治療神經損傷性疾病的植入神經元製備方法

2023-05-07 16:58:51 3

專利名稱：治療神經損傷性疾病的植入神經元製備方法
技術領域：
本發明涉及一種誘導間質幹細胞分化為神經元的方法，特別是一種用中藥作誘導劑製備用於治療神經損傷性疾病的植入神經元的方法。
本發明的目的是這樣實現的治療脊髓損傷性疾病的植入神經元製備方法，包括A、骨髓間質幹細胞分離、培養、擴增取人或動物骨髓分離、培養，通過換液後傳代去除其他細胞，經傳代後純化；B、用中藥誘導骨髓間質幹細胞分化為神經元取純化的間質幹細胞用培養液預誘導，然後用含中藥有效成分的培養液再誘導；C、細胞洗滌後備用。
其中所述的中藥為丹參注射液或麝香多肽。
中藥(丹參注射液、麝香多肽)無明顯的毒副作用，採用其作為誘導劑誘導率高，安全性好，容易被病人接受。通過形態學和神經元表面標記物檢測，丹參注射液誘導神經元的陽性細胞率為62％左右，而麝香多肽陽性率達88-93％。利用上述中藥誘導分化的早期神經元植入體內生長良好，能較好地重建受損神經的功能；骨髓間質幹細胞取材容易，能從患者本人獲得足夠的骨髓間質幹細胞，經擴增後，用於患者本人的治療，療效好，無免疫排斥等問題，臨床應用前景廣闊，社會效益巨大，而且能進行工業化生產以供應其他患者應用。
1、骨髓間質幹細胞分離、培養、擴增及生物學特性識別。
分別取人或大鼠骨髓3-5毫升，於比重為1.078分離液分離。用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培養基(L-DMEM)培養，間質幹細胞很快貼壁生長，其他細胞不貼壁，通過換液化傳代去除其他細胞。經2-3次傳代後，基本達到純化目的。第5代細胞表面標記物識別CD116，CD45，CD61，CD71，CD80，CD86，MHC-II表達均為陰性，而CD29和CD44陽性，證明是間質幹細胞，而不是造血幹細胞。
每份標本原代培養可獲得5-6×105細胞，傳5代細胞數為1×108，10代為2×1010，15代為3-4×1012。上述細胞量已基本滿足臨床應用所用細胞量。
2、丹參注射液和麝香多肽分別誘導骨髓間質幹細胞分化為神經元。
取5-10代間質幹細胞用含10納克/毫升鹼性纖維生長因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)預誘導24小時，然後，分別用丹參注射液5-10微升/毫升，或麝香多肽100-150微克/毫升加進無血清L-DMEM誘導5小時-7天。神經元的確定通過形態學和神經元表面標記物檢測，丹參注射液誘導神經元的陽性細胞率為62％左右，而麝香多肽陽性率達88-93％。
3、丹參注射液和麝香多肽誘導分化神經元的功能實驗。
a、將丹參或麝香多肽誘導的早期神經元(誘導時間為2-5小時)，先用螢光染料(Hoe33342)標記，然後植入脊髓損傷處。治療組大鼠約在7-14天後後肢癱瘓即出現恢復，持續60-90天(相當於人類長期存活)，沒有異常副作用出現，經螢光金逆行追蹤實驗，表明損傷神經元軸索通路已經建立，大體標本及病理切片證實植入細胞無瘤樣生長，生長良好，免疫組化證實已經分化為神經元。
b、將丹參或麝香多肽誘導分化的早期神經元(誘導時間為2-5小時)，先用螢光染料標記，植入大鼠的紋狀體。治療組約在7-14天症狀明顯改善(阿撲嗎啡誘導的轉圈動作明顯減少)，經60-90天觀察，療效一直維持，病理切片證實植入細胞在宿主紋狀體生長良好，多巴胺含量(TH酶含量)明顯增加。
上述結果說明，用丹參或麝香多肽能高效誘導間質幹細胞分化為神經元，利用上述中藥誘導分化的早期神經元植入體內生長良好，能較好地重建受損神經的功能；骨髓間質幹細胞取材容易，能從患者本人獲得足夠的骨髓間質幹細胞，經擴增後，用於患者本人的治療，療效好，無免疫排斥等問題，臨床應用前景廣闊，社會效益巨大，而且能進行工業化生產以供應其他患者應用。因為人骨髓間質幹細胞傳15代時細胞量可達3-4×1012經液氮保存隨時可取出供用。
另外，體外實驗表明，麝香多肽或丹參誘導骨髓間質幹細胞從第二小時開始細胞形態已變為神經元樣。兩天後已有90％左右細胞分化為神經元，五天後(未改用維持液培養)神經元漂浮脫落，出現死亡現象。
誘導2-5小時的神經元處於早期，是活力最好的時期，植入體內後，動物實驗表明連續觀察2-3個月(相當於人類的長期存活)，早期神經元植入使神經細胞在體內存活良好，能更有效地重建受損功能。
大鼠脊髓損傷導致癱瘓的治療65隻成年SD大鼠於胸腺9-10用刀片橫切約1毫米(用吸管吸出橫切組織)，然後分為三組。25隻為細胞治療組，另四十隻分別為空白對照組和明膠海綿對照組，細胞治療組用含有5×105已誘導分化的早期神經元的可吸收明膠海綿植入損傷處；對照組不植入細胞。術後30天後定期行為學檢查(BBB分級)，於60天和90天分批處0死動物作病理切片和螢光金逆行追蹤檢查。結果表明，從錄像看出爬行小鼠雙後肢已有不同程度恢復。BBB分級從對照組的0-4級恢復至10級左右。病理切片證實植入細胞已分化為神經元並存活90天以上。螢光金逆行追蹤檢查表明切片近端脊索，紅核及皮層運動區均陽性。說明切斷脊髓神經軸索已得到重建。
大鼠帕金森病模型的治療用6微升6-OHDO(8毫克/微升)注入右側中腦黑質緻密處一周後用apomorphine(0.5mg/kg)誘發旋轉，大於7次/分為帕金森模型建立成功，然後將已誘導的早期神經元10微升含有5×105細胞注入紋狀體。實驗組25隻，另一對照組(n＝15)僅注入培養液。術後3.7.14.21.28.56.90天觀察旋轉實驗，並於90天處死動物作病理切片及多巴胺檢測。對照組90天旋轉情況未見改善。細胞治療組於第七天開始旋轉次數明顯減少或消失。療效維持90天(相當於人類長期存活)病理切片表明植入細胞存活情況良好並能遷移至周圍其他部位。多巴胺檢測(western blot)治療組明顯陽性，而對照組呈陰性反應。
權利要求
1.治療脊髓損傷性疾病的植入神經元製備方法，包括A、骨髓間質幹細胞分離、培養、擴增取人或動物骨髓分離、培養，通過換液後傳代去除其他細胞，經傳代後純化；B、用中藥誘導骨髓間質幹細胞分化為神經元取純化的間質幹細胞用培養液預誘導，然後用含中藥有效成分的培養液再誘導；C、細胞洗滌後備用。
2.根據權利要求1所述植入神經元的製備方法，其中所述的中藥為丹參注射液。
3.根據權利要求2所述植入神經元的製備方法，其中用丹參注射液再誘導的時間為2小時-7天。
4.根據權利要求2所述植入神經元的製備方法，其中丹參注射液的劑量為5-10微升/毫升。
5.根據權利要求3或4所述植入神經元的製備方法，其中A、骨髓間質幹細胞分離、培養、擴增取人或大鼠骨髓3-5毫升，於比重為1.077-1.078的分離液中分離，用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培養基(L-DMEM)培養，間質幹細胞貼壁生長，通過換液後傳代去除其他細胞，再經2-3次傳代後，基本達到純化目的；B、用丹參注射液誘導骨髓間質幹細胞分化為神經元取5-10代間質幹細胞，用含10納克/毫升鹼性纖維生長因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)預誘導24小時，然後用含丹參注射液的無血清L-DMEM再誘導；C、細胞洗滌後備用。
6.根據權利要求1所述植入神經元的製備方法，其中所述的中藥為麝香多肽。
7.根據權利要求6所述植入神經元的製備方法，其中用麝香多肽再誘導的時間為2小時-7天。
8.根據權利要求6所述植入神經元的製備方法，其中麝香多肽的劑量為100-150微克/毫升。
9.根據權利要求7或8所述植入神經元的製備方法，其中A、骨髓間質幹細胞分離、培養、擴增取人或大鼠骨髓3-5毫升，於比重為1.077-1.078的分離液中分離，用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培養基(L-DMEM)培養，間質幹細胞貼壁生長，通過換液後傳代去除其他細胞，再經2-3次傳代後，基本達到純化目的；B、用麝香多肽誘導骨髓間質幹細胞分化為神經元取5-10代間質幹細胞，用含10納克/毫升鹼性纖維生長因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)預誘導24小時，然後用含麝香多肽的無血清L-DMEM再誘導；C、細胞洗滌後備用。
全文摘要
本發明涉及一種誘導間質幹細胞分化為神經元的方法，特別是一種用中藥作誘導劑製備用於治療神經損傷性疾病的植入神經元的方法。包括A、骨髓間質幹細胞分離、培養、擴增取人或動物骨髓分離、培養，通過換液後傳代去除其他細胞，經傳代後純化；B、用中藥誘導骨髓間質幹細胞分化為神經元取純化的間質幹細胞用培養液預誘導，然後用含中藥有效成分的培養液再誘導；C、細胞洗滌後備用。中藥(丹參注射液、麝香多肽)無明顯的毒副作用，採用其作為誘導劑誘導率高，安全性好，容易被病人接受，所誘導分化的早期神經元植入體內生長良好，能較好地重建受損神經的功能；骨髓間質幹細胞取材容易，能從患者本人獲得足夠的骨髓間質幹細胞，經擴增後，用於患者本人的治療，療效好，無免疫排斥等問題，臨床應用前景廣闊，社會效益巨大，而且能進行工業化生產以供應其他患者應用。
文檔編號A61K45/00GK1424396SQ0214962
公開日2003年6月18日 申請日期2002年12月13日 優先權日2002年12月13日
發明者李樹濃, 鄧宇斌, 肖慶忠 申請人:中山大學