通過色譜分離製備(6s)葉酸衍生物的工業方法
2023-04-30 10:25:51 1
專利名稱：通過色譜分離製備(6s)葉酸衍生物的工業方法
技術領域：
本發明涉及一種通過在柱上，用色譜方法分離非對映異構體混合物來製備(6S)葉酸衍生物的工業方法，特別地涉及一種製備這裡分別稱為「MTHF」和「FTHF」的5-(甲基)-(6S)-四氫葉酸和5-(甲醯)-(6S)-四氫葉酸的工業方法。MTHF和FTHF是生理大分子，它們連同不穩定的6，10-亞甲基-四氫葉酸和四氫葉酸，構成了活體內葉酸的活性形式，通常稱為葉酸共因子。
從藥物學的觀點來看，MTHF和FTHF可用於各種形式的葉酸鹽缺乏症，作為通常的肝保護劑，更近一些時期以來，用於抗腫瘤藥物。
MTHF和FIHF以及常用的藥物學上可接受的衍生物用下式
其中X＝CH3或CHO和R1和R2是H，NH+4，鹼金屬和鹼土金屬，R1和R2可以彼此相同或彼此不同。
具有式(Ⅰ)的化合物含有兩個不對稱的碳原子，因此可以四種非對稱異構體形式存在。
眾所周知，通常當存在立體異構體的藥物形式時，它們中只有一種是活性的，另一些則是非活性的，甚至是有害的。在本發明中，眾所周知的活性形式是(6S)。
進行了一些研究，涉及工業上製備和/或分離兩種非對稱異構體，以及直接合成(6S)形式。
由於最終產品的結構脆弱性，立體定向合成MTHF和FTHF的(6S)形式，以及分離兩種(6R，S)非對稱異構體顯露出困難。
在GB-A-1，572，138專利和CH-A-496，012專利中，分別描述了MTHF和FTHF的立體異構混合物的合成。
為了分離如此獲得的(6S)非對稱異構體，有可能將立體異構體轉變為相應的5-甲氧羰基衍生物或者轉變成為其它的具有手性中心的衍生物以這樣一種方式，利用在適宜的溶劑中的不同的溶解度，有可能將兩種非對映異構體(6R)和(6S)分開(JCS，CHEMCOMM470，1987;EP0266042)。
但是所說的方法有點複雜，而且產率極低。
另一種分離的方法基於，或者(6R，S)混合物(EP0，367，902;WO8808，844)或者它們的中間體(EP348，841)的多重結晶，但產率總是很低。
近來，通過部份結晶和任選地水解或減少5，10-亞甲基-(6R，S)四氫葉酸中間體，獲得了MTHF和FTHF的立體異構體混合的的分離(US5006655)。該中間體難於處理，並且使其與有害有毒的溶劑如甲酸相隔離。
一種用於分離(6S)形式的方法公開在PCT/EP88/00341(WO88/08844)上，其中立體異構體混合物的鈣鹽或鎂鹽的溶液用一種胺來處理，陽離子鹽作為草酸鹽發生沉澱，並且通過部分結晶化和再轉化成為鈣鹽或鎂鹽而得到所要求的產品。
表現的產率相當低，並且該方法涉及幾個成鹽和結晶步驟。
在一個進一步的分離工藝中，加入外消旋的混合物，如鈣鹽(EP367，902)，連同一些有機和無機鹽，特別是碘化鈉，於是獲得一種產品，其純度很高，但是產率又相當差，這從工業的觀點來看確實是無意義的。
有關分離FTHF異構體的進一步的方法，參見Choi等人的，Analytical Biochem.Vol.168，pp398-404(1968)，按照Choi等人的文章，使用了牛血清白蛋白〔Bovin Serum Albumin(BAS)〕與矽膠相混合的柱。
至於洗脫，使用了磷酸鹽緩衝液，其pH值在6.4和8.4之間，優選的是7.4。
按照Choi等人的方法所得到的洗脫液，含有極低量的(6S)異構體，僅對分析目的有用。
Choi等人的方法用於工業條件下，由於溶解差，結果進入柱的溶液會停留時間很長於是工業生產率會很低，因為必需極長時間地使用柱，以獲得可接受的分離，或者另一方面，使得溶液在同一柱中經歷幾個循環，這就導致混合物降解的可能性增加，並且試劑的消耗量很大。
令人驚奇地發現，根據本發明，沿用Choi等人的技術，但是對(6R，S)混合物的洗脫來說，使用pH值範圍極窄(在5.0和5.5之間)的緩衝溶液，可獲得具有工業產率的(6S)異構體的溶解，成本低廉，步驟簡單。
的確，如果使用兩個用白蛋白混合矽膠的工業柱，分別按照Choi等人的方法和本發明的方法來溶解(6R，S)混合物，則所獲得的(6S)異構體的產率分別是低於5%，和不低於20%。
除了從(6R，S)混合物中分離(6S)異構體的上述方法之外，還努力直接合成(6S)異構體。
按照EP-A-356，984專利，(6S)異構體的合成採用一種方法，基於7，8-二氫葉酸的5-6雙鍵的立體定向氫化作用。
當在NADP的存在下，用二氫葉酸鹽(dihydrogolate)還原酶進行所說的氫化作用時，獲得很好的轉化，但是所說的方法很複雜，從工業的觀點上來看，根本沒有用。
已嘗試了其它種類的立體定向氫化作用，其中使用合適的催化劑，但是結果總是很差。(TETRAHEDRON42，117，1986)最後，迄今無價廉的方法，可以工業的規模獲得MTHF和FTHF的(6S)異構體。至於實用的藥物學用途，(6S)MTHF和(6S)FTHF並不用其本身，通常用其鈣鹽。
按照眾所周知的技術，進行這樣的轉變，例如按照US-A-2，688，018專利所公開的方法，以及Weast所著的「Handbook of Chemistry and Physics」(第57版，B-100頁)。
通過一種方法，將(6R，S)MTHF或(6R，S)FTHF的混合物分開成為分別的(6S)異構體，按照該方法，在一個色譜柱中，裝入白蛋白水溶液，然後用第一緩衝溶液進行洗滌，裝入式(Ⅰ)的衍生物的非對映異構體混合物的水溶液，然後用第二緩衝溶液進行洗脫，從而得到(6S)非對映異構體，第一次洗脫得到FTHF，以及第二次洗脫得到MTHF，其特徵在於它的溶液中的白蛋白的濃度在0.1%(wt)至10%(wt)之間，以及其衍生物溶液的濃度在0.1%(wt)至10%(wt)之間，所說的緩衝溶液的pH值在4.8至5.8之間。
更優選地，白蛋白和非對映異構體混合物的水溶液，用pH值在4.8和5.8之間的緩衝溶液洗滌。
進一步優選地，矽膠的顆粒度在25μm和60μm之間，在35μm之間較好。
有利的是，所說的緩衝溶液是磷酸鹽緩衝溶液，其濃度在0.05M和0.15M之間，它的水溶液中的所說的白蛋白的濃度為大約1%(wt)，以及在其溶液中的一種非對映異構體混合物為大約5%(wt)，而白蛋白選自由豬肉，牛肉，綿羊肉，兔肉，雞網和雞蛋白蛋白所組成的組。
顯然，按照本發明的方法，各階段中所用的緩衝溶液可以彼此相同，也可以彼此不同。可用作緩衝溶液的有鄰苯二甲酸鹽(phthalate)，磷酸鹽，乙酸鹽等等，優選的是磷酸鹽。
根據一種優選的方法，使用0.05M的磷酸鹽緩衝溶液來洗脫色譜柱，其中事先裝入(6R，S)-甲基-四氫葉酸，鈣鹽。對(6R，S)甲醯基-四氫葉酸，鈣鹽的情形，裝入0.15M的磷酸鹽緩衝溶液。
最後，根據本發明，有可能將分離方法的生產率提高至工業水平，進行洗脫的時間被縮短。
下面參照優選實施例詳細地描述本發明，應該理解，本發明並不為這些特殊的實施例所限制。
在下面實施例中所提到的產率用一個重量值來表達，這裡它相應於一個光學產率(optical yield)。
實施例1一個工業柱，直徑為0.90m，高為6.0m，其中裝有矽膠，矽膠顆粒直徑為35/45μm，懸浮在含有0.1%(wt)巰基乙醇的，pH值為5的0.15M的緩衝溶液中，直至幾乎完全填滿(5.5m的高度等於大約3600g矽膠的體積)。
手性物質的製備按下列方式進行在洗脫液中出現280nm的UV吸收後，將蛋清白蛋白溶液(含量為1%，在0.15M的磷酸鹽緩衝溶液中，pH值為5.0)裝入該柱中。在矽膠上吸收的白蛋白的量等於200/400kg。用1000l的0.15M的pH值為5.0的磷酸鹽緩衝溶液洗脫，再用1000l的0.15M的pH值為7.0的磷酸鹽緩衝溶液衍脫，最後用10000l的0.15M的pH值為5.0的磷酸鹽緩衝溶液洗脫。然後加入5kg的，流速為200/400l/h的5%的5-甲醯-(6R，S)四氫葉酸鈣溶液。再用0.15M的pH值為5.0的磷酸鹽緩衝溶液洗脫。收集500l份。
(6S)部份先於(6R)部份洗脫出。洗脫部分可以用裝有流動孔(flowing cell)的偏光計來線性控制，然後用HPLC精確地測定劑量。分離出足夠純的部份以用於所需目的。收集純的部份，並用公知方法鹽化。
產率1.9kg(28%)的(6S)葉酸鹽滴定度HPLC＞98%光學純度＞97%實施例2在本實施例中，以工業規模再現了Choi等人的方法。
使用了相同的柱，以及製備靜止相的相同的方法，所用方法如實施例1。
用1000l的0.15M的pH值為7的磷酸鹽緩衝溶液進行洗脫。向柱中加入大約5kg的，流速為200/400l/h的5%的(6R，S)葉酸鈣溶液。用pH值為7的磷酸鈣緩衝溶液進行洗脫。收集500l部份。
分離不令人滿意;純化循環重複四次，以試圖獲得部份分離。
因分離不佳而放棄原文。
實施例3使用了與實施例1相同的柱，以及製備靜止相的相同的方法，但這裡使用豬血清白蛋白(PSA)。
產率1.5g(30%)的(6S)葉酸鈣HPLC滴定度＞98%光學純度＞97%實施例4使用了與實施例1相同種類的柱，但是這裡使用脫氣水用於製備靜止相，以及吸收和洗脫的下一個相。
用10000l的pH值為5.2的0.05M的磷酸鹽緩衝溶液進行洗脫，加入10kg的，流速為200/400l/h的5%的(6S)-甲基-四氫葉酸溶液，再用pH值為5.2的0.05M的磷酸鹽緩衝溶液進行洗脫，收集500l部份。
(6S)部份光於(6R)部份洗脫出。分離出足夠純的部份以用於所需目的，用公知方法收集並處理之。
產率3.9kg(39%)的(6S)甲基四氫葉酸鈣HPLC滴定度＞97%光學純度＞97%
權利要求
1.一種通過在色譜柱上，用色譜方法分離式(Ⅰ)的葉酸衍生物的(6R，S)非對映異構體混合物來製備(6S)異構體的工業方法
其中X=CH3或CHO以及R1和R2是H，NH+4，鹼金屬和鹼土金屬，R1和R2可以彼此相同或彼此不同；其中在一個色譜柱中，裝入白蛋白的水溶液，然後用第一緩衝溶液進行洗滌，裝入式(Ⅰ)的衍生物的非對映異構體混合物的水溶液，然後用第二緩衝溶液進行洗脫，從而得到(6S)非對映異構體，第一次洗脫得到FTHF，以及第二次洗脫得到MTHF，其特徵在於它的溶液中的白蛋白的濃度在0.1%(wt)和10%(wt)之間，以及其衍生物溶液的濃度在0.1%(wt)和10%(wt)之間，所說的緩衝溶液的pH值在4.8至5.8之間。
2.按照權利要求1的方法，其特徵在於，在裝入式(Ⅰ)的衍生物的非對映異構體混合物之前，先用pH值為7的緩衝溶液洗滌柱，再用pH值為5的緩衝溶液洗滌柱。
3.按照權利要求1和2的方法，其特徵在於，所說的緩衝溶液是磷酸鹽緩衝溶液，其濃度在0.05M至0.15M之間。
4.按照權利要求1至3的方法，其特徵在於，所說的色譜柱中裝有矽膠，其顆粒度在25μm和60μm之間。
5.按照權利要求4的方法，其特徵在於，矽膠的顆粒度在35μm和45μm之間。
6.按照權利要求1至5的方法，其特徵在於，它的水溶液中的所說的白蛋白的濃度為大約1%(wt)，以及一種所說的非對映異構體混合物為大約5%(wt)。
7.按照權利要求1至6的方法，其特徵在於，所說的白蛋白選自由豬肉，牛肉，綿羊肉，兔肉，雞肉和雞蛋白蛋白所組成的組。
8.按照權利要求1至7的方法，其特徵在於，所說的白蛋白水溶液在pH值為4.8-5.8下進行緩衝。
9.按照權利要求1至7的方法，其特徵在於，所說的非對稱異構體混合物的所說的水溶液在pH值為4.8-5.8下進行緩衝。
全文摘要
一種通過在一個色譜柱上，色譜分離兩個(6R，S，)非對映異構體來製備(6S)葉酸衍生物的工業方法，其中分離劑是在pH為大約5的緩衝溶液中的白蛋白。
文檔編號B01D15/00GK1096785SQ9310728
公開日1994年12月28日 申請日期1993年6月19日 優先權日1993年6月1日
發明者L·安布羅斯尼, B·薩拉 申請人:阿爾巴諾化學工業股份公司