新穎的神經元營養因子的製作方法

2023-04-30 04:26:06

專利名稱:新穎的神經元營養因子的製作方法
本發明涉及一種從哺乳動物腦中，特別是從牛的尾狀核中分離出來的新的大分子神經元營養因子(SDNF)，並涉及一種製備該物質的方法。從化學觀點來看，純化的神經元營養因子是等電點大約為10的鹼性蛋白質，用十二烷基硫酸鈉SDS凝膠電泳測得其分子量大約與溶菌酶相同，也就是大約為14，400道爾頓。從生物學觀點來看，該分子能夠在體外培養液中促進神經系統神經細胞的存活。特別是那些中樞神經系統的神經細胞的存活。本發明的神經元營養因子的來源、化學及生物學特性與其它曾報導的被確認的大分子神經元營養因子是有區別的。另外，還確定了SDNF的藥物應用方法，該應用方法也構成了本發明的一部分。
神經元營養因子的定義及作用現在已經確定，在體內及體外哺乳動物細胞的生長及存活系受到一系列大多為蛋白質類或肽類的胞外類似激素的信號的調節，如所知的生長因子等的調節。從生物學上看，每一種生長因子作用在一組特殊的相應靶細胞。
對大分子蛋白生長因子的研究表明，在發育階段及成熟期促進哺乳動物細胞存活及神經元細胞生長的蛋白生長因子，目前對於神經生物學的研究相當有用。有人提出，在神經系統發育過程中，直接從體液及細胞微環境中分離出的存於體外的神經元營養因子，對於神經元細胞的生存及死亡起到調節作用(Cowan W.M.et al.，Science 2251258，1984)。事實上有些報導說，對於靶衍生的(target-derived)神經元營養因子的神經支配軸突之間生長的竟爭，在胚胎發生過程中決定了哪些神經元生存或哪些死亡。在成熟期，情況即使不完全相同，但也是類似的，有人提出神經元營養因子對於維持神經元細胞的生存及大腦正常功能聯繫是必不可少的。(Varon S.，Discussions in Neuroscience，vol.II，No.3，1985.)因而，神經細胞弱化或死亡(發生於外傷性損傷之後、或病理學過程，如發作或神經變性疾病，以及衰老)會引起體內神經元營養學因子的缺乏或受到抑制。(Varon S.，ibid;Appel S.H.，Ann.Neurol.10499，1981;Varon S.et al.，Dev.Neurosci.673，1984.).有些研究者提出，成年的哺乳動物神經元營養因子不單是在外圍神經系統也是在中樞神經系統損傷後的修復及再生過程的根源。的確，現代神經生物學技術在動物的中樞神經系統所作的移植及損傷實驗中的應用使人們增強了對成年哺乳動物中樞神經系統的修復是可能的這一信念，並且提供了獲得正確營養信號是有效的信息(Gage F.H.et al.，Nature 308637，1984).直至近日，唯一能很好地確定其特性的大分子蛋白神經元營養因子是神經生長因子(NGF)(Levi-Montalcini R.et al.，physiol.Rev.48534，1968;Levi-Montalcini R.，Ann.Rev.Neurosci.5341，1982)人們發現NGF在體內及體外，只能促進有限類型的哺乳動物神經元的存活，從而使人們相信NGF僅是一族大分子神經元營養因子(其中每種僅對確定類型的神經元存活起調節作用)中的一種。目前，另外僅有兩種大分子神經元營養因子被純化並且確定其特性，即為睫狀神經營養因子(CNTF)(Varon S.，Discussions in Neuroscience，vol.II，No.3，1985;Varon S.et al.，Dev.Neurosci.673，1984)及由腦中分離的神經元營養因子(BDNF)(Varon S.，Discussions in Ncuroscience，vol.II，No.3，1985;Barde Y.et al.，Embo J.1549，1982)
以下對這些因子的來源、化學特性及生物學活性作概要的說明。
神經元營養因子的生物測試體外神經細胞培養系統已被證實為對於組織提取物的神經元營養活性的研究及對於適用於分離或純化神經元營養因子的複雜手續進行的監測是基本的而又不可缺少的工具。有人作過演示表明，以單層有絲分裂後分離的(postmitotic)神經細胞培養物，置於體外合適的「限制性」培養條件之下時需要外部加入的營養補充物，並對之發生響應。因而，半提純或提純的原料製品的神經細胞營養活力的評價可以通過對體外神經元細胞存活的促進能力大小來加以測定。更進一步，對特定的神經元標記(例如神經元絲含量的分析或特定識別標記的分析)常常可用於對形態學判斷標準進行支持或確認。
確認神經元營養因子的特性如前所述，目前所確認的大分子神經元營養因子為神經生長因子(NGF)、睫狀神經元營養因子(CNTF)及從腦中分離的神經元營養因子(BDNF)。下面對這些因子的生物學來源、化學特性及生物學活性作分別的說明。
1，神經生長因子(NGF)來源NGF最初繫於鼠肉瘤性腫瘤中發現(Levi-Montalcini R.et al.，J.Exp.Zool.116321，1951)它從雄性鼠的下頜下唾液腺中分離得到勻質(Varon S.et al.，Biochemistry 62202，1967)，然後又從蛇毒中獲得(Angeletti R.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 65668，1970)。許多其它的相對富含NGF的來源也有報導，包括在豚鼠前列腺(Harper G.P.et al.，Nature 279160，1979)及人類胎盤(Goldstein L.D.et al.，Neurochem.Res.3175，1978)。據報導在其它組織中還存在有少量的NGF，這些組織包括哺乳動物中樞神經系統(Varon S.，Discussions in Ncuroscience，vol.II，No.3，1985;Hefti F.et al.，Neuroscience 1455，1985)。這些潛在的NGF來源及明顯的作用位點之間的生理學上的關係尚不很明了，但是人們普遍認為NGF是那些需要被對NGF發生響應的細胞進行神經支配的各種外圍組織分泌的。同樣還對由雄性鼠的下頜下腺體得到的NGF的順序進行測定並進行克隆。(Scott J.et al.，Nature 302538，1983;Ulrich A.et al.，Nature 303821，1983)人類β-NGF基團也被成功地進行了分離，並且進行了克隆。(Ulrich A.et al.，Nature 303821，1983;European Patent No.0121388).
化學特性對由鼠下頜下腺體獲得的NGF的特性了解得最為清楚。鼠腺體NGF為7S蛋白質複合體(分子量約為140，000道爾頓)，具有三個亞單位(α、β、γ)並包含Zn++。NGF的活力僅與亞單位β(即2.5 SNGF)，即系分子量大約為25，300道爾頓(在SDS凝膠電泳中顯示分子量大約為12，650道爾頓)，等電點大約為9.3的鹼性二聚蛋白質。來自於雄鼠下頜下腺體及人類來源(Provenience)或其它來源的β-NGF的順序已經有人作了報導。(Scott J.et al.，Nature 302538，1983;Ulrich A.et al.，Nature 303821，1983).
生物學活性來自鼠下頜下腺體的NGF已被用於體外及體內的關於NGF活性的絕大多數研究。
NGF體外生物學活性範圍的評定，對初級神經元細胞及在培養物的克隆細胞都作了測定。在體外對NGF發生響應的初級神經元細胞據報導包括位於背側根部神經節的胎感覺中樞神經元(胚胎期為8-12)，位於交感神經神經節的自主性釋放出去甲腎上腺素的(noradrenergic)胎兒神經細胞，位於間隔(septum)的膽鹼能的神經細胞及發育中的腎上腺嗜鉻性細胞。其中感覺中樞及交感神經的神經元依賴NGF而生存並發展，然而膽鹼能的神經細胞卻似乎不需依賴NGF而生存，然而僅僅為了它們的分化，也可說表型特徵在表達是與神經元傳遞體(neurotransmittor)緊密相聯繫的。在發育的初始階段在腎上腺嗜鉻性細胞(分離自神經嵴)中加入NGF可導致神經細胞表型的表達。在體外對NGF發生響應的克隆細胞據報導包括分離自神經嵴腫瘤的嗜鉻性腎上腺細胞，即為嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)及人類成神經細胞瘤細胞。當用NGF處理之後，這些細胞從一個高度增生的形式突轉成分裂後的神經細胞階段。
在體內對NGF發生響應的神經細胞據報導包括背測根部神經節的感覺中樞神經元，交感神經神經元及發生在發育階段和成年期發生損傷之後的中樞神經系統的膽鹼能神經元。對於後種情形，在大腦中施用NGF可促進神經元細胞的存活及表型特徵的表達。這些作用與損傷後引起的行為變化的改善有聯繫。
睫狀神經元營養因子(CNTF)來源CNTF最初從胚胎組織(E8)從小雞的(chicks′)眼睛包括脈絡膜及有色素的上皮的虹膜睫狀體中檢測到並提純。隨後，CNTF活性系通過一系列不同的組織提取物，包括成年大鼠坐骨神經及大鼠中樞神經系統傷液，來進行確定。
化學特性將由小雞(chick)胚胎眼內的組織提純的CNTF(按蛋白質表示為大約2×10-4，按營養活性表示為9%)用SDS凝膠電泳測定分子量為20，400道爾頓，等電點大約為5。分子量與淨負電荷都顯示CNTF明顯地與來自於鼠下頜下的蛋白β-NGF不同。對於來自小雞(chicks′)眼睛的CNTF的順序還無人報導，也還沒有將製備規模的CNTF從哺乳動物中分離純化的方法。
生物學活性生物學研究主要地用小雞(chicks′)眼睛的提取物，半提純或提純的CNTF製品，僅僅於體外進行。在體外，產生響應的神經元包括來源於胎雞(chicks)的睫狀神經節(E8)，來源於鼠背側根部神經節的新生期神經元，及來源於小雞(chick)E11神經節及大鼠新生期神經節的交感神經(sympathetic)神經元。據報導，這些活性都不能被抗鼠下頜下β-NGF的抗體所阻礙或抑制。CNTF在體內的作用尚未有人報導。
由腦中分離的神經元營養因子(BDNF)來源BDNF的活性在來自於C6大鼠克隆細胞系的控制條件的培養基上及在各種動物物種的腦提取物中進行研究。該因子已可從成年豬腦中被提純。
化學特性提純自成年豬腦的BDNF(產量以蛋白質表示為3.8×10-8，以營養活性表示低於5%)，是高度鹼性的多肽(p I等電點大於10.1)，用SDS-凝膠電泳測定分子量大約為12，300道爾頓。沒有文獻對該因子的順序進行了報導。BDNF分子及其提取手續由西德專利申請第DE3213963 AL號描述。
生物活性生物學活性的研究用豬腦提取原料，半提純及提純的BDNF製品僅僅在體外進行。實驗顯示，對來源於普拉西多氏盤(placode)的感覺中樞神經細胞及來源於神經嵴的感覺中樞袖經細胞的存活有促進作用，並且能夠促進軸突的長出及體外視網膜移出物的細胞存活(Turner J.E.，Develop.Brain Res.18251，1985;Turner J.E.，Develop.Brain Res.18265，1985)儘管其化學特性與β-NGF非常類似，但檢測不出有交叉免疫反應發生。另外，BDNF對於交感神經神經細胞無作用。對於BDNF體內作用還沒有人進行報導。
由哺乳動物腦中分離的新穎的神經元營養因子本發明涉及一種新穎的神經元營養因子(SDNF)，該因子分子量為14，400道爾頓，對於神經系統，特別是中樞神經系統的神經元有活性作用，本發明還涉及製備該因子的方法。
來源及純化方法本發明的新穎神經元營養因子可以根據以下的方法而獲得，以下的分離方法為構成本發明的一部分。所採用的方法具有的特徵為，將哺乳動物，特別是牛的腦子，最好將尾狀核在中性條件下打成勻漿，然後在pH4～5進行酸沉澱，然後用分子篩層析法，採用濃度在10 mM至30 mM之間的稀釋的緩衝液洗脫劑進行洗脫;活性組分用陽離子交換層析法，採用濃度在0.1M至1M之間的乙酸銨緩衝劑進行梯度洗脫以進一步純化，然後收集活性組份並且冷凍乾燥。
新鮮的及冷凍狀態(例如-70℃)的哺乳動物腦子都能作用。以下所描述的所有純化步驟最好都在0℃至6℃溫度範圍內進行。
每一批製品，無論是採用全部或部分動物腦子都要在2或4倍體積的緩衝溶液中打成勻漿，在pH變化為6至7.4的範圍內稀釋，然後優先採用鹽酸酸化至pH為4至5的變化範圍內，優先採用pH為4.5，隨後攪拌數小時。用離心(例如，40，000rpm，40分鐘)分離沉澱物質，將上清液中和並對稀釋的緩衝溶液進行透析，最後冷凍乾燥。可以將透析範圍為分子量在5至10千道爾頓內的透析膜透析。採用分離範圍為5，000至150，000道爾頓的固定相進行分子過濾分離。採用濃度變化範圍在10 mM至30 mM，pH變化範圍為6至7.4的緩衝液對樣品進行洗脫。收集生物學活性組份，冷凍乾燥，在陽離子交換層析柱上上柱並用濃度在0.1M至1M，pH為6至7的乙酸銨緩衝液進行梯度洗脫。神經元營養活性組份在洗脫劑濃度大約為1M時洗脫，然後再次收集並冷凍乾燥。
如果生物學活性物質的濃度已經達到足夠的程度，或如果採用其中較少的純化步驟時，上述方法可在任何純化步驟下中斷。
以下的例子對本發明進行描述，儘管並不對本發明進行限制。
例子由屠宰場得到新鮮牛腦子，然後在冰上分割尾狀核。每批製品大約將150克有尾組織(25～30腦子)與3倍體積的磷酸緩衝液(PBS)打成勻漿(Polytron，setting 6，60 seconds)然後用含苯甲基磺醯氟(PMSF)(0.3mg/ml)及EGTA(乙二醇雙β胺基乙醚N，N′-四乙酸)(1mM)的緩衝溶液稀釋10倍(pH7.4)，用HCl酸化至pH4.5，在冰中維持2小時，隨後離心(40，000rpm，40分鐘)。收集上清液並中和至(pH7.4)，在稀釋的PBS110(pH7.4)中透析過夜，冷凍乾燥後分成若干份並置於-20℃溫度下。使用前要立即(Imme-diately)，用蒸餾水重新將組份分散至原有的體積的1/10蛋白含量用Peterson G.L.的方法(Anal.Biochem.83346 1977)進行測定。然後樣品在培養基中稀釋，用牛血清白蛋白(1mg/ml)浸透的0.45微米Millex濾器過濾，將合適數量的過濾上清液組份加入至無血清中腦細胞培養物中以測定神經元營養活性。根據分子量採用葡聚糖G-150(細顆粒)層析柱(尺寸為8cm×120cm)分離上清液中的組成成份。將冷凍乾燥的上清液重新分散在蒸餾水中，並進行上柱(6ml緩衝洗脫液中含大約750mg蛋白質)。洗脫劑緩衝液的毫摩爾組成為(pH7.30)NaCl，13.68;KCl，0.27;Na2HPO4·7H2O，0.8;KH2PO4，1.5。
使用蠕動泵以每小時90毫升的流速對柱進行洗脫。用紫外監測儀在280nm波長下對洗脫液的光學密度進行連續監測。自動收集15ml的組份並在冷凍乾燥之後對神經元營養活性進行測試。凝膠過濾層析及組份收集都是在4℃溫度的冷房中進行。
從葡聚糖G-150柱上洗脫下的具有生物學活性組份收集後進行冷凍乾燥。將冷凍乾燥的各組份重新擴散於100μl0.1M的CH3COO(NH4)，pH6.45。取10μl測定蛋白質。剩下的100μl(1.9mg蛋白質)對TSK-CM-3 SW柱(一種用於高效液相層析HPLC的離子交換柱)進行上柱。用(NH4)COOCH3(0.1M-1M)，pH6.45對組份進行梯度洗脫，流速為每分鐘0.5毫升。緩衝液A0.1M(NH4)COOCH3，pH6.45。緩衝液B1M(NH4)COOCH3，pH6.45。洗脫曲線0-20分鐘，100%A/0%B(isoctatic 同溶劑洗脫)20-40分鐘，0%A/100%B(線性);40-70分鐘，0%A/100%B(isocratic同溶劑洗脫);70-75分鐘，100%A/0%B(線性)。組份冷凍乾燥後重新分散於0.6ml磷酸緩衝液(10mM，pH5.7)中。
取100μl測定蛋白質含量，剩下材料用於生物測定及SDS-PAGE(SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析。
表1列出分離(純化)程序的各主要階段，並對該例的純化程度(用蛋白質表示)，及在純化過程中可能獲得的神經元營養活性的百分產率進行了報導。蛋白質及營養活性產率使該方法區別於用於純化CNTF及BDNF的其它方法。
表1 牛腦神經元營養因子之主要純化階段的數據概要階段 總蛋白質(mg) 純化 專一活性 總量 營養單位倍數 μg/TU＊ 營養單位 回收%勻漿 11.625 1 - - -酸化沉 750 15.5 6 125，000 100%澱後的上清液葡聚糖 14.7 791 0.3 49，000 39%G-150CM- 0.361 32202 0.01 36，100 29%HPLC＊營養單位定義為可響應最大數目的神經細胞的一半存活的蛋白質濃度(μg/ml)。
化學特性由勻漿經過酸化沉澱、中和作用及透折獲得的上清液組份粗產品的生物學活性對胰蛋白酶(trpsin)是敏感的，表明了該活性分子的本質為蛋白質或肽類。上述上清液提出物粗產品中存在的生物學活性分子的各組份系從葡聚糖G-150柱上洗脫下來，相應的分子量變化範圍為10，000至30，000道爾頓(圖1)。圖1顯示總勻漿在酸化沉澱、中和及透析之後所得的牛尾狀核上清液在葡聚糖G-150上柱而得到的典型的洗脫曲線，同時還顯示了對組份的生物學活性鑑定。製備的條件如上所述。所有各組份均以0.01至10μg/ml範圍內的蛋白濃度對其生物學活性進行測定。觀察到的活性在圖1中用水平線標明。存在於通過葡聚糖G-150柱層析而得到的活性組分的生物學活性分子再從TSK-CM-3 SW柱上用大約1M乙酸銨的緩衝液洗脫下來(圖2)。
圖2顯示了由葡聚糖G-150柱得到的活性洗脫液再從TSK-CM-3 SW柱上洗脫而得到的典型的HPLC洗脫曲線。純化條件已由上述。所有組份都用0.001至0.3μg/ml變化範圍內的蛋白濃度對其生物學活性進行測定。用圖表上的水平線來代表由大約1M乙酸銨洗脫的組份中觀察到的活性。
後者洗脫時間近似於細胞色素C，表明活性分子的等電點近於細胞色素C，即大約為10-10.5。該特性區別於等電點大約為5的CNTF。用12.5%W/V聚丙烯醯胺凝膠板及(PAGF)根據Laemmli U.K.的方法(Nature 227680，1970)配成的含SDS的不連續(discontinuous)緩衝液按照Lee V.等人介紹的SDS-PAGE的電泳方法(Neuroscience 62773，1981)對由主要純化步驟(上清液提取物在對總勻漿進行的酸沉澱、中和及透析之後通過對葡聚糖G-150及TSK-CM-3 SW上柱而得到)得到的生物學活性物質進行的SDS-PAGE電泳示於圖3A。圖3A顯示了用BioRad標準蛋白質(第1及5行)及由主要的純化步驟，即，對總勻槳(第2行)進行酸沉澱、中和及冷凍乾燥，得到上清液提取物，用葡聚糖G-150柱純化物(第3行)及用TSK-CM-3 SW柱(第4行)，而得到的活性物質(5μg蛋白質/行)純化物進行的銀著色之後進行的SDS-PAGE凝膠電泳的例子。
所用的標準分子量指示物為肌球蛋白(分子量200，000)，β-半乳糖苷酶(分子量為116，250)，磷酸化酶b(分子量92，500)，牛血清白蛋白(分子量66，200)，卵白蛋白(分子量45，000)，碳酸酐酶(Carbon anhydrase)(分子量31，000)，大豆胰蛋白酶抑制劑(分子量21，500)及溶菌酶(分子量14，400)。用於電泳的緩衝液樣品的組成為62.5m M Tris[三(羥甲基)-氨基甲烷](pH6.8)，10%W/V甘油2%W/VSDS(十二烷基硫酸鈉)2.5mM EDTA，2.5mM EGTA，0.01%溴酸藍及5%的β-巰基乙醇。
由TSK-CM-3 SW柱得到的生物學活性物質的信號帶的移動情況與用標準的溶菌酶(Bio Rad)(Lysozyme)(Bio Rad)相近，因而具有的分子量大約為14，400道爾頓。該分子量與其它被確定的神經元營養因子(NGF，CNTF，BDNF)不同。的確事實上，由TSK-CM-3 SW柱洗脫下來的活性物質在SDS-PAGE凝膠電泳上移動的位置與鼠唾液腺β-NGF不相近(圖3B)。
圖3B顯示了用標準Bio Rad指示物(第1及4行)及2.5μg來源於鼠下頜下腺的β-NGF(第2行)及2.5μg由TSK-CM-3 SW柱(第3行)洗脫下來的活性物質進行銀著色後進行的SDS-PAGE凝膠電泳的例子。所用的標準蛋白質如圖3A。
NGF移動系在由TSK-CM-3 SW柱洗脫得到的活性分子移動位置的下方。據報導BDNF在SDS電泳中移動的位置與NGF相近。從而進一步表明了由TSK-CM-3 SW柱洗脫得到的活性分子可能不同於BDNF。
生物活性由純化的主要步驟(對總勻漿進行酸沉澱，中和及透析得到上清液提出物粗產品，在G-150柱及TSK-CM-3 SW柱上上柱得到洗脫液)的物質的生物學活性常常通過監測其對離體的胎鼠中腦細胞無血清培養的作用而測定。此外，還可以通過對培養系統中的專一的多巴胺能的(dopaminergic)神經元對3H-多巴胺標記的吸收及(GABAergic)神經元的14C-GABA專一標記的特定攝入進行測定以確認其形態學上的判斷。
下面系細胞培養液的製備方法，細胞存活數的計算及細胞培養液的特性及特定的攝入參數以及從純化工序中在幾個主要階段內所得材料的作用效果。
1.細胞培養物的製備方法及用於評價在體外的細胞類型的免疫化學標準在無菌條件下從13天胚胎鼠的腦中分割嘴側的中腦蓋。在用下列毫摩爾組成的PBS溶液Na Cl，136.8;KCl，2.7;Na2HPO4·7H2O，8;KH2PO4，1.5及葡萄糖含量(6mg/ml)和牛的血清白蛋白(0.1mg/ml)(PH7.4)機械分裂混合的腦區。然後將此細胞離心(45轉/分鐘，離心4分鐘)，再將它懸浮在培養介質中，通過一個20微米的耐泰克斯過濾器(Nytex filter)，用一個分離細胞的計數器計數並鋪板在35毫米的佛爾康(Falcon)組織培養塑料碟中。
在每個碟上塗以牛皮膚膠原蛋白(Vitrogen，100微克蛋白質)，用伊格爾巴塞爾(Eagle′s Basal)培養基(BME)，(加入)Na HCO和NaOH以提高離子強度和pH值(埃爾斯泰勒T.等的組織生物學雜誌(Elsdale T.et al，J.Cell.Biol.54626，1972)。
此培養基由BEM和用漢姆(Ham)F12(1∶1)的一種混合物構成，用葡萄糖(33mM)、穀氨醯胺(2mM)、NaHCO3(15mM)海派斯(HEPES)(N-2-羥基乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(10mM)補充，用如戴安泡澤厄U.(Di Porzio U)等(Nature 288370，1980)所述的用胰島素(25μg/ml)、鐵傳遞蛋白(100μg/ml)、腐胺(60μM)、黃體酮(20nM)、亞硒酸鈉(30nM)、青黴素G(0.5U/ml)和鏈黴素(0.5μg/ml)補充;且含有T3(3，3′，5′-三碘代-DL-甲腺原氨酸)(30n M)[皮爾瑪羅特J.(Puymirat J.等，Neusoscience 10801，1983]。典型的，將2毫升含有所需的經分離的細胞數的介質加至每個碟中。
通過利用單克隆抗體RT97對神經絲蛋白質(安德湯B.H(Anderton B.H.)等，Nature29884，1982)，一種體外特珠的神經元細胞指示劑，如道赫蒂P.(Doherty P.)等所述的(J.Neurochem.)421116，1984)間接免疫螢光法進行體外細胞類型的鑑別。簡單地說，在-20℃下將此培養物在甲醇中固定7分鐘。通過用在PBS中的0.1%(vol/vol)的三通X-100(一種聚氧化甲烯醚)處理，使此經固定的培養物滲透，然後用含有PBS的10%的小牛胎兒血清(FCS)培養60分鐘以阻斷非特異性的蛋白質粘合位置。用在PBS中的抗神經元絲狀抗體(稀釋1∶500)培養，室溫下進行60分鐘，且然後用含有10%的FCS的PBS衝洗3次。然後在室溫下60分鐘內將若丹明結合的山羊抗鼠高度親和性的經純化的免疫球蛋白G(稀釋1∶100)加至培養物中，且在PBS中用10%的FCS衝洗3次以後，用甘油/PBS(1∶1)覆蓋，並在一個裝有若丹明差向螢光和相對比光學系統的策斯(Zeiss)照相顯微鏡Ⅲ中檢驗。根據拉夫M.C.(Raff M.C.)等所述的方法(Brain Res，174283，1979)，用鼠GFAP(神經膠質的原纖維酸性蛋白質)抗血清(加至體外的特異的標記星形細胞)及山羊抗鼠高度親和的經純化的若丹明-結合的免疫球蛋白G實行免疫螢光法測定。
2.在培養物中用時間來評定細胞存活的方法在體外試驗;根據時間，通過形態學標準(即是，在體外，根據時間，通過相對比顯微鏡觀察存活細胞的數量)和用生物化學法測定DNA含量及用每個碟中存活的多巴胺能的細胞的數量來評定細胞存活。
DNA測定系根據歐文B.G.(Erwin B.G.)(Anal.Biochem.110-291，1981)所建立的方法，每一碟中多巴胺能的細胞數系根據特定的多巴胺攝入(量)及螢光神經細胞的目測系波爾斯特德G.(BolstadG.)等(Comp.Biochem.Physiol.6261，1979)所敘述的乙醛酸-誘導的螢光法測定。為了後面的目的，此細胞用一個裝有兒茶酚胺差向螢光和相對比光學系統的策斯照相顯微鏡Ⅲ觀察。利用預固定的同等物計算相應於至少3%的總表面積的對GIF顯示陽性的經細胞的數量。
3.特異的多巴胺和GABA攝入的評定的方法如伯傑B.(Berger B.)等(Neuroscience7193，1982)所述進行特異的3H-多巴胺攝入的評定。此細胞用用葡萄糖(5mM)、CaCl2(1mM)、MgSO4(1mM)、抗壞血酸(0.1mM)、帕吉林(Pargyline)(0.1mM)補充的經預熱的PBS(液)洗滌一次，並用0.8毫升上述溶液預培養5分鐘。必要時，將苯託品(5μM)、去甲基丙咪嗪(5μM)或氟塞丁(fluoxetine)(1μM)加至此培養基中。常規地，然後加入0.2毫升3H-多巴胺(50μM)最終濃度，SA(特異活性)22-33-Ci/mmol)，並在37℃下繼續培養15分鐘。通過移去此培養混合物而停止攝入，然後用冰冷的PBS迅速衝洗4次。然後，用0.5ml0.4M的HCl O4加無水乙醇(3∶1v/v)從每個碟中萃取H-多巴胺二次。回收超過95%。在添加10ml的InstagelⅡ(一種液體閃光計數液體)之後，用一種派卡德特立卡伯(Packard Tri Carb)閃光計數器(型號460 C)評定放射活性。對培養末期的個別試樣和洗液中用0.5ml的高氯酸(0.4N)萃取細胞內的放射活性，並用高壓液相色譜法(HPLC)分析(科特克C.(Kotate C.)等，J.Neurosci，21307，1982;舒姆A.(Shum A.)等，J.Chromatog，228123，1982)。在多巴胺滯留時間內聚集的放射活性超過注入的放射活性的95%。
如普羅切恩茲A.(Prochiantz A.)等所述(Nature 293570，1981)，在37℃下，用添加的0.1μM的14C-GABA(225mMCi.nmol)測試C-GABA的特異的攝入量15分鐘。氨基氧乙酸(10μM)被用於阻止GABA分解代謝。必要時，加入此GABA攝入抑制劑，二氨基丁酸(10-3M)。洗滌和萃取過程為那些研究H-多巴胺攝入所述的。通過薄層層析(TLC)進行GABA的鑑別(拉謝R.S.(Lasher R.S.)Brain Res.69235，1974)。超過90%的放射活性與一個具有真實的GABA的點一起移動。
4.在細胞培養系統中的形態學評定，存活性和生物化學性質在4天和8天體外培養後，存在於碟中的超過98%的粘附生存的細胞對於具有單細胞系的抗體RT97的免疫細胞化學的染色法為陽性免疫反應。同樣，在培養物中，少於1%的此細胞，在總的培養時間內，對具有GFAP抗血清的染色法具有免疫反應性的。這表明在培養物中超過98%的此細胞可被分類為神經元的成分。在培養物系統中的多巴胺能激活神經元的數量的顯影表明這些細胞近似於存在於體外的總的細胞(繁殖)數量的0.1-0.2%。
在所用的培養物系統中的細胞的存活性在體外多至4天未變。然而，在體外，在4天和8天之間，存活性降至約60-80%。這不僅在形態學評定之後，而且在下列每個碟中的DNA含量和多巴胺能的細胞的數量的評定之後都很清楚。這表面所用的在培養物條件下的中腦神經元細胞的存活性是有限的，且在存在於此培養物系統中的不同類型的細胞的存活性方面無顯著的變化發生(參見附圖4)。
附圖4為一個表示總的神經元的變量、陽性的GIF的神經元的變量和BZT-靈敏的多巴胺攝入的變量和時間關係圖。將此中腦細胞放在一種濃度為1×106細胞/35mm碟的培養物介質中。
附圖4上顯示如下(內容)DNA/碟(●-●);BZT-靈敏的多巴胺攝入(量)(○-○);GIF+細胞的數量/碟(塊直方圖);BZT-靈敏的多巴胺攝入(量)/103GIF+細胞(虛線直方圖)。
同樣確定在培養物中的細胞存活性、7H-多巴胺的特異攝入量和在體外、在第4天與第8天之間14C-GABA降至約60-80%。這又指示著在存在於體外的各種細胞類型之間在特性方面無明顯的區別，且意味著這些攝入參數是在體外的細胞存活性的合適的標記。
5.從純化過程的主要步驟中衍生的物質的生物活性為此目的，在運用前立即將從純化的主要步驟中衍生的冷凍乾燥分成幾部分再懸浮起始體積1/10蒸餾水。根據彼得森G.L(Peterson G.L.)(Anal.Biochem.83346，1977)評定蛋白質含量。用培養基稀釋試樣，通過米萊克斯(Millex)0.45微米的過濾器過濾，並在牛的血清白蛋白(1mg/ml)預飽和。然後，在鋪平板那天將適合量的經過濾的物質加至中腦細胞培養物中。同樣，將等量的牛的血清加至對照的細胞培養物中在各培養物中，每二天換一次介質或交替地用從純化步驟中衍生的物質補充或在對照培養物情況下用白蛋白補充。從各主要純化步驟衍生的物質-在總的勻漿的酸沉澱之後所得到的粗上清液，從分子量範圍在10至30千道爾頓內洗脫的萄聚糖凝膠G-150柱中所得到的流份和從用約1M乙酸銨洗脫的TSK-CM-3SW柱所得到的流分-均能提高存活性，即在培養物中的經分離的胎兒的中腦神經元的細胞存活並得到發育。在鋪板的(天0)那天起加至培養物介質之後，粗培養物上層流份或白蛋白(對照培養物)在體外細胞培養物的第8天的形態學現象，如附圖5A和5B中所示。這些附圖描述在添加10μg/ml的在對照培養物(附圖5A)中的白蛋白和10μg/ml在酸沉積及滲析總的勻漿液(附圖5B)所得到的上層萃取物之後，在體外(試驗中)，在第8天時(出現)胎兒鼠中腦細胞的典型現象。
同樣從總的DNA含量，每個碟子中多巴胺能的細胞的數量(附圖6)，及根據在體外(試驗中)的時間3H-多巴胺和14C-GABA的特異攝入(量)的測定而得到證實。
附圖6表示在將10μg/ml白蛋白加至對照培養物(塊直方圖)以及添加10μg/ml在酸沉積及滲析總的勻漿液(虛線直方圖)後的上清液之後，體外(試驗)表明，在第8天時每個碟子中GIF+細胞的(例如，DA多巴胺能的)和DNA含量的數量的測定。三個為一組進行分析，所得值±S.E.(意味著標準誤差)。附圖7表示根據多巴胺攝入的有關量與上層清液濃度的效果。這事實從每個碟子中的GABA和DNA攝入的確定中觀察到。
特別是，附圖7表示對BZT-靈敏的多巴胺攝入的各種濃度的牛腦的萃取物(在酸沉積及滲析總的勻漿後所得到的)的添加效果。將一種濃度為0.5×105細胞的中腦細胞/1毫升培養物介質/池(24mm)中。在沉積時加入50μl/體積所示量的牛腦的萃取物。必要時，試樣用牛的血清白蛋白補充以達到40μg/ml蛋白質的最終濃度。在體外(試驗中)，在第4天測定攝入參數。三個試樣為一組進行分析，所得值為±S.D.(標準偏差)的平均值。同時，這此結果表明活性物質能提高存活和發育在體外(試驗中)的各種神經細胞類型，特別是那些存在於所用的培養物中的。儘管當在(提取物的)上清液中，在用10和30千道爾頓(範圍)之間洗脫的葡聚糖凝膠G-150流份的池中及在用約1M的乙酸銨洗脫的TSK-CM-3 SW柱的流份組中測試營養活性時，可測得相似的效果，但這些效果必需的物質的量不同。特別是，當在體外(試驗時)加入濃度為約6μg/ml的顯示一種1/2最大(semimaximal)生物學活性的粗上層萃取物時，可測得在從葡聚糖凝膠G-150和TSK-CM-3SW柱中所得到在流份中的此1/2最大活性分別為約0.3μg/ml和10ng/ml(參見表1)。在體外(試驗中)的其它類型的神經元細胞培養物的生物活性的測試，特別是從胎兒鼠紋狀體中分化的神經元細胞，表明活性分子在存在於不同區域的神經系統特別是中樞神經系統(CNS)中的各種神經元類型的提高存活和發育方面(的作用)是有效的。進一步講，在體外(試驗中)活性物質在增進來自12天的胚胎小雞而不是來自8天的胚胎小雞的背側神經末梢神經節神經元的神經的生長方面是有效的。這效果再一次表明神經營養因子可以和自鼠唾液腺衍生的β-NGF有區別。實際上，添加各種濃度(從1ng至300ng/ml)的來自鼠唾液腺的β-NGF對在培養物中的常規所用的鼠的經分化的中腦細胞的存活是無效的。
Ⅳ.由哺乳類動物腦中所得到的神經元營養因子在體內的應用本篇專利的另一個目標是由哺乳類動物腦中所得到的神經元營養因子在體內的應用，如上面已經討論過的，神經元營養因子可調整神經細胞的存活和神經對環境的適應性(定義為神經細胞對於它所處的微生物環境的調整適應的能力)，它不僅是神經系統的發展方向，而且愈趨成熟。事實上，根據累積起來的證據，可以表明神經因子可能這樣控制細胞的成熟過程(萬隆S.(Varon S.)discussions in Neuroscince第Ⅱ卷，第3篇，1985)。
Ⅰ.維持細胞運轉和正常的細胞老熟即必定是充分地運用神經元營養因子，維持正常的營養需求，因此，體內神經變態的運轉就反映了營養劑的不適當。
Ⅱ.對於體內化學和機械的細胞損壞進行修復和重整，因為尤其軸突(神經小胞)的損壞會導致神經元營養因子對神經細胞的供給缺乏，神經細胞會受到創傷或病理性的損傷甚至死亡，這其中可能也包括正常的老熟過程。
Ⅲ.在一些病理條件下，(萬隆S.ibid)的再生和死亡，即不同的病理條件伴隨不同的營養缺乏症，營養供給系統的衰退或超過營養需要都可能導致營養缺陷。
從上面的觀點來看，這篇專利也引導了下列有關親神經元因子SDNF的應用，特別指出了不經腸胃的用法(包括雖然並非全部是包括硬膜外的、腦池內的、心室內的、鞘內的、靜脈內的、肌內的、皮下的、舌下的、牙齦間的、直腸的和鼻骨的)，SDNF分子單獨進入體內或者與神經節苷酯(尤其，牛腦神經節苷酯混合劑，即從牛腦中所得到的單一神經節苷酯片斷GM，以及半合成神經節苷酯衍生物，更好的是神經節內酯衍生物)，結合使用或和與磷酯(牛腦磷酸酯混合劑，或是單一的牛腦磷酯片斷及磷酯醯絲氨酸，或是半合成磷酯衍生物)相結合使用，這取決於神經病理條件Ⅰ急性的、亞急性的、或慢性的神經系統損傷;包括外部損傷、化學損傷、脈管損傷及缺損(如中風)，以及傳染性的、炎性的和因腫瘤引發的損傷。
Ⅱ神經系統的老化包括阿爾茨海默病。
Ⅲ神經系統的慢性疾病。
Ⅳ神經系統或影響神經系統的免疫學疾病。
SDNF分子與神經節苷酯及磷酯的聯合使用結果表明牛腦神經節苷酯和牛腦磷酯可增加細胞對神經元營養因子的應答活性，這在體外和很有可能在體內的試驗當中反應出來。
下面的表格描述了GM，和牛紋狀體浸出物對於中腦炎細胞培養的影響。
表2BIT-靈敏的3H- BABA-靈敏的DA攝入14C-GABA攝入物質 fmol/平板15分鐘 pmol/平板15分鐘白蛋白 29.51±5.78 0.56±0.14白蛋白+GM 69.14±3.38 1.04±0.05紋狀體浸出物 104.68±7.60 2.41±0.27紋狀體浸出物+GM 140.58±17.82 4.56±0.10＊中腦炎細胞(1×106/平板)在含中白蛋白(15μg/ml)或紋狀體浸出物(15μg/ml)的無血清培養基上單獨培養，或在培養基中再加入10-7mGM1。椐在Ⅲc中報導的攝入量試驗的方法，將上述實驗進行四天，三個為一組進行分析，所得平均值為±S.E.
牛紋狀體浸出物以前面所報導的方法(Ⅲa)進行製備。
a.藥劑組成由哺乳動物腦內所得SDNF分子，再製備藥劑，這裡不描述了，對於神經節苷酯和磷酯可能是同樣的情況，包括我們所知道的合成有效的藥劑的方法及對病人的最佳用法都是一樣的，這就意味著，大量的SDNF有效活性與合適的藥物載體分不開。合適的載體和它們的配方包含一些蛋白質，例如，在「雷明頓(Remington′s Phaema ceutical Sciences」一書(雷明頓的Pharmaceulical Sciencese.瑪克(Mack)印刷公司，伊斯頓(Easton)，Pa.美國，1985).中就有例子。這些載體介質含有可注射的「已存儲的配方」。
由上可見，藥物配方包括(也不是全部的)SDNF溶液或是冷凍乾燥的SDNF粉末與一個或更多的藥物載體或稀釋劑一起，該稀釋劑保存在一適當pH緩衝劑和等滲性的生理液體中，表3表明的只是說明目的，而不應受這些限制，這些體系製備成溶液的狀態，以對付神經系統紊亂者。在冷凍乾燥粉劑的製備時，要提供賦形劑，但這不是絕對的，也可採用甘露醇或甘氨酸，並要具備相應的緩衝劑，緩衝劑的體積要求是能夠達到等滲性，緩衝劑的pH要求適當，相似的溶液也可以用於SDNF分子的藥劑組成物，得在所需的一定體積的等滲溶液中形成，但這也不是絕對的，用磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝的生理含鹽水可得到多種藥物配方時所需的等滲溶液，並具一定所希望的pH，如中性pH等。
又為了所述的目的，表4A和4B列出一些治療神經系統紊亂的可能的藥劑組成。在表4A和4B中列出的藥劑組成每一劑量用兩個小瓶製備。第一個小瓶含有具有約0.01%至50活性物質重量%的一種組成，與一種藥物學上可接受的賦形劑，如甘氨酸或甘露醇。第二個小瓶含有一種用配成所需體積的磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝的鹽水溶液。在使用前混合此兩個小瓶中的物質立即使用，且此冷凍乾燥的活性物質馬上溶解而得到一種可注射的溶液。表4B也列出了用於皮下注射的一種藥劑學組成的可能的實施例(系統5)。
此藥劑配方也包括，但不限於此，具有親脂性的例如，水溶性的、自行乳化的糖原白明膠的或其它類型的賦形劑直腸施用的栓劑。在此製備中，SDNF可以重量在總的賦形劑的0.001%和1%重量範圍內存在。此栓劑的形式也可含有，但不限於此適合量的乙醯基-水楊酸鹽。表5列出，僅為所述的目的，治療神經系統紊亂的可能的栓劑的製備。
進一步講，以冷凍乾燥的形式和作為溶液的SDNF的藥物製備均可包括有效劑量的上述磷脂或神經節苷酯，例如，此劑量可分別與(雖然不是唯一的)通常用於人類治療神經恢復或由於年老的神經病所用的劑量一樣，且可根據施用途徑。SDNF的藥物學製備劑量和施用次數由所需的效果(由臨床試驗決定)和施用途徑決定，例如，(施用的)劑量和次數可與通常用於用其它神經元營養劑如NGF研究的一樣(雖然，不是唯一的)。
表3用於可注射的溶液的藥劑組成的實施例製備1-一個2ml的安瓿瓶包含活性物質 μg 5 (500TU)氯化鈉 mg 16檸檬酸鹽緩衝劑PH＝7 ml 2在無熱源的蒸餾水 q.b.中製備2-一個2ml的安瓿瓶包含活性物質 μg 100 (10，000TU)氯化鈉 mg 16檸檬酸鹽緩衝劑PH＝7 ml 2在無熱源的蒸餾水 q.b.中此營養單元(TU)如表1中定義。
表4A藥劑組成系統的實施例系統1a)一個2ml的小瓶包含冷凍乾燥的活性物質 μg 5 (500TU)甘氨酸 mg 30b)一個2ml的小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 16
在水中的檸檬酸鹽緩衝劑 ml 2無熱原的蒸餾水 q.b.
系統2a)一個2ml的小瓶包含凍幹的活性物質 μg 5 (500TU)甘露醇 mg 40b)一個2ml小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 16在水中的檸檬酸鹽緩衝劑 ml 2在無熱原的蒸餾水 q.b.
系統3a)一個3ml的小瓶包含冷幹的活性物質 μg 100 (10，000TU)甘氨酸 mg 45b)一個3ml小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 24在水中的檸檬酸鹽緩衝劑 ml 3在無熱原的蒸餾水 q.b.
此營養單元的單位(TU)如表1中定義。
表4B藥物學組成系統的實施例系統4a)一個3ml的小瓶包含凍幹的活性物質 μg 100 (10，000TU)甘露醇 mg 60
b)一個3ml的小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 24在水中的檸檬酸鹽緩衝劑 ml 3在無熱原的蒸餾水 q.b.
系統5(用於皮下注射的實施例)a)一個2ml的小瓶包含凍結的乾燥的活性物質 μg 10 (1，000TU)甘氨酸 mg 30b)一個2ml小瓶的溶劑包含氯化鈉 mg 16在水中的檸檬酸鹽緩衝劑 ml 2無熱原的蒸餾水 q.b.
此營養單元單位(TU)如表1中定義。
表5以用於直腸途徑的栓劑形式(存在)的藥物學組成的實施例製備1活性物質 μg 100 (10，000TU)可可脂 g 2.5製備2活性物質 μg 100 (10，000TU)卡波蠟1540(carbo wax) g 1.75卡波蠟6000 g 0.75製備3
活性物質 μg 100 (10，000TU)吐溫61 g 2.125羊毛脂 g 0.25製備4活性物質 μg 100 (10，000TU)甘油 g 1.5水 g 0.75白明膠 g 0.25此營養單位(TU)如表1中定義。
權利要求
1.一種製備分子量大約為14，400道爾頓的鹼性蛋白質神經元營養因子的方法，其特徵為，所述方法包括如下步驟(a)哺乳動物腦組織的勻槳化(b)對製得的勻槳進行酸沉澱(c)用阻留分子量範圍為5至10千道爾頓的透析膜對得到的上清液進行透析(c)根據分子量的大小對透析得到的上清液進行層析分離。
2.如權利要求
1所述之方法，其特徵為，還包括以下步驟(e)用乙酸銨緩衝液梯度洗脫的陽離子交換層析法對得到的神經元營養活性組份進行純化。
3.如權利要求
1或2所述之方法，其特徵為，其中所述之哺乳動物腦組織為牛腦組織。
4.如權利要求
1或2所述之方法，其特徵為，將由牛腦分出的尾狀核用於上述方法的步驟中。
5.如權利要求
1所述之方法，其特徵為，步驟(b)在pH4至5的酸度下進行。
6.如權利要求
1所述之方法，其特徵為，其中的層析分離步驟(d)是用濃度為10n M至30n M之間的稀釋緩衝洗脫劑在分子篩上進行的。
7.如權利要求
6所述之方法，其特徵為，採用分離範圍為5，000至150，000道爾頓的固定相進行分離。
8.如權利要求
2所述之方法，其特徵為，用濃度自0.1M至1MpH自6至7的梯度乙酸銨緩衝液洗脫劑對陽離子交換層析柱進行洗脫，而獲得神經元營養活性組份。
9.如權利要求
1或2所述之方法，其中各步驟在0℃至6℃的溫度下進行。
10.如權利要求
1或2所述之方法，其特徵為，將神經元活性組份收集在一起並進行冷凍乾燥。
11.一種分子量大約14，400道爾頓的鹼性蛋白質神經元營養因子。
12.如權利要求
11所述的神經元營養因子，其特徵為，該神經元營養因子的等電點大約為10。
13.如權利要求
11所述的神經元營養因子，其特徵為，至少具有0.01mg/營養單位的專一活性，所述的神經單位的定義為，使響應於飽和濃度的活性物質的神經細胞存活的量大數目的一半存活時所需蛋白質濃度(μg/ml)。
14.一種神經元營養因子，其特徵為，該神經元營養因子為哺乳動物腦尾狀核中分離的鹼性蛋白質，具有神經元營養活性，其分子量大約為14，4000道爾頓。
15.如權利要求
14所述的神經元營養因子，其特徵為，其等電點大約為10。
16.如權利要求
1所述方法製備的神經元營養因子。
17.如權利要求
16所述之神經元營養因子，其特徵為，當用葡聚糖G-150進行所述層析分離時，組份用圖1中的完全水平線段表示。
18.如權利要求
2所述方法製備的親神經因子。
19.如權利要求
18所述的神經元營養因子，其特徵為，組份用圖2中的完全水平線段表示。
20.如權利要求
1或2所述的方法所製備的神經元營養因子，其特徵為，該神經元營養因子能夠促進神經元細胞的生存及分化。
21.一種含有神經元營養活性數量的如權利要求
11所述的神經元營養因子的複合藥物，及藥物上可接受的賦形劑或稀釋用載體。
22.一種含有神經元營養活性數量的如權利要求
14或15所述的神經元營養因子的複合藥物，及藥物上可接受的賦形劑或稀釋用載體。
23.一種含有神經元營養活性數量的如權利要求
1或2所述方法製得的神經元營養因子的複合藥物，及藥物上可接受的賦形劑或稀釋用載體。
24.如權利要求
21至23中任一項所述的藥物複合物，其特徵為，還進一步包括至少為一種神經節脂或磷脂的組成成份。
25.一種對神經元疾病的治療方法，其特徵為，該方法包括對病人施以有效數量的如權利要求
11或14所述的神經元營養因子。
26.如權利要求
25所述之方法，其特徵為，所述的神經元疾病為在神經系統中發生的外傷性損傷、化學損傷、脈管損傷、脈管短缺、由感染或炎症或腫瘤引起神經系統的損傷。
27.如權利要求
25所述的方法，其特徵為，所述的神經元疾病是神經系統的老化。
28.如權利要求
25所述之方法，其特徵為，所述的神經元疾病為慢性神經變性或對神經系統產生影響的慢性免疫學疾病。
29.如權利要求
25所述之方法，其特徵為，所述的神經元營養因子是根據權利要求
1或2的方法製備的。
30.如權利要求
25所述的方法，其特徵為，所述的神經元營養因子至少是和一種神經節甙脂或一種磷脂一起施用的。
專利摘要
一種新穎的神經元營養因子，分子量大約為14,400道爾頓，等電點大約為10，通過以下方法製備將哺乳動物腦組織，特別是牛腦組織勻漿化，對勻漿進行酸沉澱，用阻留範圍為5至10千道爾頓的透析膜對上清液進行透析，然後對經透析的上清液進行層析。神經元營養活性組分可用乙酸銨梯度緩衝液對陽離子交換層析柱洗脫以進一步純化。本發明的神經元營養因子可用於各種神經疾病的治療。
文檔編號C07K14/435GK87105478SQ87105478
公開日1988年2月17日 申請日期1987年8月7日
發明者弗朗西斯科·德拉瓦勒 申請人:菲迪安股份公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan