一種減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法
2023-05-07 06:25:11 2
專利名稱：一種減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法。背景技術：
IFN可分為兩個型(I型和II型)，IFN- α、β屬於I型幹擾素，IFN- Y屬於II型幹擾素，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節作用。1995年Digby和Lowenthal首次成功地克隆出雞 IFN- y (chIFN- γ )後，國內外學者通過大腸桿菌、酵母、杆狀病毒等表達系統對chIFN- γ 做了大量研究。本課題組也曾將chIFN-γ克隆入原核表達載體pET3h中，但是表達的蛋白純化步驟繁瑣、在胃容易被胃酸破壞等缺點。
發明內容
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種對雞具有明顯的抗新城疫病毒 (NDV)的減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法，它以真核質粒pVAXl°為載體表達雞 Y幹擾素(chIFN-γ )具有很高的抗VSV活性，並將重組質粒電轉化入減毒沙門氏菌獲得菌種。本發明是通過如下技術方案實現的
一種減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟
(1)雞Y幹擾素(ChIFN-Y)的成熟蛋白的基因序列的擴增；
(2)重組真核表達質粒的獲得；
(3)重組真核質粒表達的chIFN-γ活性單位檢測；
(4)重組質粒pVAXl°-chIFN-γ電轉化入減毒沙門氏菌獲得菌種。該減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，還包括給雞口服傳遞chIFN-γ的減毒沙門氏菌後攻毒保護試驗將減毒沙門氏菌培養增殖後給雞口服，第一天和第二天各口服一次，劑量為IO8Cfu，第3天以50 LD50的新城疫病毒NDV攻毒。該減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 (1-1)引物的設計及合成；
(1-1-1)根據 GenBank 公布的 ChIFN-γ 的基因序列(GenBank no. AY501004),採用一對擴增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物，在引物chlFN-Y-Fwd的5』端引入 ^coRI酶切位點和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入煬οI酶切位點，引物序列如下
chIFN-γ-Fwd: 5』 -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3』 chIFN-y-Rev:
5』 -GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3』 ；
(1-2)從雞的脾淋巴細胞提取總RNA，採用RT-PCR技術擴增出chIFN-γ的成熟蛋白 cDNA的PCR產物；
(2)用&ORI和損ol雙酶切pVAXl°，膠回收載體片段，與同樣經過雙酶切並膠回收的chlFN-y成熟蛋白基因的PCR產物在16° C過夜連接，轉化DH5 α感受態細菌，篩選出陽性克隆 pVAXl°-chIFN-γ ；
(3-1)重組質粒 pVAXl°-chIFN- γ 轉染 ΗΕΚ493Α 細胞；
(3-1-1)將1. 0μδ重組真核質粒pVAXl°-chIFN- γ轉染ΗΕΚ493Α細胞，24h後反覆凍融細胞轉染物3次，12000rpm離心lOmin，取上清孵育雞胚成纖維細胞，24h後接毒IOOTCID5q 的 VSV ；
(3-2)重組質粒pVAXl°-chIFN- γ表達的chIFN- Y蛋白抗VSV活性檢測； (3-2-1)用VSV檢測IFN的活性單位高達1 X 106 °U/0. Iml ；
(4)將0. μδ重組真核質粒電轉化入減毒沙門氏菌的感受態細胞中，塗布卡那黴素抗性平板，獲得減毒沙門氏菌菌株。本發明減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，通過RT-PCR技術擴增出雞γ 幹擾素(chIFN- y )的成熟蛋白的cDNA序列，將基因克隆入真核質粒表達載體pVAXl°中，獲得了重組真核表達質粒pVAXl°-chIFN- Y，將該重組真核質粒轉染ΗΕΚ493Α細胞，通過水泡性口炎病毒(VSV)抑制試驗證實了表達的chIFN-γ具有很好的抗病毒活性。將該重組真核質粒電轉化入減毒沙門氏菌，無特定病原體(SPF)雞口服後能夠抵抗新城疫病毒NDV的感染。本發明由減毒沙門氏菌傳遞chIFN- γ，可有效避免雞口服幹擾素後易被胃酸降解、蛋白純化步驟繁瑣等問題，此種chIFN-γ可以通過細菌發酵的方法製取，並且減毒沙門氏菌的貯藏方法簡單，因此具有適合規模化生產、易貯藏等優點，對雞具有明顯的抗新城疫病毒NDV保護力，可以為規模化雞場新城疫等病毒性疾病的預防和治療提供保障。
下面結合附圖對本發明作進一步的說明。圖1為ChIFN-Y成熟蛋白基因克隆入pVAXl°的示意圖； 圖2為重組質粒pVAXl°-chIFN- YEcoRl/Xhol雙酶切鑑定結果。M1 kb plus DNA Marker ； 1 chIFN- γ的PCR產物對照；
2:重組陽性質粒pVAXl -chIFN-Y RI/IAoI雙酶切。
具體實施方式
實施例1
該減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，包括如下步驟 (1)雞Y幹擾素(ChIFN-Y)的成熟蛋白的基因序列的擴增 (1-1)引物的設計及合成
(1-1-1)根據 GenBank 公布的 ChIFN-Y 的基因序列(GenBank no. AY501004),設計一對擴增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物。在引物chIFN-γ-Fwd的5』端引 A^oRI酶切位點和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入煬οI酶切位點，引物序列如下
chIFN-γ-Fwd: 5』 -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3』 chIFN-y-Rev:
5，-GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3，上下遊引物橫跨chIFN-γ成熟蛋白編碼區，預計擴增片段長度為480bp左右，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；
(1-2)無菌採集健康雞的脾臟，用淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，用10%胎牛血清的 1640液在37°C 5%的(X)2培養lh。然後加入50(^g/mL的PHA刺激1 後，用TRIzol試劑提取總RNA，作為RT-PCR的模板；經Oligo (！⑴反轉錄後以cDNA為模板，以chIFN-γ-Fwd/ chIFN- y -Rev 為引物在進行 PCR 擴增，體系為 25μ :cDNA μ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ ，chIFN-γ-Fwd/chlFN-γ-Rev濃度均為 400nmol/L， TaKaRa LA Taq 2U。反應條件為預變性95。C 5min ；95° C 45s, 62° C 45s, 72° C 45S，共進行 35個循環；然後72°C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。這樣採用RT-PCR 技術擴增出了 chIFN- γ的成熟蛋白cDNA的PCR產物；
(2)重組真核表達質粒的獲得
膠回收穫得chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR產物，用和損ol雙酶切載體pVAXl° 並膠回收載體片段，與同樣經過雙酶切的chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR產物在16°C過夜連接，轉化DH5 α感受態細菌，37° C過夜培養16h。挑取菌落於卡那黴素抗性的LB培養基中 37°C過夜振蕩培養，第二天提取質粒，進行feoRI和損ol雙酶切鑑定。鑑定為陽性的質粒 pVAXl°-chIFN-Y交由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，用Vector NTI和DNAMar 軟體分析所插入的基因序列和推導胺基酸序列；
(3)重組真核質粒表達的chIFN-γ活性單位檢測
(3-1)重組質粒 pVAXl°-chIFN- γ 轉染 ΗΕΚ493Α 細胞
(3-1-1)在轉染的前一天，準備好ΗΕΚ493Α細胞的6孔細胞板，於37° C 5%的(X)2培養箱中培養。在滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37° C預熱的OPTI-MEM無血清培養基，然後加入1. θμδ的重組質粒pVAXl°-chIFN- γ，輕輕混勻；在另一個滅菌的1. 5mL的離心管中先加入500μ 37° C預熱的0ΡΤΙ-ΜΕΜ無血清培養基，然後加入2. 5μ Lipofectamine 2000轉染試劑，輕輕混勻，在室溫放置5min ；然後將兩個1. 5mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20min ；從(X)2培養箱中取出細胞板，棄去上清，把混合物輕輕加入到細胞面上，然後立即把細胞板放入CO2培養箱中；溫育Mi後，吸掉上清，輕輕加入2. OmL 37°C預熱的10%的胎牛血清DMEM，放入(X)2培養箱繼續培養Mh，然後反覆凍融細胞轉染物3次， 12000rpm離心lOmin，取上清待檢；
(3-2)重組質粒pVAXl°-chIFN- γ表達的chIFN- Y蛋白抗VSV活性檢測
(3-2-1)向生長於96孔板上的雞胚成纖維細胞單層加入倍比維持液稀釋的凍融裂解上清，每個稀釋度4個孔，於37° C作用24h，吸去上清，每孔接種IOOTCId50 WVSVj37°C 5%的C02培養箱中培養，24-36h觀察各孔細胞病變，以能抑制50%細胞病變的樣品的最高稀釋度定義為IFN的1個活性單位(IU)；
經檢測，1. 0μδ的重組質粒pVAXl -chIFN- γ轉染ΗΕΚ493Α細胞後的裂解上清中，IFN 的活性單位高達lX106_°U/0. 1ml，從而證明了重組質粒pVAXl -chIFN-Y能夠有效表達 ch IFN- γ ；
(4)重組質粒pVAXl°-chIFN-γ電轉化入減毒沙門氏菌獲得菌種
挑取減毒沙門氏菌培養平板上的單個菌落接種3mL LB液體培養基，37°C、200rpm過夜振蕩培養；次日，將過夜培養物按飢體積接種IOOmL LB液體培養基，37° C，200rpm振蕩培養，至OD6tltlnm=O. 4 0. 6 ；將培養物冰浴30min，4000rpm離心IOmin收穫菌體；棄去所有上清，用等體積、冰浴冷的WB溶液重懸細菌，4°C、4000 rpm，離心30min (WB=10%甘油，90%雙蒸水，過濾或高壓滅菌)；重複上一步驟2次；棄去大部分WB，使剩餘體積為原始培養物的 0. 5%，重懸，即製備得到減毒沙門氏菌電轉化感受態細胞。每管分裝50μ ，- 80°C凍存備用；將0. Wg重組真核質粒pVAXl°-chIFN-Y電轉化入減毒沙門氏菌的感受態細胞中，電轉化參數為2. 5KV，200Q，25PF。電轉化後向電極杯中立即加入ImL LB，37° C振蕩培養Ih ；取 200μ 塗布卡那黴素抗性平板，37° C過夜培養20h。挑取單菌落於卡那黴素抗性的LB中，過夜振蕩培養獲得減毒沙門氏菌菌株。
實施例2:
給雞口服傳遞chIFN-γ的減毒沙門氏菌後攻毒保護試驗
將含有質粒pVAXl°-chIFN- γ的減毒沙門氏菌過夜振蕩培養增殖後離心，用PBS液重懸，計算cfu，同時設立不含任何質粒的減毒沙門氏菌做對照。將含有質粒pVAXl°-ChIFN- γ 的減毒沙門氏菌和對照減毒沙門氏菌的濃度均調整為108cfu/mL。取20隻20日齡的SPF 雞隨機分為2組，試驗組口服IO8Cfu的含有質粒pVAXl°-chIFN- γ的減毒沙門氏菌，對照組口服不含任何質粒的減毒沙門氏菌。試驗第一天和第二天各口服一次，第3天以50 LD5tl的新城疫病毒NDV攻毒，觀察對照組10隻雞全部死亡，而試驗組有8隻雞無新城疫症狀，另外 2隻出現了輕微的精神沉鬱症狀，保護率為80%，因此具有明顯的保護作用。
權利要求
1.一種減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)雞Y幹擾素ChIFN-γ的成熟蛋白的基因序列的擴增；(2)重組真核表達質粒的獲得；(3)重組真核質粒表達的chIFN-γ活性單位檢測；(4)重組質粒pVAXl°-chIFN-γ電轉化入減毒沙門氏菌獲得菌種。
2.根據權利要求1所述的減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，其特徵在於還包括給雞口服傳遞chIFN-γ的減毒沙門氏菌後攻毒保護試驗將減毒沙門氏菌培養增殖後給雞口服，第一天和第二天各口服一次，劑量為108cfu，第3天以50 LD50的新城疫病毒 NDV攻毒。
3.根據權利要求1所述的減毒沙門氏菌傳遞雞Y幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1-1)引物的設計及合成；(1-2)從雞的脾淋巴細胞提取總RNA，採用RT-PCR技術擴增出chIFN-γ的成熟蛋白 cDNA的PCR產物；(2)用&ORI和損ol雙酶切pVAXl°，膠回收載體片段，與同樣經過雙酶切並膠回收的 chlFN-y成熟蛋白基因的PCR產物在16° C過夜連接，轉化DH5 α感受態細菌，篩選出陽性克隆 pVAXl°-chIFN-γ ；(3-1)重組質粒 pVAXl°-chIFN- γ 轉染 ΗΕΚ493Α 細胞； (3-2)重組質粒pVAXl°-chIFN- γ表達的chIFN- Y蛋白抗VSV活性檢測； (4)將0. μδ重組真核質粒電轉化入減毒沙門氏菌的感受態細胞中，塗布卡那黴素抗性平板，獲得減毒沙門氏菌菌株。
4.根據權利要求3所述的減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1-1-1)採用一對擴增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特異性引物，在引物 chIFN- y -Fwd的5，端弓丨入^boRI酶切位點和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入損ο 酶切位點，引物序列如下chIFN-γ-Fwd: 5』 -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3』 chIFN-y-Rev:5』 -GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3』。
5.根據權利要求3所述的減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(3-1-1)將1. 0μδ重組真核質粒pVAXl°-chIFN- γ轉染ΗΕΚ493Α細胞，24h後反覆凍融細胞轉染物3次，12000rpm離心lOmin，取上清孵育雞胚成纖維細胞，24h後接毒IOOTCID5q 的 VSV ；(3-2-1)用VSV檢測IFN的活性單位高達IX 106_°U/0. 1ml。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，特別公開了一種減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法。該減毒沙門氏菌傳遞雞γ幹擾素的製備方法，其特徵在於包括如下步驟雞γ幹擾素(chIFN-γ)的成熟蛋白的基因序列的擴增；重組真核表達質粒的獲得；重組真核質粒表達的chIFN-γ活性單位檢測；重組質粒pVAX1 -chIFN-γ電轉化入減毒沙門氏菌獲得菌種。本發明由減毒沙門氏菌傳遞chIFN-γ，可有效避免雞口服幹擾素後易被胃酸降解、蛋白純化步驟繁瑣等問題，此種chIFN-γ可以通過細菌發酵的方法製取，具有易貯藏等優點，對雞具有明顯的NDV保護力，可以為規模化雞場新城疫等病毒性疾病的預防和治療提供保障。
文檔編號C12N15/23GK102250919SQ20111014435
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者張旭東, 李玲 申請人:山東步步贏生物科技有限公司