，以及它們的組合。
優選地，所述無機粘土的粒徑不超過500nm。進一步優選為50-200nm。
在本發明的一優選實施方式中，所述無機粘土為鋰皂石粘土。該鋰皂石粘土可以在水中快速剝離分散成單片層，形成無色透明的膠體分散液，穩定性好。該黏土可以為購買自Rockwood公司的Laponite XLG。Laponite XLG是合成的層狀粘土(layeredclay)，與天然蒙脫石類似。
本申請中，無機黏土的加入，可有效提高水凝膠支架的強度，無機黏土相當於充當了物理交聯劑的作用。此外，控制所述無機黏土的含量可以調控所述粘土基水凝膠基質的粘度，使所述粘土基水凝膠基質具有一定的預形狀，可以實現先列印後固化。
優選地，所述粘土基水凝膠基質的粘度為30-350Pa·s。待列印的所述粘土基水凝膠基質應該具有一定的粘度，粘度過高，流動性較差，列印時需要的壓力過大，且材料不容易混勻；溶液黏度過低，流動性太高，列印時塑形困難，支架會發生塌陷，無法保持預形狀。本申請中，將無機粘土的含量控制在3％-20％之間，可以使所述粘土基水凝膠基質的粘度控制在30-350Pa·s。
進一步優選地，所述無機黏土的質量百分含量為5-15％。更優選為8-15％。當所述無機黏土的質量百分含量提高至8％以上，所述粘土基水凝膠基質達到較高的黏度，其列印成的凝膠支架前驅體經固化後，固化的凝膠支架的拉伸率可以達到5000％左右，力學強度有了明顯提高。
優選地，所述粘土基水凝膠基質包括如下質量百分含量的原料組分：
交聯劑：10-50％；
無機粘土：5-15％；
紫外光引發劑：0.05-0.1％；
水：35-84％；
上述各原料組分的總質量百分含量為100％。
進一步優選地，所述粘土基水凝膠基質的粘度為50-250Pa·s。更優選為100-200Pa·s。
本申請中，帶碳碳雙鍵的生物相容大分子的成膠效果較好，在所述無機粘土與水形成的分散液中，不需要額外添加化學交聯劑，經紫外光聚合，即可得到強度較高的凝膠結構。形成的三維凝膠支架的毒性低，細胞相容性好。在提供細胞(例如成骨細胞以及骨髓間充質幹細胞)生長所需的三維環境的同時，對細胞起到促進其黏附、生長與增殖的作用。
在本發明一實施方式中，所述交聯劑的分子鏈的至少一端帶有碳碳雙鍵。所述交聯劑可以為甲基丙烯酸、丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)修飾的明膠、透明質酸、聚乙烯醇等。例如可以是甲基丙烯酸修飾的明膠，丙烯酸修飾的透明質酸、丙烯酸修飾的聚乙烯醇、低分子量(分子量小於1000道爾頓)的PEGDA修飾的殼聚糖等。
在本發明另一實施方式中，所述交聯劑的分子鏈的至少一端帶有碳碳雙鍵，所述交聯劑的分子鏈中間為聚乙二醇的主鏈結構。
進一步優選地，所述交聯劑為聚乙二醇二丙烯酸酯。
所述交聯劑除了可促進凝膠形成、提高凝膠力學強度外，還可以通過控制其分子量和固含量，以達到控制細胞在製得的支架上黏附、生長、增殖甚至分化等目的。例如，聚乙二醇分子量為4000，固含量為20％時，細胞能夠在支架上黏附及伸展情況良好；但當聚乙二醇的分子量為10000以上時，細胞在支架上成球形，不能很好地展開，細胞增殖行為相對較弱。
優選地，所述交聯劑中，聚乙二醇的主鏈結構的分子量為1000-10000。例如可以為2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000或9000。進一步優選為2000-8000。
本申請中，所述交聯劑的質量百分含量為10-50％。例如可以為15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。進一步優選為20-40％。
優選地，所述粘土基水凝膠基質包括如下質量百分含量的原料組分：
交聯劑：20-40％；
無機粘土：3-20％；
紫外光引發劑：0.05-0.1％；
水：40-76％；
上述各原料組分的總質量百分含量為100％。
進一步優選地，所述粘土基水凝膠基質包括如下質量百分含量的原料組分：
交聯劑：20-40％；
無機粘土：5-15％；
紫外光引發劑：0.05-0.1％；
水：45-74％；
上述各原料組分的總質量百分含量為100％。
本申請中所選用的紫外光引發劑為生物相容性良好的引發劑，其用量極少，且幾乎不會對後期三維凝膠支架的細胞實驗產生影響。
在本發明一實施方式中，所述紫外光引發劑為2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2-羥基-4』-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮、1-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2』，2』-二甲基乙酮(Irgacure2959)、1-羥基環己基苯基酮、α,α』-二甲氧基-α-苯基苯乙酮和2-甲基-1-(4-甲硫基苯基)-2-嗎啉-1-丙酮中的一種或多種。並不限於本申請所列舉的這幾種。
優選地，所述水的質量百分含量為35-84％。進一優選為40-76％。更優選為45-74％。
第二方面，本發明提供了一種上述用於三維列印的粘土基水凝膠基質的製備方法，包括以下步驟：
按上述配方量，稱取交聯劑、無機黏土、紫外光引發劑，加入水混合均勻，得到所述粘土基水凝膠基質，上述各原料按如下質量百分含量混合：
交聯劑：10-50％；
無機粘土：3-20％；
紫外光引發劑：0.05-0.1％；
水：30-86％；
上述各原料組分的總質量百分含量為100％；其中，所述交聯劑為帶碳碳雙鍵的生物相容大分子，所述生物相容大分子為聚乙二醇、聚乙烯醇、殼聚糖、明膠、透明質酸中的一種或多種。
本發明實施例第二方面提供的製備方法，工藝簡單，製備得到的所述粘土基水凝膠基質的粘度合適，具有一定的預形狀，可實現先列印，後固化成膠，適用於批量列印三維凝膠支架，大大提高了三維列印效率。
本發明第三方面提供了一種三維凝膠支架的製備方法，包括以下步驟：
(1)取本發明第一方面的所述粘土基水凝膠基質，將其在常溫下進行三維列印，得到三維凝膠支架前驅體；
(2)將所述三維凝膠支架前驅體置於紫外光下進行交聯固化，得到三維凝膠支架。所述三維凝膠支架由無機黏土、帶碳碳雙鍵的生物相容大分子、紫外光引發劑通過紫外光聚合而成。
優選地，所述交聯固化的時間為1200s-3000s，即30-50min。
優選地，所用紫外光的能量密度為0.1-999,990μJ/cm2。
進一步優選為100-500mJ/cm2。更優選為120mJ/cm2。
優選地，所用紫外光的波長為230-400nm。進一步優選為250-350nm。更優選為254nm。
三維列印技術可以對支架的孔徑、孔隙、連通率等進行靈活調控。需要調控氣壓、間距、層高等參數來獲得所期望的支架。一般而言，所述粘土基水凝膠基質的粘度較大時，列印所需的氣壓較大，粘度較小時，列印所需要的氣壓較小。列印時支架的行間距越大，最終得到的三維凝膠支架的孔隙率越大，支架的壓縮強度越小。
本發明實施例中，所述三維凝膠支架前驅體、三維凝膠支架為規則的幾何體(如長方體、正方體、圓柱體等，但不限於此)以及其他不規則的三維多孔結構體。優選為規則幾何體。進一步優選為長方體。
本發明一實施例中，所述三維凝膠支架的底面邊長為10-30mm，高度為3-8mm，行間距為200-500μm，但不限於此，本領域技術人員可根據具體細胞培養條件選擇並製備合適的相應大小的三維凝膠支架。
本發明一實施例中，所述三維凝膠支架的孔隙率為70-95％。
所述三維凝膠支架上形成有多個孔洞，所述孔洞的孔徑為200-600μm。
本發明第三方面提供的所述三維凝膠架的製備方法中，採用上述特定配比的無機粘土、交聯劑、紫外光引發劑、水構成的所述粘土基水凝膠基質(黏土基凝膠支架的三維列印漿料)，所述粘土基水凝膠基質的粘度合適，具有一定的預形狀，適合連續、批量列印，固化後得到三維凝膠支架，大大提高了三維列印效率。所述三維凝膠支架的製備方法，工藝簡單，可控性強，能耗較低，無需改變列印過程中的壓力，製造成本低廉，實用性較強。
第四方面，本發明還提供了如本發明第三方面所述的三維凝膠支架的製備方法得到的三維凝膠支架。
第五方面，本發明還提供了一種如本發明第一方面所述的粘土基水凝膠基質或如本發明第四方面所述的三維凝膠支架在製備組織修復材料中的應用。優選為在骨組織修復材料的應用。
本發明實施例的優點將會在下面的說明書中部分闡明，一部分根據說明書是顯而易見的，或者可以通過本發明實施例的實施而獲知。
附圖說明
圖1是分子量分別為4000和10000的聚乙二醇(B，D)以及雙鍵修飾後的分子量為4000和10000的聚乙二醇(A，C)的核磁圖譜；
圖2為Rockwood公司生產的Laponite XLG黏土(a)、雙鍵修飾後的分子量為4000和10000的聚乙二醇(b，c)以及其分別與上述粘土交聯形成凝膠支架後的紅外圖譜(d，e)；
圖3為成骨細胞在本發明實施例1-3製得的黏土基三維凝膠支架上鋪展的掃描電鏡圖。
具體實施方式
以下所述是本發明實施例的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明實施例原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明實施例的保護範圍。
下面分多個實施例對本發明實施例進行進一步的說明。其中，本發明實施例不限定於以下的具體實施例。在不變主權利的範圍內，可以適當的進行變更實施。
下述實施例中所用的聚乙烯醇為市售商品，(1788型，醇解度87-89％，阿拉丁)；所述羥基磷灰石購買自南京埃普瑞納米材料有限公司，醫用級。
若無特別說明，本發明實施例所採用的試劑皆為市售商品。
實施例1：
一種黏土基三維凝膠支架的製備方法，包括如下步驟：
A.雙鍵修飾的聚乙二醇(Mn＝4000)大分子交聯劑的製備
首先將1.2ml的丙烯醯氯溶於10ml二氯甲烷中，配製成丙烯醯氯溶液。隨後將10g的聚乙二醇(Mn＝4000)置於50ml的三口燒瓶中，加入20ml的二氯甲烷溶解，室溫下攪拌均勻。在冰水浴條件下，緩慢加入2.1ml的三乙胺溶液。隨後，在冰水浴條件下，逐滴加入提前配置好的丙烯醯氯溶液。控制體系溫度為零度，直至丙烯醯氯全部滴加完畢，氮氣保護狀態下，室溫反應24h。反應結束後，濾去體系中形成的三乙胺鹽酸鹽，並用無水乙醚沉澱出合成出的雙鍵修飾的聚乙二醇(Mn＝4000)，得到的粗產物經過真空乾燥1d、透析7d、過濾、凍幹2d後得到純度較高的雙鍵修飾的聚乙二醇大分子交聯劑，即為聚乙二醇二丙烯酸酯，其分子式為CH2＝CHCO-(OCH2CH2)nOCOCH＝CH2(n為88)。
B.可用於三維列印的紫外光固化納米粘土基水凝膠基質的製備
將步驟A得到的雙鍵修飾的聚乙二醇大分子交聯劑(Mn＝4000)、Laponite XLG鋰皂石粘土、紫外光引發劑2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮與水相混合，其中，上述各原料按如下質量百分含量混合：
聚乙二醇二丙烯酸酯(聚乙烯的分子量Mn＝4000)20％
Laponite XLG粘土：5％
紫外光引發劑：0.05％
水：74.95％；
室溫下混合均勻後，得到可用於三維列印的紫外光固化粘土基水凝膠基質，所述粘土基水凝膠基質的粘度為160Pa·s。
C、支架製備：
按照所期望的支架結構來設置列印參數，將上述粘土基水凝膠基質在常溫下進行三維列印，得到三維凝膠支架前驅體，該三維凝膠支架前驅體的三維列印參數為底面邊長為15mm，高度為5mm，支架行間距為300μm；
將列印好的所述三維凝膠支架前驅體置於紫外交聯儀中，在254nm下進行光固化25min，得到黏土基三維凝膠支架。檢測該黏土基三維凝膠支架的孔隙率為75％，支架壓縮強度為1MPa。
實施例2：
一種黏土基三維凝膠支架的製備方法的方法，包括如下步驟：
(1)採用與實施例1相同的方法，對分子量為4000的聚乙二醇進行雙鍵修飾，得到交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯，CH2＝CHCO-(OCH2CH2)nOCOCH＝CH2(n為88)；
(2)採用2-羥基-4』-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮作為紫外光引發劑，Laponite XLG作為無機黏土，按下述配方量，稱取交聯劑、無機黏土、紫外光引發劑，加入水混合均勻，得到粘度為170Pa·s的粘土基水凝膠基質，上述各原料按如下質量百分含量混合：
交聯劑：30％；
無機粘土：8％；
紫外光引發劑：0.05％；
水：61.95％；
(3)將上述粘土基水凝膠基質在常溫下進行三維列印(列印參數同實施例1)，得到三維凝膠支架前驅體，將列印好的將列印好的所述三維凝膠支架前驅體置於紫外交聯儀中，在254nm下進行光固化40min後，得到黏土基三維凝膠支架。
實施例3：
一種黏土基三維凝膠支架的製備方法，包括如下步驟：
(1)採用與實施例1相同的方法，對分子量為10000的聚乙二醇進行雙鍵修飾，得到交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯，CH2＝CHCO-(OCH2CH2)nOCOCH＝CH2(n為224)；
(2)採用2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮作為紫外光引發劑，Laponite XLG作為無機黏土，按下述配方量，稱取交聯劑、無機黏土、紫外光引發劑，加入水混合均勻，得到粘度為150Pa·s的粘土基水凝膠基質，上述各原料按如下質量百分含量混合：
交聯劑：20％；
無機粘土：7％；
紫外光引發劑：0.05％；
水：72.95％；
(3)將上述粘土基水凝膠基質在常溫下進行三維列印(列印參數同實施例1)，得到三維凝膠支架前驅體，將列印好的將列印好的所述三維凝膠支架前驅體置於紫外交聯儀中，在254nm下進行光固化20min後，得到黏土基三維凝膠支架。
圖1為分子量分別為4000和10000的聚乙二醇(B，D)以及雙鍵修飾後的分子量為4000和10000的聚乙二醇(A，C)(即聚乙二醇二丙烯酸酯)的核磁圖譜。即(A)為PEGDA4000，(B)為PEG 4000，(C)為PEGDA 10000,(D)PEG 10000。其中聚乙二醇二丙烯酸酯的結構式如下式(Ⅰ)所示：
從圖1可以看出，c,d,e為聚乙二醇二丙烯酸酯上修飾的雙鍵上氫元素的特徵峰，說明雙鍵被成功地修飾到聚乙二醇上。
圖2為Rockwood公司生產的Laponite XLG黏土(a)、雙鍵修飾後的分子量為4000和10000的聚乙二醇(b，c)以及其分別與上述粘土交聯形成凝膠支架後的紅外圖譜(d，e)。圖2中D，E分別為實施例2、3中的所述粘土基水凝膠基質形成的黏土基三維凝膠支架的紅外圖。
從圖2可以看出，d，e不僅具有Laponite XLG粘土的紅外特徵峰，還具有乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)在2887，1725，1110，1467cm-1處的特徵峰，以上特徵峰分別代表PEGDA上C-H鍵，C＝O雙鍵，C-O-C的伸縮振動吸收峰，以及-CH2-的搖擺振動吸收峰，說明粘土基複合凝膠成功地被製備出來。
圖3為成骨細胞在本發明實施例1-3製得的黏土基三維凝膠支架上鋪展的掃描電鏡圖。從圖3可以看出，成骨細胞(圖中方框處為細胞)成功粘附在三維凝膠支架上的孔洞的孔壁上。
實施例4：
一種黏土基三維凝膠支架的製備方法，包括如下步驟：
(1)採用與實施例1相同的方法，對分子量為4000的聚乙二醇進行雙鍵修飾，得到交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯，CH2＝CHCO-(OCH2CH2)nOCOCH＝CH2(n為88)；
(2)採用α,α』-二甲氧基-α-苯基苯乙酮作為紫外光引發劑，膨潤土作為無機黏土，按下述配方量，稱取交聯劑、無機黏土、紫外光引發劑，加入水混合均勻，得到粘度為190Pa·s的粘土基水凝膠基質，上述各原料按如下質量百分含量混合：
交聯劑：25％；
無機粘土：10％；
紫外光引發劑：0.1％；
水：74.9％；
(3)將上述粘土基水凝膠基質在常溫下進行三維列印，得到三維凝膠支架前驅體，該三維凝膠支架前驅體的三維列印參數為底面邊長為15mm，高度為5mm，支架行間距為500μm；
將列印好的所述三維凝膠支架前驅體置於紫外交聯儀中，於254nm、120mJ/cm2的能量密度下，進行光固化20min後，得到黏土基三維凝膠支架。
實施例5
一種用於三維列印的紫外光固化粘土基水凝膠基質，所述粘土基水凝膠基質包括如下質量百分含量的原料組分：
交聯劑：40％；
無機粘土：15％；
紫外光引發劑：0.05％；
水：44.95％；
其中，所述交聯劑為甲基丙烯酸修飾的明膠；所述無機黏土為高嶺土，所述紫外光引發劑為2-甲基-1-(4-甲硫基苯基)-2-嗎啉-1-丙酮。
實施例6
一種用於三維列印的紫外光固化粘土基水凝膠基質，所述粘土基水凝膠基質包括如下質量百分含量的原料組分：
交聯劑：50％；
無機粘土：12％；
紫外光引發劑：0.08％；
水：37.92％；
其中，所述交聯劑為丙烯酸修飾的透明質酸和聚乙二醇二丙烯酸酯(實施例1中製得)；所述無機黏土為高嶺土，所述紫外光引發劑為1-羥基環己基苯基酮。
以上所揭露的僅為本發明較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利範圍，本領域普通技術人員可以理解實現上述實施例的全部或部分流程，並依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬於發明所涵蓋的範圍。