重組人g-csf的改進的加工的製作方法

2023-04-29 23:01:51

專利名稱：重組人g-csf的改進的加工的製作方法
重組人G-CSF的改進的加工
背景技術：
G-CSF是一個20kDa的糖蛋白，該糖蛋白由兩個鏈內的二硫鍵穩定，含有單個氧-連接的碳水化合物部分(carbohydrate moiety)。成熟的G-CSF有174個胺基酸。G-CSF 是由骨髓細胞、巨噬細胞和成纖維細胞合成的。它的主要功能是作為中性粒細胞及其前體細胞的生長和分化因子。現有技術中還已知G-CSF活化成熟的中性粒細胞。此外，它刺激其它多種造血祖細胞的生長/分化(與另外的造血生長因子協同作用)並促進內皮細胞的增殖和遷移。在臨床上，G-CSF被用於治療中性粒細胞水平上的缺陷(例如，由癌症/化療、 AIDS或骨髓移植導致的中性粒細胞減少症)。

發明內容
為了使用與人相同的G-CSF治療中性粒細胞減少症患者，用編碼人野生型G-CSF 的質粒轉染人細胞。從所選克隆的細胞培養上清液中純化G-CSF後，觀察到大量的分泌的 G-CSF的N端被截短了 3個胺基酸。所述截短並不是克隆特異的，也不能通過改變細胞培養條件而消除。在上述觀察的基礎上，推斷出細胞中，特別是HEK293F細胞中的G-CSF前體蛋白的加工(processing)並不精確。具體地，可推斷出，為了在生理上去除所述信號肽，信號肽酶複合物並不只在預期的位點切割，該信號肽酶複合物還在另外一個位點進行切割，導致N 端的截短。令人驚訝地發現，如果使用了修飾的信號肽及相應的G-CSF前體，可以減少N端的截短。因此，在一個實施方式中，本發明提供包括信號肽和G-CSF肽的G-CSF前體，其中， 所述信號肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信號肽的序列(SEQ ID NO :4)，且該序列具有至少以下突變之一-Glu29 的刪除，-Glu26 的插入，-LysllLeu 的取代，-His2IPhe 的取代，以及-Glu28Leu 的取代。在一個優選的實施方式中，所述G-CSF前體具有至少2個、或至少3個、或至少4 個、或所有5個上述突變。在本發明另一個實施方式中，所述G-CSF前體至多可以具有另外3個突變，所述突變選自插入、刪除及取代。本發明另一個實施方式是編碼本發明的G-CSF前體的多核苷酸，以及與上述多核苷酸互補的多核苷酸。本發明另一個實施方式是包括本發明的多核苷酸的載體，以及含有本發明的多核苷酸或本發明的載體的經轉染的細胞。
在一個優選的實施方式中，所述經轉染的細胞是真核細胞，優選是人細胞，更優選是HEK293細胞，更進一步優選是HEK293F細胞或HEK293F衍生細胞(HEK293F derived cell)0在一個實施方式中，所述轉染是瞬時的，在另一個實施方式中，所述轉染是穩定的。本發明另一個實施方式是表達G-CSF的方法，該方法包括以下步驟-在合適的培養基中，培養本發明的經轉染的細胞；-從所述培養基中分離G-CSF。在一個優選的實施方式中，在pH為6. 8-7. 5、優選為7. 1-7. 3、更優選為7. 2左右的條件下進行所述培養。優選在培養過程中控制所述PH。在另一個實施方式中，在胰島素濃度為5-25mg/ml、優選為15_25mg/ml、更優選為 15-20mg/ml的條件下進行所述培養。令人驚訝地，採用本發明的修飾的信號肽，所產生的G-CSF的截短比率極小，優選低於分子的5%，更優選低於總G-CSF的1%。被認為是檢測限。優選地，所述培養基不含血清。大部分G-CSF的糖基化類型沒有改變，且活性與野生型G-CSF的活性相同。因此，本發明的方法產生了高度適於製藥應用的G-CSF。


圖1顯示了用TargetP程序對具有野生型信號肽的人野生型G-CSF的分析。圖2顯示了用TargetP程序對具有SP9信號肽的人野生型G-CSF的分析。圖3顯示了用TargetP程序對具有SPlO信號肽的人野生型G-CSF的分析。圖4顯示了採用構建體的HEK293F細胞中成熟G-CSF蛋白的表達，所述構建體分別編碼具有野生型信號肽(表達水平是100% )、SP9信號肽或SPlO信號肽的前體蛋白。圖5顯示了具有SP9信號肽的人野生型G-CSF的氨基末端胺基酸測序(Edman降解法)的色譜圖。圖如-如對應於殘基1-5。下面的表格中給出了所述胺基酸序列分析的總結ο圖6顯示了具有SPlO信號肽的人野生型G-CSF的氨基末端胺基酸測序(Edman降解法)的色譜圖。對應於殘基1-5。下面的表格中給出了所述胺基酸序列分析的
總結O圖7顯示了格拉諾賽特(GRAN0CYTE)的氨基末端胺基酸測序(Edman降解法)的色譜圖。圖6a_6e對應於殘基1-5。下面的表格中給出了所述胺基酸序列分析的總結。圖8顯示了具有野生型信號肽的人野生型G-CSF的氨基末端胺基酸測序(Edman 降解法)的色譜圖。圖7a_7e對應於殘基1-5。下面的表格中給出了所述胺基酸序列分析的總結。圖9顯示了從用G-CSF SP9穩定轉染的克隆分離中得到的兩個示例性的克隆中全長G-CSF的比率的比較。所述剩餘的非全長片斷主要包括N端被截短3個胺基酸的G-CSF。 全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短彡相關，這是該分析的檢測下限。圖10顯示了在攪拌釜反應器中，用不同培養pH培養的克隆1的實施例中全長
4G-CSF的比率的比較。克隆1從用G-CSF SP9載體穩定轉染的克隆分離中得到。所述剩餘的非全長片斷主要包括N端被截短3個胺基酸的G-CSF。搖瓶中的克隆1的參比培養(沒有控制pH)中的全長G-CSF的比率表示於第一個灰色的棒中。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短< 相關，這是該分析的檢測下限。圖11顯示了在攪拌釜反應器中，用不同培養pH培養的克隆2的實施例中全長 G-CSF的比率的比較。克隆2從用G-CSF SP9載體穩定轉染的克隆分離中得到。所述剩餘的非全長片斷主要包括N端被截短3個胺基酸的G-CSF。搖瓶中的克隆2的參比培養(沒有控制pH)中的全長G-CSF的比率表示於第一個灰色的棒中。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短< 相關，這是該分析的檢測下限。圖12顯示了具有不同胰島素濃度的培養基中，克隆2的實施例中全長G-CSF的比率的比較。克隆2從用G-CSF SP9載體穩定轉染的克隆分離中得到。所述剩餘的非全長片斷主要包括N端被截短3個胺基酸的G-CSF。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短< 相關，這是該分析的檢測下限。圖13顯示了在大規模的高細胞密度模式下培養、並在不同時間採集的克隆2的實施例中全長G-CSF的比率的比較，其中，培養基中含15mg/L的胰島素，沒有控制pH。克隆2 從用G-CSF SP9載體穩定轉染的克隆分離中得到。所述剩餘的非全長片斷主要包括N端被截短3個胺基酸的G-CSF。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短彡相關，這是該分析的檢測下限。
實施例實施例1為了正確的蛋白加工，對所述G-CSF前體肽進行的優化所述野生型的人G-CSF的亞型b的cDNA已在GenBank資料庫中公開(NM_172219)。 基本上，具有任何源自NM_172219的序列的任何G-CSF前體蛋白都可用於本發明的信號肽序列的修飾。在一個示例性的實施方式中，所述前體蛋白具有下文所示的如SEQ ID NO 1 (GenBank NP_757373)的序列MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP未加工的野生型G-CSF前體蛋白(SEQ ID NO :1)包括204個胺基酸，其中包括 30個胺基酸的信號肽。已經公開了所述加工是發生於Ala30和Thr31殘基之間(GenBank NP_757373)。最近的文獻記載了所述真核生物的信號肽的共有序列及信號肽酶複合物的功能 (Rapoport,2007, Nature 450(29),663-669 ；Tuteja,2005, Arch Biochem Biophys 441, 107-111 ;Dalbey 等，1997，Protein Science 6,1129-1138)。將G-CSF信號肽的胺基酸序列與上述提出的共有信號肽的特徵進行比較。發現有若干胺基酸殘基與所提出的模型不符。具體地，所提出的位於信號肽C-末端的Ala-X-Ala 基序被存在於G-CSF前體肽中的、帶電荷的胺基酸(Glu29)阻斷，而所述基序被認為是精確切割的關鍵。此外，所述帶電荷的殘基Lysll及His21位於該信號肽的疏水區，因而與該模型的要求不一致。用 SignalP 禾口 TargetP 軟體(www. cbs. dtu. dk/services ； Emanue Is son 2007, Nature Protocols 2，953-971)對所述野生型的G-CSF信號肽進行了計算機模擬(in silico)分析。所述軟體顯示，預測加工會發生在正確的G-CSF的N端(Thrfl)，但還會發生在其它幾個位點(圖1)。然而，該軟體並未預測到在截短位點(Gly34)處的加工。實施例2根據上述假定的信號肽酶模型，用計算機模擬所述野生型的G-CSF信號肽的模型，其中，對該信號肽的胺基酸序列進行了最低限度的改變。再次用SignalP和TargetP軟體分析所得切割位點。計算機模擬的少數模型，如稱為SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的模型中，預測到G-CSF的加工僅發生在正確的位點(Thrfl)，而這可以認為是潛在的優化的信號肽(SP9 G-CSF及SPlO G-CSF切割位點的計算機模擬分析分別參見圖2及圖3)。一些這樣的構建體被選中用於基因合成(GeneArt，Regensburg，德國)。所述合成的、分別編碼SP9 G-CSF和SPlO G-CSF肽的基因被克隆至真核表達載體中，用於轉染HEK293F細胞。實施例3SP9 G-CSF 前體蛋白所述SP9 G-CSF前體蛋白產生於野生型的人G-CSF前體蛋白(SEQ ID N0:1)的信號肽序列。具體地，野生型信號肽在四位的穀氨酸(Glu29)被去除並插入到沈位(Glu26)。 在一個示例性的實施方式中，所述SP9G-CSF前體蛋白具有下文所示的、如SEQ ID NO 2的序列MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWETVQATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP實施例4SPlO G-CSF 前體蛋白所述SPlO G-CSF前體蛋白產生於野生型的人G-CSF前體蛋白(SEQ ID NO 1)的信號肽序列。具體地，通過將11位的賴氨酸取代為亮氨酸(LysllLeu)、將組氨酸21取代為苯丙氨酸(His21Phe)、將穀氨醯胺觀取代為亮氨酸(Gli^SLeu)。在一個示例性的實施方式中，所述SPlO G-CSF肽具有下文所示的、如SEQ ID NO 3的序列MAGPATQSPMLLMALQLLLWFSALWTVLEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP必須注意到，儘管信號肽有所改變，成熟的G-CSF肽保持了野生型(SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3，31-204 位的殘基)。實施例5用編碼SP9 G-CSF及SPlO G-CSCF的表達載體進行的瞬時轉染分別用編碼SP9 G-CSF或SPlO G-CSF的表達載體瞬時轉染HEK293F細胞。3天後收集上清液。用ELISA測定G-CSF的分泌。數據顯示，其表達水平與具有野生型信號肽的 G-CSF相當，或甚至具有更高的表達水平(圖4)。將G-CSF純化至高純度。採用與野生型G-CSF相同的方案而不對方案作任何改變，分別對兩種產物SP9 G-CSF及SPlO G-CSF進行純化。實施例6用Edman降解法(TopLab，Martinsried，德國)測定野生型G-CSF、商品化的產品格拉諾賽特(Chugai的專利CA1341389，產生於CHO細胞中的G-CSF)、SP9 G-CSF及SPlO G-CSF的氨基末端序列。令人驚訝地是，兩個表達產物SP9 G-CSF及SPlO G-CSF的數據顯示出僅有正確的N端而沒有任何截短(圖5和圖6)。格拉諾賽特中也觀察到相同的結果 (圖7)。與此相反，儘管用SignalP或TargetP進行計算機模擬預測的結果是僅有一個切割位點(數據未給出)，具有野生型信號肽的G-CSF以及其它幾種設計的構建體中，觀察到了所述截短(圖8)。實施例7用細胞增殖測定法來測定SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的活性，並將其活性與格拉諾賽特的活性進行比較。SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的細胞增殖活性優于格拉諾賽特的活性。實施例8GluC消化後，用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI T0F)肽質量指紋譜分析測定SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的糖基化。反射譜顯示，HEK293F細胞中產生的SP9 G-CSF或SPlO G-CSF與野生型G-CSF相比沒有任何差別。實施例9對用編碼SP9 G-CSF的表達載體進行穩定轉染所得克隆的評估用編碼SP9 G-CSF的表達載體穩定轉染HEK293F細胞。轉染穩定後，分離同種克隆(homogeneous clones) 0在不同的發酵規模下分析所選克隆的上清液。為實現該目的， 從採集的上清液中，將G-CSF純化至高純度，並針對它們的氨基末端序列、糖基化類型及活性進行評估。觀察到，儘管由SP9 G-CSF得到的上清液中並未觀察到N端3個胺基酸的截短(所述上清液是從瞬時轉染庫(pool)分析所得)，但對於某些克隆，並不能完全抑制所述3個胺基酸的截短。該效應是克隆依賴性的，且進一步依賴於培養規模和培養條件。所述克隆依賴性(圖9)暗示了 G-CSF信號肽序列的修飾導致所述SP9 G-CSF載體在很大程度上支持所述信號肽的正確切割；儘管100%的正確切割仍受制於克隆的特異性代謝。幹預克隆特異性代謝的主要手段是優化培養條件的應用。用2個示例性的克隆來評估培養pH對G-CSF信號肽序列正確切割的影響。在實驗室規模的攪拌釜反應器中培養這2個克隆，各反應器確定的pH值為6. 6、6. 8、7. 0及7. 2。將含有G-CSF的上清液純化至高純度，並針對它們的氨基末端序列進行評估(圖10和圖11)。 對於兩個示例性的克隆，都觀察到通過將G-CSF克隆的細胞培養的pH控制在7. 2，可以實現所述信號肽序列的正確加工，所述信號肽序列的正確加工使全長G-CSF的比率> 99%。所述> 99%的值與測序方法的檢測下限為相符。實施例10在一個克隆的實施例中完成不控制pH及培養基中含不同濃度胰島素的搖瓶培養。所述胰島素濃度在5mg/L胰島素到20mg/L胰島素的範圍內變化。將含有G-CSF的上清液純化至高純度，並針對它們的氨基末端序列進行評估(圖12)。在所評估的克隆的實施例中，可以觀察到，在不控制pH的培養條件下，將培養基中的胰島素濃度優化至15-20mg/L 胰島素的範圍內，可引起所述信號肽序列的正確加工。 在一個克隆的實施例中，完成利用灌流模式供應培養基的大規模的高細胞密度培養。不控制所述培養的PH，培養過程中，該pH在6. 8到7. 2之間變化。培養基中的胰島素濃度被調節至優化的濃度(15mg/L胰島素)。將來自挑選出的4個培養時間點的含有G-CSF 的上清液純化至高純度，所述時間點為培養的第6、7、17及21天，並針對它們的氨基末端序列進行評估(圖13)。所有經分析的上清液中都實現了所述信號肽序列的正確加工，使得全長G-CSF的比率> 99%，而該現象與細胞密度和G-CSF的產率無關。因而，優化的胰島素濃度(15mg/L)的應用對於避免大規模的高細胞密度培養中的N端截短十分有效。
權利要求
1.一種包括信號肽和G-CSF肽的G-CSF前體，其中，所述信號肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信號肽的序列，所述序列具有至少以下突變之一-Glu29的刪除， -Glu26的插入， -LysllLeu 的取代， -His2IPhe的取代，以及 -Glu28Leu 的取代。
2.如權利要求1所述的G-CSF前體，其中，所述G-CSF前體具有至少2個、或至少3個、 或至少4個、或所有5個權利要求1所述的突變。
3.如權利要求1或2所述的G-CSF前體，其中，所述G-CSF前體在所述信號肽中至多具有另外3個突變，所述突變選自插入、刪除及取代。
4.一種編碼權利要求1-3任一項所述的G-CSF前體的多核苷酸。
5.一種與權利要求4所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
6.一種包括權利要求4或5所述的多核苷酸的載體。
7.一種含有權利要求4或5所述的多核苷酸、或權利要求6所述的載體的經轉染的細胞。
8.如權利要求7所述的經轉染的細胞，其中，所述經轉染的細胞是真核細胞，優選是人細胞，更優選是HEK293細胞，更進一步優選是HEK293F細胞。
9.如權利要求7或8所述的經轉染的細胞，其中，所述轉染是瞬時的。
10.如權利要求7或8所述的經轉染的細胞，其中，所述轉染是穩定的。
11.一種表達G-CSF的方法，所述方法包括以下步驟-在合適的培養基中，培養權利要求7-10任一項所述的經轉染的細胞； -從所述培養基中分離G-CSF。
12.如權利要求11所述的方法，其中，在pH為6.8-7. 5、優選為7. 1-7. 3的範圍內進行所述培養。
13.如權利要求11或12所述的方法，其中，在胰島素濃度為5-25mg/ml、優選為 15-25mg/ml、更優選為15-20mg/ml的範圍內進行所述培養。
14.如權利要求11-13任一項所述的方法，其中，所述培養基不含血清。
全文摘要
一種包括信號肽和G-CSF肽的G-CSF前體，其中，所述信號肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信號肽的序列，且該序列具有至少以下突變之一Glu29的刪除、Glu26的插入、Lys11Leu的取代、His21Phe的取代，以及Glu28Leu的取代。
文檔編號C07K14/535GK102164955SQ200980137913
公開日2011年8月24日 申請日期2009年10月2日 優先權日2008年10月2日
發明者伊莉莎白·卡薩特蒙特, 卡羅拉·施洛德, 彼得·索勒曼尼, 麥可·萊納爾 申請人:奧克塔法馬生物製藥股份有限公司