紅毛五加複合多糖、製備工藝、用途及該複合多糖組合物的製作方法

2023-05-07 18:05:06 2

專利名稱：紅毛五加複合多糖、製備工藝、用途及該複合多糖組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及中藥製藥領域。具體涉及一種從紅毛五加莖皮中提取、純化得到的重均分子量在20,000-40,000道爾頓之間，主要由阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(RGI)、半乳糖醛酸聚糖(HGs)和阿拉伯半乳聚糖(AGs)組成的複合多糖及其製備工藝、製劑及其用途，同時本申請還提供了所述紅毛五加複合多糖與黃芪提取物、當歸提取物、甘草提取物或G-CSF的組合物，通過組合能夠使各組分協同增效。
紅毛五加(Acanthopanax giraldii，Harms)為五加科五加屬多年生落葉灌木，生長於海拔1300-3500米的灌木叢林中，主要分布於陝西、甘肅、四川、寧夏、青海、河南、湖北等省，藥用部位為莖皮。
中醫認為紅毛五加皮性味辛、溫，功效為驅風溼、通關節、強筋骨，用於治療拘攣疼痛、風寒溼痺。隨著現代醫學、藥學和分子生物學的發展，人們對於紅毛五加莖皮的藥理作用也有了進一步的認識。郭輝等(西北藥學雜誌.1996.3(11).117-119)，(中醫藥研究.14.(1).8-9)對紅毛五加莖皮水提物的藥理作用研究表明紅毛五加莖皮水提物能改善環磷醯胺造成的小鼠免疫功能低下，提高荷瘤小鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF)的水平。張蒞峽等(中國中醫基礎醫學雜誌.1999.5(3).25-27)對紅毛五加莖皮粗多糖進行了抗病毒活性方面的研究，結果發現其對水泡性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒I型(HSV-1)和柯薩基病毒B3型(CB3V)均有明顯的抑制作用。陳萍等(中藥藥理與臨床.1994.(3).17-19)對紅毛五加莖皮粗多糖進行了對抗疊氮胸苷(AZT)抑制小鼠造血功能和免疫反應的藥理研究發現紅毛五加莖皮水提物粗多糖可對抗AZT引起的小鼠造血和免疫抑制的毒性反應，使其外周血白細胞、骨髓造血幹細胞和粒、單系祖細胞數目增加，脾臟T淋巴細胞增殖，白細胞介素2(IL-2)的含量升高。因此，探討以紅毛五加多糖作為有效部位用於生血，提高免疫功能及抗病毒感染等，很有前景。
本發明提供一種從紅毛五加莖皮中提取、純化得到的重均分子量在20,000-40,000道爾頓之間，主要由阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(RGIs)、半乳糖醛酸聚糖(HGs)和阿拉伯半乳聚糖(AGs)組成的複合多糖，其糖組成(Mole％)為阿拉伯糖(Ara)28.9，鼠李糖(Rha)8.93，木糖(Xyl)1.57，半乳糖醛酸(GalA)36.0，半乳糖(Gal)19.1，葡萄糖(Glc)4.31，4-甲氧基葡萄糖醛酸(4-o-me-GlcA)1.20。多糖含量為95％以上。
主要工藝流程如下紅毛五加莖皮經乾燥洗淨後，加水在100℃提取(加水量為4-5倍，每次提取1.5小時，共提取3次)。提取液60-65℃減壓濃縮至稀稠膏狀，冷卻後進行30-40％醇沉，4℃靜置8-12小時。收集上清液，噴霧乾燥，即得紅毛五加複合多糖粗品。將紅毛五加複合多糖粗品用水溶解，濃度為4-6％，用截留分子量為10K的超濾膜超濾(MWCO＝10,000)，保留液上SP Sepharose離子交換柱，洗脫液為pH5-6，30-50mM的緩衝液(取分析純的酸及其鹽，用水分別配製所需濃度的溶液，按不同比例混合即得)，緩衝液可以選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、乙酸-乙酸鈉緩衝液等。收集流出液共3個柱體積，用截留分子量為5K的超濾膜超濾(MWCO＝5,000-8,000)，保留液經70％乙醇沉澱兩次，離心，收集沉澱。沉澱加水反溶，濃度為20-30％，噴霧或冷凍乾燥，即得紅毛五加複合多糖，多糖含量在95％以上。
或收集紅毛五加水提取物經醇沉後的上清液，回收乙醇後用截留分子量為10K的超濾膜超濾及以後的步驟，同樣得到紅毛五加複合多糖。
本發明還提供了紅毛五加複合多糖注射劑的製備方法取適量的紅毛五加複合多糖，加入一種或多種藥學上可以接受的助溶劑、分散劑、載體或賦形劑，混合後製成適當注射劑如粉針、水針或凍乾粉針。每個注射劑量單位至少含30mg本發明物。
本發明提供的紅毛五加複合多糖用於治療中性粒細胞減少症、貧血、血小板減少症、病毒感染性疾病和作為抗癌輔助藥。可以是單獨用藥，也可與其它多糖或G-CSF等藥物聯合用藥。
本發明提供的紅毛五加複合多糖在生血、提高機體免疫功能方面的藥理作用為體外實驗的結果表明，單獨使用紅毛五加複合多糖時，其濃度在50-400ug/ml時，可有效地刺激用植物血凝素(PHA)活化的人的外周血單核細胞產生白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、幹擾素γ(IFN-γ)、粒/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
紅毛五加複合多糖與黃芪多糖、當歸多糖、甘草多糖或G-CSF組合後，能夠發揮協同增效作用。當紅毛五加複合多糖和黃芪多糖(參考封士蘭等.黃芪多糖生產工藝研究.中成藥.1997.19(12).5-6.中的工藝並加以改良後提取，純化而得，多糖含量在95％以上)合併用藥，紅毛五加複合多糖濃度為100ug/ml，黃芪多糖濃度為100ug/ml時，與單獨使用紅毛五加複合多糖或黃芪多糖，濃度為200ug/ml比較，刺激用PHA活化的人的外周血單核細胞產生IL-6、GM-CSF和G-CSF的能力增強。當紅毛五加複合多糖和G-CSF合併用藥，紅毛五加複合多糖用量為100mg/kg/d，G-CSF用量為100ug/kg/d，與單獨使用紅毛五加複合多糖，用量為100mg/kg/d，或單獨使用G-CSF用量為100ug/kg/d相比較，刺激Balb/c小鼠產生粒/巨噬細胞集落形成細胞(GM-CFC)和紅系爆增式集落形成細胞(BFU-E)的能力明顯增強。
體內實驗的結果表明，對接受放療的Balb/C小鼠單獨使用紅毛五加複合多糖，當用藥量為50-200mg/kg/d，皮下注射給藥，連續使用7天，與安慰劑組比較，白細胞和血小板的恢復提前了4-7天。進一步的研究表明，給藥組小鼠骨髓造血幹細胞和粒、單系祖細胞數目增加，脾臟T淋巴細胞增殖。當紅毛五加複合多糖和黃芪多糖合併用藥，用藥量為紅毛五加複合多糖100mg/kg/d，黃芪多糖100mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用紅毛五加複合多糖或黃芪多糖，用藥量為200mg/kg/d組相比較，白細胞的恢復提前了2-4天。當紅毛五加複合多糖和當歸多糖(參考張林維等.當歸多糖的分離純化及其部分性質的研究.生物學雜誌.1998.15(3).12-14.並加以改良後提取，純化而得。多糖含量在95％以上)合併用藥時，用藥量為紅毛五加複合多糖100mg/kg/d，當歸多糖100mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用紅毛五加複合多糖或當歸多糖，用藥量為200mg/kg/d組比較，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了。當紅毛五加複合多糖和G-CSF合併用藥，用藥量為紅毛五加複合多糖200mg/kg/d，G-CSF 1-3ug/kg/d，用法同上時，與單獨使用G-CSF，用藥量為1-3ug/kg/d或單獨使用紅毛五加複合多糖，用藥量為200mg/kg/d組比較，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了3-4天。對接受化療的Balb/C小鼠單獨使用紅毛五加複合多糖時，當用藥量為50-200mg/kg/d，皮下注射給藥，連續使用7天時，與安慰劑組比較，白細胞和血小板的恢復提前了4-7天。當紅毛五加複合多糖和黃芪多糖合併用藥，用藥量為紅毛五加複合多糖100mg/kg/d，黃芪多糖100mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用紅毛五加複合多糖或黃芪多糖，用藥量為200mg/kg/d組相比較，白細胞的恢復提前了2-4天。當紅毛五加複合多糖與當歸多糖合併用藥，用藥量為紅毛五加複合多糖100mg/kg/d，當歸多糖100mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用紅毛五加複合多糖或當歸多糖，用藥量為200mg/kg/d組比較，白細胞，血小板和紅細胞的恢復都提前了。當紅毛五加複合多糖和G-CSF合併用藥，用藥量為紅毛五加複合多糖200mg/kg/d，G-CSF 1-3ug/kg/d，用法同上時，與單獨使用G-CSF，用藥量為1-3ug/kg/d時或單獨使用紅毛五加複合多糖，用藥量為200mg/kg/d組比較，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了3-4天。
本發明提供的紅毛五加複合多糖在抗病毒方面的藥理作用為體外實驗的結果表明，單獨使用紅毛五加複合多糖時，其濃度在50-200ug/ml時，對水泡性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒I型(HSV-1)和柯薩奇病毒B3型(CB3V)均有明顯的抑制作用。當紅毛五加複合多糖和甘草多糖(參考周蓉等.甘草多糖的分離純化及高效毛細管電泳分析.分析化學.1999.27(2).245.提供的方法並加以改良後提取，純化而得。多糖含量在95％以上)合併用藥，其濃度在50-200ug/ml時，除了對水泡性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒I型(HSV-1)和柯薩奇病毒B3型(CB3V)均有明顯的抑制作用外，對腺病毒III型(ADVIII)和柯薩奇病毒A16型(CA16V)也有明顯的抑制作用。體內實驗的結果表明，給雞法氏囊病毒攻毒雛雞單獨使用紅毛五加複合多糖，用量在20mg/天，連續使用5天，持續觀察14天。與對照組動物死亡60％相比較，用藥組動物100％存活。給犬細小病毒和犬瘟熱患犬單獨使用紅毛五加複合多糖，用量在75-150mg/d時，連續使用3-7天，持續觀察28天。與目前臨床上採用的常規治療相比，治癒率明顯升高，沒有復發的情況。
本發明提供的紅毛五加複合多糖在輔助抗癌方面的藥理作用為給S-180荷瘤小鼠皮下注射紅毛五加複合多糖，當用藥量為100-300mg/kg/d，連續使用14天，可顯著提高荷瘤小鼠脾臟NK細胞的殺傷力，P＜0.01。同時，誘導荷瘤小鼠脾臟細胞生成IL-2和IFN-γ等細胞因子。將紅毛五加複合多糖加到COlO205和HT-29等人類腫瘤細胞株的細胞懸液中，濃度為25-500ug/ml，在5％CO2培養箱，37℃培養48小時，未見刺激COlO205和HT-29等人類腫瘤細胞株生長的作用。
具體實施例方式
實施例1紅毛五加多糖粗品的製備紅毛五加莖皮40kg，加水提取三次，每次加水160kg，提取1.5小時，提取溫度為100℃。合併提取液65℃減壓濃縮至稀稠膏狀，調整體積至20L，靜置過夜，加入95％乙醇至終濃度35％，攪拌均勻，4℃放置10小時，5000×g離心10min，收集上清液，噴霧乾燥，得紅毛五加多糖粗品690g。多糖含量為16.8％。
實施例2紅毛五加多糖精品的製備將紅毛五加多糖粗品400g用水溶解，濃度為4％，用截留分子量為10K的超濾膜超濾，保留液體積為8L，上200×300mm SP Sepharose離子交換柱，洗脫液為pH5.2，50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液，收集流出液共30L，用截留分子量為5K的超濾膜超濾，得保留液6L，加入95％乙醇至終濃度70％，4℃放置10小時，5000×g離心5min，收集沉澱。沉澱加水反溶至6L，，加入95％乙醇至終濃度70％，4℃放置10小時，5000×g離心5min，收集沉澱。沉澱加水反溶至7L，噴霧乾燥，得紅毛五加多糖精品97g(紅毛五加複合多糖)，多糖含量為97％。
實施例3紅毛五加複合多糖凍乾粉針劑的製備取實施例2所得紅毛五加複合多糖30g，用含1.0％甘露醇、0.4‰的吐溫-80、pH5.0，50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液溶解，調整終體積至2000ml。0.22um濾膜除菌過濾，分裝到1000個10ml西林瓶中，凍幹即得。
實施例4紅毛五加複合多糖誘導PHA活化的人的外周血單核細胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6實驗共分為10組第1組試藥為實施例1，濃度為50ug/ml。第2組試藥為實施例1，濃度為100ug/ml。第3組試藥為實施例1，濃度為200ug/ml，。第4組試藥為實施例1，濃度為400ug/ml。第5組試藥為實施例2，濃度為50ug/ml。第6組試藥為實施例2，濃度為100ug/ml。第7組試藥為實施例2，濃度為200ug/ml，。第8組試藥為實施例2，濃度為400ug/ml。第9組試藥為豬苓多糖注射劑(連雲港東風製藥廠)，濃度為400ug/ml。作為陽性對照。第10組為空白對照。
從健康人全血中分離、洗滌得到人外周血單核細胞，用RPMI-1640培養基調整細胞數到1×106/ml，依次加入各管，每管1.0ml。再加入藥液0.5ml(除空白對照外)，PHA液0.5ml(至終濃度4ug/ml)。37℃，5％二氧化碳培養箱培養24小時，離心，收集上清。用相應的ELISA試劑盒分別檢測GM-CSF，G-CSF和IL-6的生成量，用加藥組產生的細胞因子量比空白對照組產生的細胞因子量(S/C)為表示活性的單位。
下表顯示不同純度、不同濃度的紅毛五加多糖誘導生成GM-CSF，G-CSF和IL-6的數量

從以上結果可以看出紅毛五加多糖的粗品和精品(紅毛五加複合多糖)均能誘導PHA活化的人的外周血單核細胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6，且生成量與藥物濃度呈正相關。精品的活性顯著高於粗品。
實施例5紅毛五加複合多糖與黃芪多糖合用強化PHA活化的人的外周血單核細胞誘導生成GM-CSF，G-CSF和IL-6試藥共分為4組第1組試藥為實施例2，濃度為200ug/ml。第2組試藥為黃芪多糖，濃度為200ug/ml。第3組試藥為實施例2+黃芪多糖，濃度各為100ug/ml。第4組試藥為豬苓多糖注射劑(連雲港東風製藥廠)，濃度為400ug/ml。作為陽性對照。未加藥組作為空白對照。
從健康人全血中分離、洗滌得到人外周血單核細胞，用RPMI-1640培養基調整細胞數到1×106/ml。加入各管，每管1.0ml。各管再加入藥液0.5ml(空白對照除外)，PHA液0.5ml(至終濃度4ug/ml)。37℃，5％二氧化碳培養箱培養24小時，離心，收集上清。用相應的ELISA試劑盒檢測GM-CSF，G-CSF和IL-2的生成量，用加藥組產生的細胞因子量/空白對照組產生的細胞因子量(S/C)表示活性。
下表顯示紅毛五加複合多糖與黃芪多糖合用強化誘導生成G-CSF，GM-CSF和IL-6

從以上結果可以看出當紅毛五加複合多糖與黃芪多糖合用時，刺激用PHA活化的人的外周血單核細胞產生IL-6，GM-CSF和G-CSF的能力增強。
實施例6紅毛五加複合多糖和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠產生GM-CFC和BFU-E的能力明顯增強。
試藥分為4組第1組.實施例2，用量100mg/kg/d。第2組.G-CSF(重組人粒細胞集落刺激因子.商品名惠爾血.麒麟鯤鵬(中國)生物藥業有限公司)用量100ug/kg/d。第3組.實施例2+G-CSF，用量為實施例2100mg/kg/d，G-CSF100ug/kg/d。第4組.安慰劑組。
雌性Balb/c小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組5隻。皮下注射給藥，每日一次，連續給藥7天。取外周血，分離單核細胞，洗滌後用含有EPO(紅細胞生成素)、IL-3、IL-6和幹細胞因子等的培養基調整細胞數為1×105個/ml，依次加入35mm的培養皿，每皿加入1.0ml。5％CO2培養箱，37℃飽和溼度培養7天，在顯微鏡下計數含50個細胞的集落(BFU-E)。各皿加入染色劑1ml，5％CO2培養箱，37℃飽和溼度培養3.5小時，在顯微鏡下計數棕色的細胞集落(GM-CFC)。
下表顯示紅毛五加複合多糖和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠產生GM-CFC和BFU-E的能力明顯增強。
從以上結果可以看出當紅毛五加複合多糖和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠產生GM-CFC和BFU-E的能力明顯增強。
實施例7紅毛五加複合多糖促進接受放療小鼠外周血象的恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15隻。試藥分為4組第1組為實施例2，用量為50mg/kg/d。第2組為實施例2，用量為100mg/kg/d。第3組為實施例2，用量為200mg/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
各組小鼠在0天接受X射線照射，照射量為500cGy。從照射當日開始皮下注射給藥，每天一次，連續用藥一周。各組小鼠每3日尾靜脈採血1次，計數外周血白細胞(WBC)，紅細胞(RBC)和血小板(PLT)，連續觀察4周。
下表顯示外周血WBC(×109/L)的變化 下表顯示外周血RBC(×1012/L)的變化 下表顯示外周血PLT(×109/L)的變化 從以上結果可以看出第1組RBC的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。WBC的恢復較對照組提前了4天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。第2組RBC的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第3組RBC的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。
從以上結果可以看出當紅毛五加複合多糖的用量在50-200mg/kg/d時，可以促進接受放療小鼠外周血象的恢復，特別是促進PLT和WBC的恢復，且恢復的情況與用藥量呈正相關。
實施例8紅毛五加複合多糖與當歸多糖合用促進放療小鼠外周血象全面恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15隻。試藥分為4組第1組為實施例2，用量為200mg/kg/d。第2組為當歸多糖，用量為200mg/kg/d。第3組為實施例2+當歸多糖，用量為各100mg/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
各組小鼠在0天接受X射線照射，照射量為500cGy。從照射當日開始皮下注射給藥，每天一次，連續用藥一周。各組小鼠每3日尾靜脈採血1次，計數外周血WBC，RBC和PLT。連續觀察4周。
下表顯示外周血WBC(×109/L)的變化
下表顯示外周血RBC(×1012/L)的變化 下表顯示外周血PLT(×109/L)的變化 結果發現第1組RBC的恢復較對照組提前了4天，P＜0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第2組RBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。WBC和PLT的恢復與對照組近似，P＞0.05。第3組RBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。
從以上結果可以看出聯合使用紅毛五加複合多糖和當歸多糖，具有互補作用，比單純用紅毛五加複合多糖的RBC恢復時間提前，比單獨用當歸多糖的WBC、PLT的恢復時間提前，可使照射後小鼠的外周血象儘快全面恢復。
實施例9紅毛五加複合多糖與黃芪多糖合用進一步促進接受化療小鼠外周血WBC的提前恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15隻。試藥分為4組第1組為實施例2，用量為200mg/kg/d。第2組為黃芪多糖，用量為200mg/kg/d。第3組為實施例2+黃芪多糖，用量為各100mg/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
各組小鼠在0天接受絲裂黴素C，尾靜脈給藥，給藥量3.5mg/kg/d。連續用藥3天。化療當日開始皮下注射給藥，每天一次，連續用藥14天。各組小鼠每3日尾靜脈採血1次，計數外周血WBC，RBC和PLT。連續觀察4周。
下表顯示外周血WBC(×109/L)的變化 下表顯示外周血RBC(×1012/L)的變化 下表顯示外周血PLT(×109/L)的變化
結果發現第1組RBC的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第2組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了4天，P＜0.05。第3組RBC的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。WBC的恢復較對照組提前了11天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。
從以上結果可以看出聯合使用紅毛五加複合多糖和黃芪多糖，與二者單獨使用組相比，既具有互補作用，使接受化療後小鼠的WBC，PLT均提前恢復。且對WBC的恢復有增效作用。
實施例10紅毛五加複合多糖與G-CSF合用促進化療小鼠外周血象全面恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15隻。試藥分為4組第1組為實施例2，用量為200mg/kg/d。第2組為G-CSF，(重組人粒細胞集落刺激因子.商品名惠爾血.麒麟鯤鵬(中國)生物藥業有限公司)用量為3ug/kg/d。第3組為實施例2+G-CSF，用量為實施例2200mg/kg/d，G-CSF 3ug/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
各組小鼠在0天接受絲裂黴素C，尾靜脈給藥，給藥量3.5mg/kg/d。連續用藥3天。化療當日開始皮下注射給藥，每天一次，連續用藥14天。各組小鼠每3日尾靜脈採血1次，計數外周血WBC，RBC和PLT。連續觀察4周。
下表顯示外周血WBC(×109/L)的變化 下表顯示外周血RBC(×1012/L)的變化 下表顯示外周血PLT(×109/L)的變化 從以上結果可以看出當紅毛五加複合多糖和G-CSF合併用藥，與單獨使用G-CSF或紅毛五加複合多糖比較，具有增效作用，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了3-4天。
實施例11紅毛五加複合多糖單用或與甘草多糖合用在體外的抗病毒作用所選病毒有5種水泡性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒I型(HSV-1)、柯薩奇病毒B3型(CB3V)，腺病毒III(ADVIII)和柯薩奇病毒A16型(CA16V)。其中，VSV、HSV-1和ADVIII的宿主選用L929細胞，CA16V的宿主選用Vero細胞，CB3V的宿主選用Hela細胞。試藥有7種第1組為實施例1，濃度為200ug/ml。第2組為實施例2，濃度為100ug/ml。第3組為實施例2，濃度為200ug/ml。第4組為甘草多糖，濃度為100ug/ml。第5組為甘草多糖，濃度為200ug/ml。第6組為實施例2+甘草多糖，濃度各為100ug/ml。第7組為三氮唑核苷，濃度為200ug/ml。同時設病毒對照和細胞對照。
96孔細胞培養板感染病毒2小時後，加入上述藥液，置5％CO2培養箱內，37℃培養。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變。連續觀察3天，記錄各孔病變情況。
下表顯示紅毛五加複合多糖單用或與甘草多糖合用對病毒導致細胞病變的抑制作用
「+」表示有病變。其數量的多少表示病變的程度。「-」表示未觀察到明顯病變。
從以上結果可以看出紅毛五加複合多糖濃度在100-200ug/ml時，對VSV、HSV-1和CB3V導致的細胞病變有明顯的抑制作用。且精品的活性顯著高於粗品。甘草多糖濃度在100-200ug/ml時，對ADVIII和CA16V導致的細胞病變有明顯的抑制作用。兩者合用後，抗病毒譜變寬。
實施例12紅毛五加複合多糖對雞法氏囊病毒的體內抗病毒作用4周齡雛雞，體重200-250g，經雞法氏囊病毒攻毒後隨機分為3組，每組20隻，雌雄各半。第1組對照組，不給藥。第2組口服給藥組，實施例2加入飲水中，20mg/天。連續給藥5天。第3組，肌肉注射給藥組，實施例2用量為20mg/天，注射總體積為1ml。連續給藥5天。連續2周觀察用藥組和對照組動物的死亡情況。實驗期間，死亡動物需取出法氏囊，稱重。第14天，處死所有存活動物，取出法氏囊，稱重。
下表顯示第14天用藥組和對照組動物的一般狀態，死亡率和法氏囊重量

從以上結果可以看出口服或肌肉注射給予紅毛五加複合多糖，用量在20mg/天時，可以明顯減輕法氏囊的感染和病變，防止雞法氏囊病毒攻毒動物的死亡。
實施例13紅毛五加複合多糖在臨床上對犬瘟熱和犬細小病毒感染的療效實驗共分4組。第1組臨床確診為犬細小病毒感染的小型犬41隻，體重1000-5000g，靜脈給實施例2。體重1000-2500g的動物75mg/d，體重2500-5000g的動物150mg/d，每天1次，連續用藥3-7天。第2組臨床確診為犬細小病毒感染的小型犬20隻，體重1000-5000g，按常規療法治療，作為對照。第3組臨床確診為犬瘟熱的小型犬37隻，體重1000-5000g，靜脈給藥。用法同上。連續用藥3-7天。第4組臨床確診為犬瘟熱的小型犬18隻，體重1000-5000g，按常規療法治療，作為對照。觀察動物的治癒情況和死亡情況，隨訪至4周，了解有無復發。
下表顯示不同時間段各組動物的死亡情況和疾病復發情況

犬瘟熱和犬細小病毒感染是兩種嚴重的動物疾病，不經治療死亡率＞95％。紅毛五加複合多糖用量在75-150mg/d時，與目前臨床採用的治療方案比較，患病動物的死亡率低，治癒動物在28天內沒有復發。
根據以上結果可以將紅毛五加複合多糖單獨用於治療中性粒細胞減少症、貧血、血小板減少症、病毒感染性疾病和作為抗癌輔助藥。或與黃芪多糖、當歸多糖、甘草多糖或G-CSF組合，以起到協同增效的作用。
權利要求
1.一種從紅毛五加(Acanthopanax giraldii，Harms)莖皮中提取、分離、純化複合多糖的方法，其特徵在於包括以下步驟紅毛五加莖皮，水提，30-40％乙醇沉澱，收集上清液，用截留分子量為10K的超濾膜超濾，保留液經過陽離子交換柱，用pH5-6、30-50mM的緩衝液洗脫，收集流出液，流出液經過截留分子量為5K的超濾膜超濾，超濾後所得保留液經70％的乙醇沉澱兩次，所得沉澱物即為所述的紅毛五加複合多糖。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於在製備過程中所用的陽離子交換樹脂為SP Sepharose離子交換樹脂。
3.權利要求1或2所述的紅毛五加複合多糖製備工藝，洗脫液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液或乙酸-乙酸鈉緩衝液。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於在經過2次70％醇沉過程製備得到複合多糖沉澱後，加水將沉澱溶解，經噴霧或冷凍乾燥得到精製的複合多糖。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於在經過2次70％醇沉過程製備得到複合多糖沉澱後，加水將沉澱溶解，經噴霧或冷凍乾燥得到精製的複合多糖。
6.用權利要求1或2所述方法得到的複合多糖，其特徵在於此複合多糖是由阿拉伯半乳聚糖蛋白、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I、半乳糖醛酸聚糖和阿拉伯半乳聚糖組成的，其糖組成(Mole％)為阿拉伯糖(Ara)28.9，鼠李糖(Rha)8.93，木糖(Xyl)1.57，半乳糖醛酸(GalA)36.0，半乳糖(Gal)19.1，葡萄糖(Glc)4.31，4-甲氧基葡萄糖醛酸(4-o-me-GlcA)1.20。多糖含量在95％以上。以pullulans多糖系列做為標準對照品，用分子篩凝膠過濾高效液相色譜—RI-HPLC檢測，其重均分子量為20,000-40,000道爾頓。
7.用權利要求3所述方法得到的複合多糖，其特徵在於此複合多糖是由阿拉伯半乳聚糖蛋白、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I、半乳糖醛酸聚糖和阿拉伯半乳聚糖組成的，其糖組成(Mole％)為阿拉伯糖(Ara)28.9，鼠李糖(Rha)8.93，木糖(Xyl)1.57，半乳糖醛酸(GalA)36.0，半乳糖(Gal)19.1，葡萄糖(Glc)4.31，4-甲氧基葡萄糖醛酸(4-o-me-GlcA)1.20。多糖含量在95％以上，以pullulans多糖系列做為標準對照品，用分子篩凝膠過濾高效液相色譜—RI-HPLC檢測，其重均分子量為20,000-40,000道爾頓。
8.含有根據權利要求1-7中任一權利要求所述的紅毛五加複合多糖的注射劑，是由所述的紅毛五加複合多糖加入一種或多種藥學可以接受的輔料製成，每個注射劑量單位中至少含紅毛五加複合多糖30mg。
9.根據權利要求1-7中任一權利要求所述的紅毛五加複合多糖在製備治療中性粒細胞減少症、貧血、血小板減少症、病毒感染性疾病的藥物和製備抗癌輔助藥物中的用途。
10.根據權利要求9所述的用途，其特徵在於所述的抗癌輔助藥物為放、化療輔助用藥。
11.根據權利要求9所述的用途，其特徵在於所述的病毒感染性疾病為水泡性口炎病毒、單純皰疹病毒I型、腺病毒III型、柯薩奇病毒B3型、柯薩奇病毒A16型、雞法氏囊病毒、犬細小病毒感染引起的疾病和犬瘟病。
12.一種組合物，其中含有根據權利要求6或7所述的紅毛五加複合多糖，及選自黃芪多糖、當歸多糖、甘草多糖中的任意一種，紅毛五加複合多糖與所述植物多糖的重量配比為1∶1。
13.一種組合物，其中含有根據權利要求6或7所述的紅毛五加複合多糖及G-CSF，紅毛五加複合多糖與G-CSF的重量配比為1∶0.000015。
全文摘要
本發明涉及一種從紅毛五加莖皮中提取、分離、純化得到的重均分子量在20,000－40,000道爾頓之間，主要由阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins or AGPs)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(Rhamnogalacturonan I
文檔編號A61K31/715GK1834108SQ20051005349
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月15日 優先權日2005年3月15日
發明者張玉傑 申請人:張玉傑