生物膜形成抑制劑和/或除去劑、以及生物膜形成抑制方法和/或除去方法與流程

2023-04-29 20:27:16 2

本發明涉及生物膜形成抑制劑和/或除去劑、以及生物膜形成抑制方法和/或除去方法。更詳細而言，涉及以鄰氨基苯甲酸或特定的鄰氨基苯甲酸衍生物、或者它們的鹽為有效成分的生物膜形成抑制劑和/或除去劑、以及生物膜形成抑制方法和/或除去方法。

背景技術：

生物膜(biofilm)也被稱為菌膜(pellicle)，是指由細菌形成的結構體。生物膜的形成如下進行。首先，附著於基質的細菌分泌細胞外多糖、蛋白質等。它們發揮阻隔材料、運輸通路的作用，保護內部的細菌免受環境變化、化學物質的影響。可以認為，細菌邊重複對基質的附著和脫離，邊緩慢地在基質表面形成生物膜。

然而，在各種製品的製造工序、熱交換機等中，生物膜的形成導致製品品質、生產率的劣化，根據情況，有產生健康損害的擔心，因此不是理想的。

為了抑制這樣的生物膜的形成、或者為了除去已經形成的生物膜，以往使用有殺菌劑。

為了利用殺菌劑抑制生物膜的形成，理想的是，必須在細菌形成生物膜之前的階段，殺滅浮遊狀態的細菌或抑制浮遊狀態的細菌增殖。這是由於，殺菌劑對浮遊狀態的細菌的殺菌是有效，但對於已經形成了生物膜的細菌，由於被細胞外多糖類所覆蓋的生物膜的結構產生，從而對殺菌劑有時示出高的耐性。

因此，為了使用殺菌劑來抑制生物膜的形成，對於浮遊狀態的防除對象的菌，必須以高濃度(例如最小殺菌濃度(mbc)或最小抑菌濃度(mic)以上)使用殺菌劑。另外，對於已經形成的生物膜，必須以更高濃度使用殺菌劑。

高濃度的殺菌劑有對人體產生有害的作用的擔心或者引起造水膜等作為生物膜的形成防除對象的構件的變質、腐蝕的擔心。另外，通過長期使用殺菌劑，也有如下危險性：選擇性地使對殺菌劑有耐性的生物膜形成菌殘留，在體系內會濃縮。

另外，作為殺菌劑的特徵，低於mic時，不具有對浮遊狀態細菌的殺滅作用和增殖抑制作用，因此，當然不示出生物膜的形成抑制作用，也不示出生物膜的除去作用。

因此，利用殺菌劑的生物膜的形成抑制和生物膜的除去未必說是有效的。

由以上，期望如下藥劑：其不是通過利用殺菌劑對浮遊細菌進行殺菌來抑制生物膜的形成或者通過對已經形成的生物膜中的細菌進行殺菌來去除生物膜，而是能夠利用不同作用抑制生物膜的形成且對已經形成的生物膜將其除去。

作為以往的用於對生物膜進行防除的技術，已知有專利文獻1～3所示的技術。

專利文獻1中記載了，針對形成以苯甲酸衍生物為有效成分的生物膜的細菌的增殖抑制劑。本文獻中僅記載了，關於苯甲酸衍生物對浮遊狀態的細菌本身的增殖抑制活性，對生物膜的形成抑制作用、所形成的生物膜的除去作用沒有記載。

專利文獻2中記載了，以鄰氨基苯甲酸、其衍生物為有效成分對軍團菌(legionella)的殺菌劑，另外，專利文獻3中記載了，以苯甲酸等芳香族羧酸作為有效成分的抗菌劑。

這些文獻中，最多僅對浮遊狀態的細菌本身的殺菌作用、靜菌作用、增殖抑制作用有記載，對於生物膜的形成抑制作用、所形成的生物膜的除去作用仍然沒有記載。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開平9-67211號公報

專利文獻2：日本特開2012-246228號公報

專利文獻3：日本特表2007-512356號公報

技術實現要素：

發明要解決的問題

本發明的課題在於，提供：安全性高且生物膜的形成抑制能力和/或已經形成的生物膜的除去能力優異的藥劑以及使用其的生物膜的形成抑制方法和/或生物膜除去方法。

用於解決問題的方案

本發明人為了解決前述課題，對各種種類的化學物質，針對由多種不同的菌形成的各生物膜的形成抑制和/或除去的可能性進行了深入研究。

其結果，令人驚奇的是發現：鄰氨基苯甲酸或特定的鄰氨基苯甲酸衍生物，或者它們的鹽有生物膜的形成抑制作用和/或除去作用，至此完成了本發明。

即，本發明具有以下特徵。

[1]一種生物膜形成抑制劑和/或除去劑，其含有選自下述通式(1)所示的鄰氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸衍生物、或者它們的鹽中的1種以上作為有效成分。

(式中，r1～r4分別獨立地表示下述。

r1：c(＝o)oh(羧基)、c(＝o)nh2、c(＝o)ocnh2n+1(烷基酯：n＝1～4)

r2、r3：滷原子、硝基、氫原子

r4：氫原子、ch3c(＝o)(乙醯基)、ch3c(＝o)ch2c(＝o)(乙醯乙醯基))

[2]根據[1]所述的生物膜形成抑制劑和/或除去劑，其中，有效成分以對生物膜形成細菌實質上不示出增殖抑制作用的濃度(低於最小抑菌濃度(mic))使用。

[3]根據[1]或[2]所述的生物膜形成抑制劑和/或除去劑，其中，前述鄰氨基苯甲酸衍生物選自由鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸乙酯、鄰氨基苯甲酸丙酯、鄰氨基苯甲酸丁酯、4-氯鄰氨基苯甲酸、6-氯鄰氨基苯甲酸、4-氟鄰氨基苯甲酸、6-氟鄰氨基苯甲酸、4-溴鄰氨基苯甲酸、6-溴鄰氨基苯甲酸、n-乙醯基鄰氨基苯甲酸、n-乙醯乙醯基鄰氨基苯甲酸、鄰氨基苯甲醯胺、4-硝基鄰氨基苯甲酸、6-硝基鄰氨基苯甲酸和它們的組合組成的組。

[4]根據[1]～[3]中任一項所述的生物膜形成抑制劑和/或除去劑，其中，生物膜形成細菌為製紙工序、分離膜、或者冷卻水工序中出現的細菌。

[5]根據[1]～[4]中任一項所述的生物膜形成抑制劑和/或除去劑，其中，生物膜形成細菌為選自屬於如下屬的細菌中的1種以上：屬於放線菌門(actinobacteria)的微桿菌(microbacterium)屬、屬於異常球菌(deinococcus)門的異常球菌屬、屬於變形菌(proteobacteria)門的蒼白桿菌(ochrobactrum)屬、食酸菌(acidovorax)屬、氣單胞菌(aeromonas)屬、克雷伯氏菌(klebsiella)屬、不動桿菌(acinetobacter)屬、腸桿菌(enterobacter)屬、枸櫞酸桿菌(citrobacter)屬、嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas)屬、假單胞菌(pseudomonas)屬、根瘤菌(rhizobium)屬、貪銅菌(cupriavidus)屬。

[6]一種生物膜形成抑制方法和/或除去方法，

所述方法包括使以下的生物膜形成抑制劑和/或除去劑與生物膜形成細菌接觸的工序；

生物膜形成抑制劑和/或除去劑含有選自下述通式(1)所示的鄰氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸衍生物、或者它們的鹽中的1種以上作為有效成分。

(式中，r1～r4分別獨立地表示下述。

r1：c(＝o)oh(羧基)、c(＝o)nh2、c(＝o)ocnh2n+1(烷基酯：n＝1～4)

r2、r3：滷原子、硝基、氫原子

r4：氫原子、ch3c(＝o)(乙醯基)、ch3c(＝o)ch2c(＝o)(乙醯乙醯基))

[7]根據[6]所述的生物膜形成抑制方法和/或除去方法，其中，前述工序為如下工序：有效成分以對生物膜形成細菌實質上不示出增殖抑制作用的濃度(低於最小抑菌濃度(mic))與生物膜形成細菌接觸。

[8]根據[6]或[7]所述的生物膜形成抑制方法和/或除去方法，其中，前述鄰氨基苯甲酸衍生物選自由鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸乙酯、鄰氨基苯甲酸丙酯、鄰氨基苯甲酸丁酯、4-氯鄰氨基苯甲酸、6-氯鄰氨基苯甲酸、4-氟鄰氨基苯甲酸、6-氟鄰氨基苯甲酸、4-溴鄰氨基苯甲酸、6-溴鄰氨基苯甲酸、n-乙醯基鄰氨基苯甲酸、n-乙醯乙醯基鄰氨基苯甲酸、鄰氨基苯甲醯胺、4-硝基鄰氨基苯甲酸、6-硝基鄰氨基苯甲酸和它們的組合組成的組。

[9]根據[6]～[8]中任一項所述的生物膜形成抑制方法和/或除去方法，其中，生物膜形成細菌為製紙工序、分離膜、或者冷卻水工序中出現的細菌。

[10]根據[6]～[9]中任一項所述的生物膜形成抑制方法和/或除去方法，其中，生物膜形成細菌為選自屬於如下屬的細菌中的1種以上：屬於放線菌門的微桿菌屬、屬於異常球菌門的異常球菌屬、屬於變形菌門的蒼白桿菌屬、食酸菌屬、氣單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、貪銅菌屬。

發明的效果

根據本發明，通過以鄰氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸衍生物、或者它們的鹽為有效成分的藥劑，能夠有效地抑制生物膜的形成，另外，能夠除去所形成的生物膜。這些有效成分與以往的殺菌劑相比，殺菌能力非常低，因此，對人體、環境的安全性高。另外，這些有效成分不是氧化劑那樣的高反應性的物質，因此有不易引起作為應用對象的構件等的劣化、也容易操作的優點。

具體實施方式

(生物膜形成抑制劑和/或除去劑)

本發明的生物膜形成抑制劑和/除去劑是含有選自下述通式(1)所示的鄰氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸衍生物、或者它們的鹽中的1種以上作為有效成分的藥劑。

(結構式中，r1～r4分別獨立地表示下述。

r1：c(＝o)oh(羧基)、c(＝o)nh2、c(＝o)ocnh2n+1(烷基酯：n＝1～4)

r2、r3：滷原子、硝基、氫原子

r4：氫原子、ch3c(＝o)(乙醯基)、ch3c(＝o)ch2c(＝o)(乙醯乙醯基))

r2(苯環的4位的氫)為滷原子、硝基或者氫原子，作為滷原子，優選氯、氟、溴，更優選氯。

r3(苯環的6位的氫)為滷原子、硝基或者氫原子，作為滷原子，優選氯、氟、溴，更優選氯。

作為本發明的鄰氨基苯甲酸的衍生物的具體例，可以舉出：鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸乙酯、鄰氨基苯甲酸丙酯、鄰氨基苯甲酸丁酯、4-氯鄰氨基苯甲酸、6-氯鄰氨基苯甲酸、4-氟鄰氨基苯甲酸、6-氟鄰氨基苯甲酸、4-溴鄰氨基苯甲酸、6-溴鄰氨基苯甲酸、n-乙醯基鄰氨基苯甲酸、n-乙醯乙醯基鄰氨基苯甲酸、鄰氨基苯甲醯胺、4-硝基鄰氨基苯甲酸、6-硝基鄰氨基苯甲酸等。

本發明中，生物膜形成抑制劑是指，至少具有生物膜的形成抑制作用的製劑；生物膜除去劑是指，至少具有生物膜的除去作用的製劑。因此，它們可以分別具有除此之外不同的作用，另外，也包含具有這些兩個作用的情況。

特別是，具有兩個作用的製劑有時表現為生物膜形成抑制劑和除去劑，但稱為一者的功能劑(例如生物膜形成抑制劑)的情況下，不是以排除另一者的功能劑(生物膜除去劑)的意圖而使用的。

另外，本申請說明書中，生物膜形成抑制和除去劑、具有生物膜形成抑制作用和除去作用的製劑、生物膜形成抑制劑和除去劑以相同含義使用。

本發明的生物膜形成抑制作用是指，抑制基於細菌的生物膜的形成的作用。作為確認該作用的有無的方法，例如有：對在包含試驗對象物質的培養基中培養細菌一定時間而得到的生物膜的形成量、與在不含試驗對象物質的培養基中進行該細菌培養而得到的生物膜的形成量(對照)進行比較的方法等。上述情況下，生物膜形成量少於對照時，可以判斷試驗對象物質有生物膜形成抑制作用。

本發明的生物膜除去作用是指，除去由細菌形成的生物膜的作用。作為確認該作用的有無的方法，例如有：使培養細菌而形成的生物膜與試驗對象物質接觸一定時間後的生物膜的形成量、與不跟試驗對象物質接觸而經過一定時間後的生物膜形成量(對照)進行比較的方法等。上述情況下，生物膜的形成量少於對照時，可以判斷對象物質有生物膜除去作用。

生物膜形成抑制作用期望大，後述的試驗例中算出的生物膜抑制率優選20％以上。此外，作為優選的抑制率，可以舉出：25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上。

生物膜除去作用期望大，後述的試驗例中算出的生物膜除去率優選20％以上。此外，作為優選的除去率，可以舉出：25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上。

本發明的生物膜形成抑制劑如前述那樣必須具有生物膜形成抑制作用，進一步根據使用目的而期望也具有其他作用，更期望具有生物膜除去作用。

如果將除了生物膜形成抑制作用之外、還具有生物膜除去作用的製劑、即生物膜形成抑制劑和除去劑給予至已經形成有生物膜的環境下，則生物膜被除去且之後生物膜的形成被抑制，能夠通常維持生物膜不存在的環境，因此是非常有效的。

(鄰氨基苯甲酸或者鄰氨基苯甲酸衍生物的鹽)

作為本發明的鄰氨基苯甲酸的鹽或者鄰氨基苯甲酸衍生物的鹽，只要為藥學上能夠允許的鹽、且具有生物膜的形成抑制作用和/或生物膜除去作用就沒有特別限制，例如可以舉出酸加成鹽和鹼加成鹽。作為酸加成鹽，可以舉出：與鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸等無機酸的鹽；與乙酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸等有機酸、氯的鹽。作為鹼加成鹽，可以舉出：與鈉和鉀等鹼金屬的鹽；與鈣和鎂等鹼土金屬的鹽；與銨和三乙胺等胺類的鹽。

(能夠使用的ph的範圍)

本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑可以根據各藥劑的種類而本領域技術人員根據其效果適當設定，優選以ph5.0～ph9.0的區域使用。本說明書中，「～」用於包含左右的數值的含義。此外，作為優選的範圍，可以舉出：大於ph5.0且ph9.0以下的區域、大於ph5.0且低於ph9.0的區域、ph5.5～ph9.0、ph5.5～ph8.5、ph5.5～8.0。

(生物膜形成細菌)

本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑所應用的生物膜的形成細菌包含形成生物膜的細菌。其中，優選屬於如下屬的細菌：屬於放線菌門的微桿菌屬、屬於異常球菌門的異常球菌屬、屬於變形菌門的蒼白桿菌屬、食酸菌屬、氣單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、貪銅菌屬。需要說明的是，生物膜的形成基本為以2種以上的細菌進行的情況，理想的是，包含1種以上的屬於上述各屬的細菌的生物膜作為本發明的對象。

(最小抑菌濃度(mic))

本發明中所謂最小抑菌濃度(mic)是指，抗生物質、殺菌劑抑制微生物增殖的最小濃度(靜菌、防腐效果)。因此，對於低於mic的濃度，可以以與對生物膜形成細菌實質上不示出增殖抑制作用的濃度為相同含義來把握。

mic可以利用對於本領域技術人員來說公知的方法而求出，例如可以舉出：埼玉縣產業技術中心研究報告書第8卷(2010)、「抗菌劑的簡易評價法的開發」、chemotherapy，jan.1990，p102-105，抗菌製品技術討論會、試驗法「(3)最小殺菌濃度測定法i(2012年度版)」等中記載的方法。

本申請中，對於測試生物膜形成抑制效果和/或生物膜除去效果的有無的各藥劑，預先求出各生物膜形成細菌的mic，在低於mic的濃度下，進行確認各生物膜形成細菌生長的試驗。

因此，低於mic的各藥劑的濃度下，能夠確認各生物膜形成細菌的生長、且能夠確認生物膜形成抑制效果和/或除去效果的情況下，能夠確認該藥劑為本發明的藥劑。即，可以確認本發明的藥劑為如下藥劑：不是通過對生物膜形成細菌的菌本身進行殺菌、或者抑制增殖從而抑制或除去生物膜的形成，而是利用不同的作用機制能夠抑制生物膜的形成、或能夠除去所形成的生物膜。

(使用形態)

本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑的用量可以根據用途、劑型而適當確定，但對生物膜起作用的情況下，通常，以水溶液的狀態使用，其濃度只要作為與生物膜形成細菌接觸的時刻的有效成分的濃度示出生物膜形成抑制作用和/或生物膜除去作用的濃度即可。

它們的濃度具體而言優選的是，最有效地發揮生物膜的除去作用或者生物膜的形成抑制作用的濃度，優選低於構成所作用的生物膜的主要的原因菌種的mic。實際上優選的是，通過預先特定生物膜的優先種類，以低於該優先種類的mic使用。其中，作為優選的範圍，例如可以舉出：0.001～10重量％、0.01～5重量％、0.05～1重量％等。

與生物膜形成細菌接觸的時刻的濃度是指，添加至存在生物膜的水溶液中時的、該水溶液中的有效成分的濃度。

因此，作為生物膜形成抑制劑和/或除去劑，可以為有效成分以高濃度調節而得到的物質，也可以為通過在使用時添加至包含生物膜的水溶液中從而稀釋、進入上述濃度範圍的物質。另外，還可以為使用時暫時稀釋至適合的濃度、進一步添加至包含生物膜的水溶液中從而最終進入上述濃度範圍的物質。另外，浸滲於海綿等而除去生物膜的情況下、或者將附著了生物膜的膜放入容器中並浸漬於包含本發明的生物膜形成抑制劑和除去劑的溶液而除去的情況下，只要浸滲於海綿的有效成分濃度、(添加有效成分後的)前述容器中的有效成分濃度為前述濃度範圍即可。

另外，進一步，本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑的有效成分具有即便低於mic生物膜形成抑制和除去效果也充分優異的性質，因此出於對環境的顧慮等，期望以儘量低的濃度使用，作為與生物膜形成細菌接觸的時刻的濃度，更期望低於mic的濃度。

部分地妨礙、殺滅菌的生長有長期導致更牢固的生物膜形成細菌出現的可能性。進一步，自殺滅了的菌的屍體漏出的有機物促進生物膜形成細菌的增殖，或者附著、堆積的菌的屍體本身在應用對象的器壁表面有時成為進一步用於生物膜形成的基礎。另外，即使殺滅形成生物膜的菌也不一定能夠破壞已經形成的生物膜結構本身，滅絕了的菌也不示出基於藥劑、自律性的作用的分散應答，因此作為結果甚至促進生物膜的形成。

從這些觀點出發，可以說本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑的有效成分的使用濃度期望為對生物膜形成細菌的生長、生存性不造成影響的低於mic的濃度。

預先使本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑作用的時間根據附著的生物膜的量、有效成分的濃度、作用溫度、物理力的有無而不同，通常為數秒至數小時的範圍。

作為本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑的劑型，根據用途、目的而可以舉出：溶於水、乙醇、異丙醇等溶劑的溶液、或者固體、凝膠狀、乳化·分散狀、粉末狀、氣霧劑等，可以從它們中適當選擇，根據作用濃度當然可以為製品形態，也可以事先形成高濃度的製品形態，在使用情況下進行稀釋而使用。

本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑在不有損本發明的目的的範圍內可以配合：增稠劑、粘度調節劑、ph調節劑、溶劑、香料、著色劑、抗氧化劑、防腐劑、螢光劑、賦形劑、去汙劑、漂白劑、漂白活化劑、粉末化劑、造粒劑、包衣劑等。

本發明的生物膜形成抑制劑和/或除去劑可以用於生物膜形成成為問題的廣泛的領域。例如可以用於食品製造或飲料製造工廠、烹飪臺、廚房、浴室、衛生間、廚房等的排水溝、排水管。

另外，可以用於產業用的冷卻塔等冷卻水系統、水處理膜、脫鹽裝置、製紙工廠等的循環水系路。另外，也可以用於容易形成生物膜的醫療設備例如內窺鏡、導管、人工透析機等的清洗劑。進而，從具有高的安全性的方面出發，也可以用於以身體為對象的清洗劑、牙膏劑、口腔護理劑、假牙護理劑、隱形眼鏡清洗劑等。

以下，基於實施例對本發明進行具體地說明，但本發明不受這些的任何限定。

實施例

〔試驗例1〕mic(最小抑菌濃度)的研究

對於各種生物膜形成細菌，求出作為試驗對象的化合物的mic。

(1)受試菌

使用表1所示的生物膜形成菌。這些菌是從實際的製紙工廠的各工序、分離膜、牙垢、海洋等中廣泛採集並分離而得到的菌，內的菌株表示各菌種的鑑定中使用的菌株的保藏編號。其中，綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)pao1nbrc106052株為生物膜形成細菌的代表菌株。

(2)評價對象物質

將表1所示的化合物作為評價對象物質。表1的化合物中，dbnpa(2,3-二溴丙醯胺)為有機系殺菌劑的1種，以下的試驗中，作為比較例使用。

各試劑的供應商如以下所示。

鄰氨基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸甲酯：和光純藥工業株式會社

鄰氨基苯甲醯胺、4-氯鄰氨基苯甲酸、4-氟鄰氨基苯甲酸、4-溴鄰氨基苯甲酸、6-氯鄰氨基苯甲酸、n-乙醯基鄰氨基苯甲酸、n-乙醯乙醯基鄰氨基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸乙酯：東京化成工業株式會社

(3)試驗方法

將評價對象物質用敏感性試驗用肉汁清湯培養基梯度性地進行稀釋，調製總計10ml的稀釋系列(其中，為目標濃度的1.1倍)。向其中添加菌液20μl，所述菌液是將各種受試菌株調製成108cfu/ml而得到的，用96孔板混合器，以37℃進行24小時振蕩培養(2000rpm)。目視沒有白濁的稀釋系列中，將最低的濃度作為mic。

(4)試驗結果

將結果示於表1。表中，「＜數值」表示mic小於該數值，「＞數值」表示mic大於該數值。

以下的生物膜形成抑制評價試驗和生物膜除去評價試驗以評價對象物質的最終濃度成為低於mic的濃度進行。

[表1]

〔試驗例2〕生物膜形成抑制評價試驗

對於作為試驗對象的各種化合物是否示出生物膜的形成抑制作用，進行了研究。

(1)受試菌

使用表2所示的各種菌株。

(2)評價對象物質

將表2所示的濃度的化合物作為評價對象物質。該濃度表示對培養基添加後的最終濃度，相當於低於前述試驗例1中求出的mic的濃度。

(3)試驗方法

(i)各受試菌使用的是在tsb(tripticsoybroth,bacto：difcolaboratories)培養基中使葡萄糖為終濃度1％的受試菌，在120rpm的條件調節預培養液。

(ii)以各預培養液濃度成為0.1％(v/v)的方式，用各個培養基稀釋，將150μl分注至96孔板中。

(iii)將評價對象物質以各濃度添加至培養基中，用鹽酸或氫氧化鈉調節為培養基ph＝7.0。將不含評價對象物質的樣品作為負對照(ph＝7.0)。

(iv)在以下的條件下培養各種細菌，進行生物膜的形成。

(a)將假中間蒼白桿菌(ochrobacteriumpseudointermedium)、克雷伯氏菌屬(klebsiellasp.)、鮑氏不動桿菌(acinetobacterbaumanii)、弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)、綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)在37℃、600rpm的條件下進行6小時培養，形成生物膜。

(b)將貪銅菌屬(cupriavidussp.)、變形假單胞菌(pseudomonasplecoglossicida)、人形微桿菌(microbacteriumhominis)在37℃、600rpm的條件下進行17小時培養，形成生物膜。

(v)除去各孔的培養液，分別用蒸餾水衝洗2次。

(vi)向附著於各孔內的生物膜中加入結晶紫水溶液(0.4w/v％,20w/v％甲醇)250μl，靜置2分鐘，染色後，用蒸餾水衝洗三次，除去未與生物膜結合的結晶紫水溶液。

(vii)向各孔中添加250μl的乙醇，靜置1小時，使結晶紫從染色後的生物膜溶出，測定波長595nm下的吸光度。

(viii)負對照測定值和各評價系列以5孔的平均值作為測定值，由下述計算式算出生物膜的抑制率。對於算出的值，基於下述判定基準進行評價。

生物膜抑制率(％)＝{1-(評價對象測定值/負對照測定值)}×100

＜判定基準＞

◎抑制效果高(抑制率為40％以上)

○有抑制效果(抑制率為20％以上且低於40％)

×無抑制效果(抑制率低於20％)

(4)試驗結果

將結果示於表2。

[表2]

〔試驗例3〕生物膜除去評價試驗

對於作為試驗對象的各種化合物是否示出所形成的生物膜的除去作用進行了研究。

(1)受試菌

使用表3所示的各種菌株。

(2)評價對象物質

將表3所示的濃度的化合物作為評價對象物質。該濃度表示對培養基的添加後的最終濃度，相當於低於前述試驗例1中求出的mic的濃度。

(3)試驗方法

(i)各受試菌使用的是，在tsb(tripticsoybroth,bacto：difcolaboratories)培養基中使葡萄糖為終濃度1％的受試菌，在120rpm的條件下調節預培養液。

(ii)以各預培養液濃度成為0.1％(v/v)的方式，用各個培養基稀釋，將150μl分注至96孔板中。

(iii)將各種細菌在以下條件下進行培養，進行生物膜的形成。

將假中間蒼白桿菌、貪銅菌屬、克雷伯氏菌屬、鮑氏不動桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、變形假單胞菌、人形微桿菌在37℃、600rpm的條件下進行17小時培養，形成生物膜。

(iv)除去各孔的培養液，分別用蒸餾水衝洗2次。

(v)將評價對象物質以各濃度添加至培養基中，用鹽酸或氫氧化鈉調節至培養基ph＝7.0。將向各孔中添加無菌培養基(ph＝7.0)200μl而得到的樣品作為負對照。

(vi)對於各菌，在與預培養相同的溫度下以600rpm振蕩3.5小時，使包含評價對象物質的培養基與生物膜接觸後，除去各孔的培養基，用蒸餾水衝洗二次。

(vii)向附著於各孔內的生物膜中加入結晶紫水溶液(0.4w/v％,20w/v％甲醇)250μl，靜置2分鐘，染色後，用蒸餾水衝洗三次，除去未與生物膜結合的結晶紫水溶液。

(viii)向各孔中添加250μl的乙醇，靜置1小時，使結晶紫從染色後的生物膜溶出，測定波長595nm下的吸光度。

(vix)負對照測定值和各評價系列以5個孔的平均值作為測定值，由下述計算式算出生物膜的除去率。對於算出的值，基於下述判定基準進行評價。

生物膜除去率(％)＝{1-(評價對象測定值/負對照測定值)}×100

＜判定基準＞

◎除去效果高(除去率為40％以上)

○有除去效果(除去率為20％以上且低於40％)

×無除去效果(除去率低於20％)

(4)試驗結果

將結果示於表3中。

[表3]

〔試驗例4〕基於ph的差異

(1)受試菌

使用綠膿桿菌pao1nbrc106052株。

(2)評價對象物質

將表4所示的濃度的化合物作為評價對象物質。該濃度表示對培養基的添加後的最終濃度，相當於低於前述試驗例1中求出的mic的濃度。

(3)試驗方法

試驗例2的(3)試驗方法的步驟(iii)中，將培養基的ph調節為表4所示的各ph，除此之外，與試驗例2的試驗方法同樣地進行。

(4)試驗結果

將結果示於表4。

[表4]

[考察]

實施例中列舉的評價對象物質的濃度均低於mic，實質上不具有評價菌株的增殖抑制作用(試驗例1)。因此認為這是由於，基於實施例所示的評價物質的生物膜的形成抑制作用和除去作用不取決於活菌數的差異，而是產生了菌的存在形態的變化。

對於作為比較例列舉的有機系殺菌劑的一種即dbnpa(2,3-二溴丙醯胺)，在低於mic的濃度下，不示出任何生物膜的形成抑制、除去作用，由此也可以示出實施例中列舉的物質的作用機制與殺菌作用不同。

對於實施例中列舉的物質，對於分類學上寬範圍的生物膜形成菌種、即屬於α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、放線菌門的菌種均示出生物膜的形成抑制效果以及生物膜除去效果。

根據試驗例2和3，鄰氨基苯甲酸和其一部分被取代而得到的衍生物、它們的鹽是有效的。例如，苯環的4位的氫被氯、氟、溴所取代而得到的物質是有效的，6位的氯取代體也示出效果，因此可以認為，同樣地6位的氟、溴取代體也是有效的。另外，羧基的取代體即鄰氨基苯甲醯胺、鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸乙酯也是有效的，因此同樣地認為，鄰氨基苯甲酸丙酯、鄰氨基苯甲酸丁酯等烷基酯也是有效的。

另外，氨基的取代體即n-乙醯基鄰氨基苯甲酸、n-乙醯基鄰氨基苯甲酸也是有效的。

進一步，根據試驗例4，本發明的生物膜形成抑制劑和除去劑在包含ph5.5～ph8.0的寬範圍的ph區域內是有效的。

產業上的可利用性

根據本發明，通過使鄰氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸衍生物、或者它們的鹽為有效成分，可以提供對分類學上寬範圍的細菌有效的生物膜形成抑制劑和/或除去劑。

特別是，可以提供對製紙工廠的製紙工序、水分離膜、冷卻塔等與水接觸的路徑中形成的生物膜有效的藥劑。

另外，本發明的藥劑以不抑制對象生物膜形成細菌的增殖那樣的低濃度也具有生物膜形成抑制效果和/或除去效果，因此也無需考慮使用的水環境對菌相的影響，是放心的。