DntR突變體及其在鄰苯二酚檢測中的應用的製作方法

2023-04-29 23:43:36 1

本發明屬於生物技術領域，具體涉及DntR突變體及其在鄰苯二酚檢測中的應用。

背景技術：

隨著工農業生產的迅速發展，越來越多的有毒物質(如重金屬和農藥)進入水體，對水環境造成嚴重汙染。芳香族汙染物(aromatic pollution,AP)在自然界廣泛存在，僅次於葡萄糖殘基，是工業廢水的主要有害成分，一直是環境汙染防治領域的研究熱點與難點。例如硝基類芳香化合物對人類健康具有非常嚴重的危害，然而人類的日常生活及生產活動向環境中排放了大量的芳香族化合物，此過程加劇了治理芳香族化合物的難度。芳香族類汙水毒性大，環境中殘留量多少不均，治理難度極大。利用生物轉化處理工業含有芳香族化合物的汙水，可以實現將汙染物轉化為鄰苯二酚或水楊酸，從而實現汙水的資源化再利用，符合綠色-低碳-循環經濟的發展路線。殘留的芳香族化合物在環境中經過複雜的物理、化學和生物轉化過程，又會形成新的汙染物，一些汙染物還可能進人食物鏈並在生物體內蓄積，最終對生物產生各種各樣的毒性效應，對生態環境有著破壞性的影響，因此找到一種可靈敏檢測並且能消除汙染物的代謝機制，對於治理人們擔心的在密集使用與製造此類汙染物的周圍土壤及地下水的汙染狀況，顯得尤為重要。

微生物對環境中存在的芳香族類汙染物的生物修復，由於投資少、佔地小又不需特殊設備，並且安全、殘留少已成為最有前途且應用前景十分廣闊的治理方法。研究表明，微生物通過調整其自身的適應性，從而可利用具有不同化學結構，攜帶不同側鏈或官能基團的化合物如苯、苯酚、苯胺、萘、蒽等作為細菌的碳源，目前已經報導分離出幾種能降解硝基甲苯和硝基苯類芳香族化合物的細菌和真菌。在微生物的好氧降解過程中，幾乎所有的芳香族化合物被不同程度地氧化為小分子化合物，一般是重要的化工中間體原料----鄰苯二酚和水楊酸，其中鄰苯二酚和水楊酸結構類似，並且可互相轉化。

在芳香族類化合物的微生物降解過程中，鄰苯二酚和水楊酸是主要的代謝中間產物，也是重要的化工中間體原料；水楊酸在水楊酸羥化酶作用下會生成鄰苯二酚。芳香族類汙染物降解基因簇的誘導物一般是降解的底物或降解的中間產物。目前微生物降解芳香類汙染物的研究中，在基因轉錄調控的方式及啟動子序列的結構特點的研究上取得了很大進展。目前已有多種調控蛋白被改造後，其誘導物的種類和特異性可以改變。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供一種蛋白質。

本發明提供的蛋白質是如下a)或b)或c)的蛋白質：

a)胺基酸序列是序列4所示的蛋白質；

b)在序列4所示的蛋白質的N端和/或C端連接標籤得到的融合蛋白質；

c)將序列4所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

本發明的另一個目的是提供與上述蛋白質相關的生物材料。

本發明提供的與上述蛋白質相關的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：

A1)編碼上述蛋白質的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；

A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；

A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；

A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；

A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；

A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；

A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；

A11)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；

A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)其編碼序列是序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

2)其編碼序列是序列7所示的cDNA分子或DNA分子；

3)與1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子；

4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。

上述相關生物材料中，所述重組微生物為將上述蛋白質的編碼基因導入宿主菌中得到的菌。

上述相關生物材料中，所述蛋白質的編碼基因的核苷酸序列是序列3所示的DNA分子或序列7所示的DNA分子。

上述相關生物材料中，所述蛋白質的編碼基因是通過重組載體導入宿主菌的；

所述重組載體為將序列7所示的DNA分子插入到含有目的基因的表達載體中得 到的.

上述相關生物材料中，所述重組載體具體為將序列7所示的DNA分子插入pRk載體的NdeI和NcoI酶切位點間，且保持pRk載體的其他序列不變，得到的載體；

所述宿主菌為BW25113菌株。

本發明的另一個目的是提供上述蛋白質或上述相關生物材料的新用途。

本發明提供了上述蛋白質或上述相關生物材料在調節目的基因表達中的應用。

上述應用中，所述調節為在鄰苯二酚誘導下促進目的基因表達。

上述應用中，所述目的基因為GFP基因。

上述蛋白質或上述相關生物材料在檢測待測樣品中鄰苯二酚含量中的應用也屬於本發明的保護範圍。

本發明通過定向改造DntR調控基因，構建較大容量的突變體文庫，建立以綠色螢光蛋白為報告基因的生物效應器，並結合流式細胞儀分選的高通量篩選方法，得到鄰苯二酚生物感應分子；該生物感應分子可用於檢測工業汙水處理的排放標準及環境中汙染物殘留量，還可推廣到AP降解關鍵酶基因定向改造的高通量篩選。

附圖說明

圖1為DntR、Pdnt、dntR的PCR產物。1:陰性對照；2-4:OverLapPCR產物；M1:1kb Marker；5-8:dntR PCR；產物9-14:Pdnt。

圖2為重組質粒載體pDntR的構建。

圖3為重組質粒pDntR驗證。1：pDntR(Pdnt4-1)重組質粒；2：Pdnt4-1PCR擴增；3：Pdnt4-1(NdeI+HindIII)雙酶切；4：1kbMarker；5：2KpLusMarker。

圖4為重組質粒pDntR不同處理下螢光信號值。

圖5為突變體預篩選螢光信號值。

圖6為突變體文庫第五輪流式細胞儀分析結果。

圖7為突變體文庫第五輪螢光信號值結果。

圖8為潛在突變體響應值及本底螢光值。圖8A為樣品潛在突變體與WT加入誘導劑鄰苯二酚與不加誘導劑的的比值；圖8B為本底螢光值是指潛在突變體不加誘導劑與WT不加誘導劑的比值。

圖9為突變體c5-5、WT和lib0對鄰苯二酚的誘導倍數比較。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的BW25113菌株在文獻「Grenier,F.,Matteau,D.,Baby,V.,and Rodrigue,S.Complete Genome Sequence of Escherichia coli BW25113.(2014)Genome announcements 2」中公開過，公眾可從中國農業科學院研究生院獲得。

下述實施例中的DH10B菌株在文獻「Durfee,T.,Nelson,R.,Baldwin,S.,Plunkett,G.,3rd,Burland,V.,Mau,B.,Petrosino,J.F.,Qin,X.,Muzny,D.M.,Ayele,M.,Gibbs,R.A.,Csorgo,B.,Posfai,G.,Weinstock,G.M.,and Blattner,F.R.The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B:insights into the biology of a laboratory workhorse.(2008)Journal of bacteriology 190,2597-2606」中公開過，公眾可從中國農業科學院研究生院獲得。

實施例1、DntR突變體DntR-c5-5的獲得

一、突變體文庫的構建

1、pDntR重組質粒的構建

(1)以pUC57-saLR為模板，採用帶有限制酶切位點的引物dntR-for-NcoI和dntR-rev進行PCR擴增，得到PCR擴增產物1，即為dntR基因序列；

(2)以pUC57-saLR為模板，採用引物pdnt-for和pdnt-rev-NdeI進行PCR擴增，得到PCR擴增產物2，即為Pdnt啟動子；

(3)將PCR擴增產物1和PCR擴增產物2按摩爾質量比1：1混合，並將其作為模板，採用上遊引物dntR-for-NcoI和下遊引物pdnt-rev-NdeI重疊交錯延伸擴增，得到OverLapPCR產物，即為DntR調控基因的全長序列。圖1為擴增產物的電泳圖。

(4)用限制性內切酶NdeI和NcoI對OverLapPCR產物和pRk載體(pRk載體的核苷酸序列如序列5所示，該載體的多克隆位點區域內融合了增強型綠色螢光蛋白基因eGFP，受阿拉伯糖誘導)酶切，連接，構建pDntR重組質粒(圖2)，並對其進行測序驗證。

測序結果表明：pDntR重組質粒為將序列6所示的DNA分子插入pRk載體的NdeI和NcoI酶切位點間，且保持pRk載體的其他序列不變，得到的載體。其中序列6的第1-906位為DntR基因序列。

(5)重組質粒pDntR驗證

將步驟(4)獲得的重組質粒pDntR轉化至BW25113菌株，塗布抗性(kan 50μg/mL)平板，挑取單克隆培養，提取質粒DNA，用限制性酶NdeI和NcoI進行雙酶切鑑定。

結果如圖3所示：酶切後可得到一條大小約為1.0kb的小片段和一條4.8kb的長片段；以重組質粒為模板，利用引物dntR-for-NcoI和pdnt-rev-NdeI PCR擴增可得到1.05kb的DntR調控基因全長序列；雙向測序驗證DNA序列沒有突變。結果證明pDntR構建成功。

2、pDntR重組質粒螢光信號值的檢測

重組質粒pDntR是在報告基因eGFP上遊插入DntR調控基因及其調控啟動子Pdnt，進而形成由轉錄調控基因為主要元件，可受誘導劑誘導下遊基因表達的生物效應器。當重組質粒pDntR受阿拉伯糖和誘導劑水楊酸同時處理，會形成級聯放大體系使報告基因eGFP高效表達，其螢光信號可藉助酶標儀被檢測分析；當重組質粒pDntR沒有誘導劑誘導，只有阿拉伯糖存在時，報告基因eGFP本底表達。

(1)菌液的製備

將重組質粒pDntR導入BW25113菌株得到重組菌pDntR/BW25113，將其命名為WT，將WT按照體積比為1％的比例轉接至新鮮LB液體培養基(Kan 50μg/mL)，再加入誘導劑，按照是否加入誘導劑分為如下三組進行處理：

第一組(WT)：將WT和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

第二組(WT+阿拉伯糖)：將WT、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系，阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM；

第三組(WT+阿拉伯糖+水楊酸)：將WT、阿拉伯糖及水楊酸混勻，得到反應體系，阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM，水楊酸在反應體系中的濃度為1mM。

(2)酶標儀螢光信號值檢測

分別將上述步驟(1)製備的各組反應體系37℃，220rpm培養10小時，離心收集菌體，用無菌PBS緩衝液重懸兩次，各取200μL加入96微孔酶標板內，設PBS緩衝液作為雙陰對照，其中將重組質粒pDntR設為野生型WT；用TECAN酶標儀分別檢測菌液吸光值及綠色螢光蛋白信號值。

結果如圖4所示：(WT+阿拉伯糖+水楊酸)的螢光信號值明顯高於(WT+阿拉伯糖)組和(WT)組。加入誘導劑水楊酸後，重組質粒pDntR的螢光信號強度遠高於對照。證明重組質粒pDntR功能正確，可用於下一步試驗。

3、DntR突變體文庫構建及突變豐度驗證

(1)DntR突變體基因克隆

參照簡併引物的設計原則，設計帶有突變位點且有互補末端的兩對引物F1-for/F1-rev和F2-for/F2-rev，以重組質粒pDntR為模板，PCR擴增帶有突變位點的DNA片段F1(218bp)和F2(100bp)。切膠回收F1和F2片段，以F3-for/F3-rev為引物採用重疊交錯延伸的方法融合擴增F3片段(285bp)，最終得到DntR基因突變體全長序列。

(2)MegaWhop PCR擴增

將重疊交錯延伸PCR擴增得到的DntR突變全長基因進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，核酸濃度定量，並以此作為大片段引物(megaprimer)，以重組質粒pDntR 為模板，採用Megaprimer PCR of WhoLe pLasmid的方法構建DntR突變體文庫，得到MegawhopPCR產物。並對Megawhop PCR產物甲基化處理，得到甲基化處理的Megawhop PCR產物。

(3)突變體文庫豐度驗證

將甲基化處理的Megawhop PCR產物過柱純化回收，42℃熱激轉化至甲基化感受態細胞(DMT ChmeicaLLy Comptent Cell)，隨機挑選20個單克隆子，測序分析突變豐度，與野生型菌株相比，陽性率達80％，出現11種突變類型；因此構建成的DntR突變體文庫可以進行後續實驗。

(4)DntR突變體文庫構建

A、將突變豐度達到理想的MegawhopPCR產物分別稀釋至10ng/μL、20ng/μL、35ng/μL、50ng/μL、100ng/μL五個稀釋度，以0.1ng/μL pUC18標準質粒作為模板，分別轉化至感受態細胞DH10B菌株，比較轉化效率確定最佳轉化濃度。最佳濃度為20ng/μL。

B、按最佳濃度將Megawhop PCR產物進行電擊轉化。電擊後，快速往電擊杯中加入700μLLB液體培養基，稍混勻，吸入1.5mL離心管中，37℃150rpm復甦1小時。

C、取復甦好的培養物1μL、10μL加入100μLLB混勻，分別塗布相應抗性平板，37℃倒置過夜培養。第二天，計算轉化效率並統計轉化克隆子數目。

(5)突變體數量富集

A、構建突變體文庫採用的方法是定點隨機突變，根據目的基因的保守胺基酸序列，設計簡併引物引入突變位點，簡併度為NNS，則理論的突變體數目為106。因為每個克隆子內只含一個質粒DNA，為了篩選到理想突變體，突變體克隆子數目至少需達到106。

B、將數目達到預期的多代突變體克隆子活化，提取其質粒DNA，作好標記；分別取每一代的質粒DNA約20ng，混合到一個離心管內。

C、多次實驗優化電擊轉化條件，終定為20ng質粒電擊轉化至BW25113感受態細胞，轉化效率達到最好；

D、取出長滿突變克隆子的平板，用滅菌的LB培養基，刮菌至離心管內，加入終濃度為20％的甘油。將克隆數目至106的富集突變體菌株命名為Lib0(突變體文庫)，-70℃分裝保存。待下一步突變體篩選使用。

二、突變體文庫的篩選

1、突變體文庫的預篩選

(1)菌液的處理

分別將WT和Lib0按照體積比為1％的比例轉接至新鮮LB液體培養基(50μg/mL Kan)，再加入誘導劑，按照是否加入誘導劑分為如下四組進行處理：

第一組(Lib0-(阿拉伯糖))：將Lib0、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

第二組(Lib0-(阿拉伯糖+水楊酸))：將Lib0、阿拉伯糖、水楊酸和LB液體培養基混勻，得到反應體系，阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM；水楊酸在反應體系中的濃度為1mM；

第三組(WT-(阿拉伯糖))：將WT、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系，阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM；

第四組(WT-(阿拉伯糖+水楊酸))：將WT、阿拉伯糖、水楊酸和LB液體培養基混勻，得到反應體系，阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM，水楊酸在反應體系中的濃度為1mM。

(2)酶標儀螢光信號值檢測

將上述步驟(1)中的各組菌液12000rpm離心10min，棄上清，用2mL PBS緩衝液重懸菌體，各取200uL分別檢測OD600和螢光信號值。

結果如圖5所示，從圖5可看出：加入誘導劑水楊酸後，Lib0和WT的螢光信號值均高於對照；並且WT-(阿拉伯糖+水楊酸)高於Lib0-(阿拉伯糖+水楊酸)。

(3)流式細胞儀檢測

將上述步驟(1)中的各組菌液稀釋至104cfu/mL，用流式細胞儀分析，比較誘導劑處理的樣品與對照之間螢光信號值的差異，進而確定突變體文庫的質量。

結果如圖6所示：當只有阿拉伯糖存在時，WT和Lib0本底螢光信號比例各佔14.0％和14.2％，說明eGFP正常本底表達；當誘導劑水楊酸和阿拉伯糖均存在時，誘導產生的強螢光信號細胞在WT和Lib0中各佔比例為96％和51.3％；誘導後突變體文庫的螢光信號強度弱於WT，但相比未添加誘導劑水楊酸，Lib0誘導產生的強螢光信號細胞提高了37.1％，結果與酶標儀測定的螢光信號值結果一致。

綜上所述：突變體文庫構建成功，可用於下一步鄰苯二酚感應分子的研製。

2、突變體文庫篩選

(1)菌液的處理

分別將WT和Lib0按照體積比為1％的比例轉接至新鮮LB液體培養基(Kan50μg/mL)，再加入誘導劑，按照是否加入誘導劑分為如下三組進行處理：

第一組(WT)：將WT、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM；

第二組(Lib0)：將Lib0、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM；

第三組(Lib0+鄰苯二酚)：將Lib0、阿拉伯糖、鄰苯二酚和LB液體培養基混勻，得到反應體系；阿拉伯糖在反應體系中的濃度為1mM，鄰苯二酚在反應體系中的濃度為1mM。

(2)流式細胞儀篩選

將上述各組菌液稀釋至流式細胞儀可測範圍104-105cfu/mL。首先調試流式細胞儀，再用校準好的儀器進行樣品分析，分選實驗。主要依據以下原則進行篩選：首先不加誘導劑，去除Lib0-本底表達產生的螢光信號較強的10％，分選得到的細胞作為Lib0+；再次轉接處理，分選誘導產生的強螢光信號細胞部分的1％，標註為Lib1；此為一輪篩選。依次類推，進行五輪陰陽性篩選後，純化出單克隆子進行潛在突變體功能驗證。

突變體文庫第五輪螢光信號值結果如圖7所示：其中，C-lib5-為第二組菌液經過5輪誘導後得到的菌株，C-lib5+為第三組菌液經過5輪誘導後得到的菌株，結果表明：鄰苯二酚作為誘導物誘導突變體文庫，隨著誘導代數的遞增，突變體文庫中受誘導劑誘導的陽性細胞比例逐代提升。

3、潛在正向突變體篩選

將第五輪分選得到的細胞C-Lib5+抗性平板內塗布，純化出鄰苯二酚誘導單克隆子18株，將純化得到的單克隆子轉接處理，先進行螢光信號值初步篩選，選取相對螢光值高於WT的克隆子。

克隆子的螢光值分析結果如圖8所示：從圖8A可看，樣品C5-16、C5-18、C5-5及C5-15的螢光信號比值高於WT；從圖8B可看，正向突變體只有C5-5和C5-15，但是C5-5的螢光信號比值及除去本底螢光信號值的螢光強度均好於C5-15。因此選取C5-5作為正向突變體，將其命名為突變體C5-5並對其進行測序。

測序結果表明：突變體C5-5的DntR基因序列如序列表中序列3所示，將序列3所示的基因命名為DntR-c5-5基因，DntR-c5-5基因編碼的蛋白的胺基酸序列如序列表中序列4所示，將其命名為DNTR-C5-5。DNTR-C5-5蛋白的胺基酸序列為將序列2所示的DNTR蛋白的第151位胺基酸由L突變為I，第153位胺基酸由L突變為P，第206位胺基酸由H突變為T，第230位胺基酸由I突變為T後得到的序列。

DntR-c5-5基因的核苷酸序列為將序列1所示的DntR基因的第451位由T突變為A，第453位由G突變為C，第457位由C突變為T，第459位由T突變為C，第575位由C突變為G，第616位由C突變為A，第617位由A突變為C，第618位由C突變為G，第689位由T突變為C，第690位由T突變為C後，且保持序列1的其他序列不變得到的序列。

三、突變菌株C5-5

本實施例中的突變體C5-5也可將DntR-c5-5基因和GFP基因導入BW25113菌株 中，且保持BW25113菌株基因組的其他序列不變獲得。

DntR-c5-5基因和GFP基因是通過重組載體pDntR』導入BW25113菌株；

重組質粒pDntR』為將序列7所示的DNA分子插入含有GFP基因的pRk載體的NdeI和NcoI酶切位點間，且保持pRk載體的其他序列不變，得到的載體。

重組質粒pDntR』為將重組質粒pDntR中的DntR基因的第451位由T突變為A，第453位由G突變為C，第457位由C突變為T，第459位由T突變為C，第575位由C突變為G，第616位由C突變為A，第617位由A突變為C，第618位由C突變為G，第689位由T突變為C，第690位由T突變為C，且保持其他序列不變得到的質粒。

野生型菌株WT為將DntR基因和GFP基因導入BW25113菌株得到重組菌。

DntR基因和GFP基因是通過重組載體pDntR導入BW25113菌株；

重組質粒pDntR為將序列6所示的DNA分子插入含有GFP基因的pRk載體的NdeI和NcoI酶切位點間，且保持pRk載體的其他序列不變，得到的載體。

實施例2、DntR-c5-5基因在鄰苯二酚誘導下促進目的基因表達中的應用

本實施例中的突變體C5-5為實施例1的三中獲得的突變體。

本實施例中的Lib0為實施例1中的步驟一的3中的(5)製備的克隆數目至106的富集突變體文庫。

本實施例中的WT為實施例1的三中獲得的野生型菌株WT。

1、分組

將突變體C5-5、WT和Lib0分別於抗性培養基(50μg/mL Kan)中進行活化，然後分別將活化後的突變體C5-5、WT和Lib0按照體積比為1％的比例轉接至新鮮LB液體培養基(50μg/mL Kan)，再加入誘導劑，按照誘導劑的不同分為如下6組：

A、將突變體C5-5、鄰苯二酚、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

B、將WT、鄰苯二酚、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

C、將Lib0、鄰苯二酚、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

D、將突變體C5-5、水楊酸、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

E、將WT、水楊酸、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

F、將Lib0、水楊酸、阿拉伯糖和LB液體培養基混勻，得到反應體系；

上述各反應體系均以無水乙醇為對照處理；其中誘導劑濃度為0、10μM、200μM、500μM、1000μM五個梯度，阿拉伯糖在反應體系中的濃度均為1μM。一式三個平行，37℃，220rpm培養10小時，分別得到培養物。

2、螢光信號值檢測

分別取出培養物，各取200μL菌液檢測OD600下吸光值，保證菌液濃度一致的原則下，取OD600值等同的菌液，12000rpm離心10min，去乾淨上清，取1mLPBS重懸菌體，再次離心，去上清，加入2mL已過濾的PBS，待檢測螢光強度。將不同處理的樣品，各取200μL加入螢光酶標板內，激發波長488nm，發射波長530nm，Gain值60的條件下，使用TECAN酶標儀檢測螢光信號值並計算誘導倍數。誘導倍數＝添加誘導物的螢光信號值/未添加誘導物的螢光信號值。

螢光信號值的檢測結果如圖9所示：在鄰苯二酚誘導下，與導入未突變蛋白DNTR的野生型菌(WT)相比，導入突變蛋白DNTR-C5-5蛋白的突變體C5-5中GFP表達量提高，表明突變體C5-5對鄰苯二酚的誘導倍數明顯高於WT和Lib0，因此，與未突變蛋白DNTR相比，突變蛋白DNTR-C5-5蛋白在鄰苯二酚誘導可以促進下遊基因GFP的表達。

從圖9來看，誘導劑為鄰苯二酚，濃度低至10μM時，樣品WT、Lib0和C5-5的靈敏度接近1.0，其中突變體C5-5略高於WT及Lib0，由此可見突變體C5-5響應鄰苯二酚的最低濃度為10μM；當鄰苯二酚濃度為500μM時，誘導倍數達到最大，且高於WT將近1.6倍。