一種文蛤多肽的應用的製作方法
2023-05-07 12:46:11 1
專利名稱：一種文蛤多肽的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生化與生物醫藥領域，具體的說是一種文蛤多肽的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是一種發病率高、嚴重威脅人類健康的疾病。自20世紀中後期以來，癌 症發病率一直呈現上升的趨勢。在經典的腫瘤治療方法中，化療藥物一直發揮著重要的作 用，而且也取得了相當大的進步，但仍然存在選擇性差、毒副作用大等缺點。因此，臨床上迫 切需要研製與開發選擇性高、特異性強、療效確切的抗腫瘤藥物。海洋覆蓋著地球表面積的71%，是生命的發源地，也是潛力巨大的海洋生物資源 庫。據統計，海洋的生物種數遠遠超過陸地，約佔地球生物總數的80%，共計約30門50多 萬種，這種物種多樣性構成了海洋藥物資源化學多樣性的基礎。此外，海洋環境具有高鹽、 高壓、低溫、低光照、寡營養等不同於陸地環境的特點。為適應這種特殊的生態環境，海洋生 物不僅形態各異，而且產生了與陸地生物不同的代謝系統和機體防禦系統。在其生長和代 謝過程中，產生並積累了大量結構新穎、功能獨特的活性物質。因此，海洋生物的多樣性、海 洋環境的獨特性以及海洋生物活性物質結構的新穎性使海洋成為創新藥物的豐富源泉。文蛤Meretrix meretrix Linnaeus為簾蛤科軟體動物，是我國重要的海洋貝類資 源，利用文蛤治療腫瘤在我國具有悠久的歷史。《神農本草經》記載「文蛤主惡瘡」，具有軟 堅散結、扶正祛邪之功效，可潤五肺、止消渴、開脾胃、用於肺結核、高血壓、腫瘤、腎虛耳鳴 的治療。清代汪昂的《本草備要》中也有文蛤除瘤的記載。近年來，我國學者針對文蛤進行 了一系列研究。冷波等將文蛤勻漿液經乙醇抽提、分子篩過濾層析，純化得到一個分子量為 3147.41Da的多肽，該多肽在體外能夠顯著抑制胃癌細胞BGC-823的增殖。中國藥科大學張 鉬通過超濾、大孔吸附層析、凝膠過濾層析等方法從文蛤中純化得到了糖肽MGP0405，其對 人鼻咽癌KB細胞有抑制作用。
發明內容
本發明目的在於提供一種文蛤多肽的應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為、—種文蛤多肽的應用文蛤多肽在製備預防和/或治療惡性腫瘤藥物中的應用。所述文蛤多肽在製備預防和/或治療人肺癌細胞、人肝癌細胞、人宮頸癌上皮細 胞、人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞或人胰腺癌細胞藥物中的應用。所述文蛤多肽通過誘導細 胞周期阻滯來抑制腫瘤細胞增殖。所述文蛤多肽通過抑制微管聚合來誘導細胞周期阻滯。所述文蛤多肽按如下步驟製備1)取新鮮文蛤體液，離心，上清進行硫酸銨分級沉澱，每次在4°C靜置沉澱12小 時；2)將步驟1)中所得活性成分沉澱用水溶解，分別用50KDa和5KDa超濾膜過濾，待 用；
3)取步驟幻中分子量在5_50KDa之間的活性部分過CM-kpharosefast flow陽 離子交換柱，用分別含濃度為0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的緩衝液洗脫，收集含濃度為 0. IM NaCl的緩衝液的洗脫峰，待用；所述緩衝液為0. 05M NaAc, pH5. 5緩衝液；4)將步驟幻所得活性組分過Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水柱，用分別含 濃度為2. 5M、2M、IM或OM的NaCl的緩衝液洗脫，收集含濃度為IM NaCl的緩衝液的洗脫峰， 待用；所述緩衝液為0. 05M NaAc, pH5. 5的緩衝液；5)將步驟4)所得洗脫組分用快速蛋白液相色譜(FPLC)的ReSOurCel5Q陰離子交 換柱進行分離，洗脫液為A液和B液，進行梯度洗脫，起始洗脫液中A液佔總洗脫液體積的 100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流速為lml/min，當B液佔總洗脫液體積的5. 5%時 出現活性組分，即為N-末端序列為IDEI QNTGGGTNFR，其分子量為15KDa的單一組分文蛤多 肽，其中 A 液為 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液為 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。所述步驟1)中上清進行硫酸銨分級沉澱，即為將新鮮文蛤體液離心，收集上清 液，向上清中緩慢加入硫酸銨至30%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨 至70%飽和度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，離心收集沉 澱。所述步驟1)中離心條件為lOOOOXg，離心20分鐘。本發明所具有的優點1、海洋環境高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營養的特點是海洋生物產生並積累了大 量結構新穎、功能獨特的活性物質。2、文蛤作為一種營養豐富的海洋貝類食品，其可預見的安全性使其具有廣泛及長 期用藥的潛力。3、本發明從文蛤中分離得到具有抗腫瘤作用的多肽Merel5，實驗證實，該多肽在 體外能夠誘導人肺癌細胞株A549發生G2/M期細胞周期阻滯，並對其他多種腫瘤細胞均有 顯著的細胞毒活性。與現有的化療藥物相比，抗腫瘤多肽類藥物具有分子量小、無免疫原 性、結構簡單、活性高、毒副作用小、不易產生耐藥性等優點。
圖1為本發明實施例1製備的文蛤多肽的SDS-PAGE電泳分析圖。圖2為本發明實施例提供的抗腫瘤文蛤多肽對肺癌細胞A549細胞周期的影響圖， 其中A.未加實施例1製備所得的文蛤多肽處理的A549細胞；Β、30 μ g/ml實施例1製備所 得的文蛤多肽處理的A549細胞；C、60 μ g/ml實施例1製備所得的文蛤多肽處理的A549細 胞。圖3為本發明實施例提供的抗腫瘤文蛤多肽對肺癌細胞A549微管蛋白聚合的影 響圖，其中A為未加實施例1製備所得文蛤多肽處理的A549細胞；B、30yg/ml實施例1 製備所得的文蛤多肽處理的A549細胞；C、60 μ g/ml實施例1製備所得的文蛤多肽處理的 A549細胞。
具體實施例方式實施例1文蛤體液抗腫瘤多肽的製備
(1)取新鮮文蛤，開殼收集其體液，經IOOOOXg離心20分鐘，去除沉澱。按照硫酸 銨沉澱劑用量表向上清中緩慢加入已研磨成細粉末狀的硫酸銨至30%飽和度，4°C靜置12 小時，IOOOOXg離心20分鐘，分別收集沉澱和上清，再次向上清中加入硫酸銨至70%飽和 度，4°C靜置12小時，IOOOOXg離心20分鐘，收集沉澱和上清，按上述方法再次向上清中加 入硫酸銨至95%飽和度，4°C靜置12小時，IOOOOXg離心20分鐘，收集沉澱。(2)將活性組分所在的沉澱用純水溶解，微濾以去除不溶物，然後過5KDa和50KDa 超濾膜將其按分子量劃分成三部分。(3)取分子量在5_50KDa之間的活性部分對純水透析，然後對緩衝液充分透析， 將透析好的樣品過CM-kpharose fast flow陽離子交換柱，分別用含不同濃度0M、0. 1M、 0. 5M、2M的NaCl的緩衝液洗脫。所用緩衝液為0. 05M NaAc,pH5. 5緩衝液。將各洗脫峰對 純水透析，冷凍乾燥，各取少量用適量純水溶解，用BCA法測定蛋白濃度後，用MTT比色法 檢測各組份活性，發現活性組分位於含有0. IM NaCl的洗脫液中，將活性組份置於_20°C保 存。(4)將步驟(3)中活性組分用含有2. 5M NaCl的緩衝液充分透析，將透析好的樣品 過Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，分別用含不同濃度2M、1M、0M的NaCl的緩衝液 洗脫。所用緩衝液為0.05M NaAc，pH5. 5緩衝液。將各洗脫峰對純水透析，冷凍乾燥，各取 少量用適量純水溶解，用BCA法測定蛋白濃度後，用MTT比色法檢測各組份活性，發現活性 組分位於含有IM NaCl的洗脫液中，將活性組份置於_20°C保存。(5)將步驟(4)中活性組分用A液溶解後，用快速蛋白液相色譜(FPLC)的 Resource 15Q陰離子交換柱進行分離，採用梯度洗脫方法進行活性組分洗脫。洗脫液為A 液和B液，起始洗脫液中A液佔總洗脫液體積的100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流 速為lml/min。將各洗脫峰對純水透析，冷凍乾燥，各取少量用適量純水溶解，用BCA法測定 蛋白濃度後，MTT比色法檢測各組份活性，發現當B液佔總洗脫液體積的5. 5%時出現活性 組分，將活性組分置於_20°C保存。所用A液為0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B液為IMNaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。(6)將步驟(5)中活性組分用A液溶解，經高效液相色譜(HPLC) C-18反相柱檢測 純度。洗脫液為Α液為0. l%TFA+99. 9%超純水，B液為0. l%TFA+99. 9%乙腈，進行梯度 洗脫。起始濃度為A液90%，B液10%，B液濃度每分鐘上升1 %，流速為0. 5ml/min,當B 液佔總洗脫液體積的43. 5%時出現洗脫峰。洗脫峰為單一峰，說明該組分為單一組分。此 組分N-末端序列測定為IDEIQNTGGGTNFR，等電點由等電聚焦電泳測定為PI = 8. 85。(7)將此單一組分進行SDS-PAGE鑑定。取此單一組分進行電泳，用分子量範圍在 14. 4-116KDa的蛋白Marker作為對照。5%的濃縮膠採用80V電壓，15%的分離膠採用120V 電壓。電泳結束後，用考馬斯亮藍染色液進行染色。6小時後，用脫色液脫色直至蛋白質條 帶清晰可見。結果發現在MKDa左右有單一的蛋白條帶(參見圖1)。實施例2Mere 15在體外抑制腫瘤細胞增殖的檢測細胞人肺癌細胞(AM9)、人肝癌細胞(BEL-7402)、人宮頸癌上皮細胞(Hela)、人 結腸癌細胞(HCT-116)、人乳腺癌細胞(MCF-15)、人胰腺癌細胞(ASPC-I)。MTT法各種細胞株按照常規方法傳代培養。取對數生長期的細胞，調節細胞密度至5 X IO4個/ml，按每孔180 μ 1接種於96孔細胞培養板中，於37°C，5%二氧化碳的培養 箱中培養Mh。樣品為上述實施例製備所得文蛤多肽，將樣品設定5個濃度梯度，即15，30， 45，60，75 μ g/ml，每個濃度設四個平行孔。陽性對照組為5-FU，陰性對照組為不含樣品的 培養基。每孔各加樣品或對照20 μ 1。培養48小時後，每孔各加入濃度為5mg/ml的MTT 50 μ 1，繼續培養4小時，除去上清液。每孔各加入DMSO 150 μ 1，在微量震蕩器上震蕩15分 鍾，至結晶完全溶解後，用酶標儀測定各孔在570納米處的吸光值(0D值)。取四個平行孔 的平均OD值按公式頂％= (0D_對照-OD樣品)/0D_對照X 100%計算樣品對細胞增殖的抑制 率( % )，並計算其半數抑制濃度IC5。。實驗結果Merel5對人肺癌細胞(AM9)、人肝癌細胞(BEL-7402)、人宮頸癌上皮 細胞(Hela)、人結腸癌細胞(HCT-116)、人乳腺癌細胞(MCF-15)、人胰腺癌細胞(ASPC-I)半 數抑制濃度IC5tl參見表1。表lMerel5 對 A-549、BEL-7402、Hela、HCT-116、MCF-15、和 ASPC-1 的半數抑制濃
度 IC5O
權利要求
1.一種文蛤多肽的應用，其特徵在於文蛤多肽在製備預防和/或治療惡性腫瘤藥物 中的應用。
2.按權利要求1所述的文蛤多肽的應用，其特徵在於所述文蛤多肽在製備預防和/ 或治療人肺癌細胞、人肝癌細胞、人宮頸癌上皮細胞、人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞或人胰 腺癌細胞藥物中的應用。
3.按權利要求1或2所述的文蛤多肽的應用，其特徵在於所述文蛤多肽通過誘導細 胞周期阻滯來抑制腫瘤細胞增殖。
4.按權利要求1或2所述的文蛤多肽的應用，其特徵在於所述文蛤多肽通過抑制微 管聚合來誘導細胞周期阻滯。
5.按權利要求1所述的文蛤多肽的應用，其特徵在於1)取新鮮文蛤體液，離心，上清進行硫酸銨分級沉澱，每次在4°C靜置沉澱12小時；2)將步驟1)中所得活性成分沉澱用水溶解，分別用50KDa和5KDa超濾膜過濾，待用；3)取步驟幻中分子量在5_50KDa之間的活性部分過CM-kpharosefast flow陽離 子交換柱，用分別含濃度為0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的緩衝液洗脫，收集含濃度為0. IM NaCl的緩衝液的洗脫峰，待用；所述緩衝液為0. 05M NaAc, pH5. 5緩衝液；4)將步驟幻所得活性組分過WienylSepharose 6fast flow疏水柱，用分別含濃度為 2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的緩衝液洗脫，收集含濃度為IM NaCl的緩衝液的洗脫峰，待用； 所述緩衝液為0. 05MNaAc, pH5. 5的緩衝液；5)將步驟4)所得洗脫組分用快速蛋白液相色譜(FPLC)的Resource15Q陰離子交 換柱進行分離，洗脫液為A液和B液，進行梯度洗脫，起始洗脫液中A液佔總洗脫液體積的 100%，B液以每分鐘1. 5%的速率上升，流速為lml/min，當B液佔總洗脫液體積的5. 5%時 出現活性組分，即為N-末端序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15KDa的單一組分文蛤多 肽，其中 A 液為 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液為 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。
6.按權利要求5所述的文蛤多肽的應用，其特徵在於所述步驟1)中上清進行硫酸 銨分級沉澱，即為將新鮮文蛤體液離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至30%飽和 度；離心，收集上清液，向上清中緩慢加入硫酸銨至70%飽和度；離心，收集上清液，向上清 中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，離心收集沉澱。
7.按權利要求5或6所述的文蛤多肽的應用，其特徵在於所述步驟1)中離心條件為 10000 X g，離心20分鐘。
全文摘要
本發明涉及生化與生物醫藥領域，具體的說是一種文蛤多肽的應用。文蛤多肽在製備預防和/或治療惡性腫瘤藥物中的應用。本發明從文蛤中分離得到具有抗腫瘤作用的多肽Mere15，實驗證實，該多肽在體外能夠誘導人肺癌細胞株A549發生G2/M期細胞周期阻滯，並對其他多種腫瘤細胞均有顯著的細胞毒活性。與現有的化療藥物相比，抗腫瘤多肽類藥物具有毒副作用小、不易產生耐藥性等優點。
文檔編號C07K14/435GK102125686SQ20111003654
公開日2011年7月20日 申請日期2011年1月31日 優先權日2011年1月31日
發明者劉明, 林秀坤, 王翠翠, 魏鑑騰 申請人:中國科學院海洋研究所