用於實體腫瘤預後的藥物基因組學標誌的製作方法

2023-04-26 06:32:51 2

專利名稱：用於實體腫瘤預後的藥物基因組學標誌的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因標誌和使用這些標誌用於實體腫瘤的預後的方法。

背景技術：
初生組織中的表達分布研究已證明正常與惡性組織之間存在轉錄差異。參見，例如Su，等人，Cancer Res.，617388-7393(2001)；和Ramaswamy，等人，Proc.NATL.ACAD.Sci.U.S.A.，9815149-15151(2001)。新近臨床分析也已鑑別似乎與臨床結果的某些量度高度相關的腫瘤表達分布。某研究已證明原發性腫瘤活檢的表達分布產生比得上或甚至可能勝過目前採納的癌症患者中風險的標準量度的預後性「信號」。參見van de Vijver，等人，N Engl J Med，3471999-2009(2002)。
雖然原發性腫瘤組織中的轉錄或其他生物化學變化可代表鑑別預後證據的最佳機會，但在許多腫瘤學情況中，原發性腫瘤已在化學療法開始之前切除。在這些境況中，因此，希望確定某些其他「替代」組織中的反應是否能提供患者結果的指示。


發明內容
本發明的特徵在於可提供實體腫瘤患者的最終臨床結果線索的外周血單核細胞(PBMC)中的基因標誌。抗癌治療開始後，實體腫瘤患者的PBMC中，各基因標誌均具有改變的表達模式，且這一改變的量值在統計上與實體腫瘤患者的臨床結果顯著相關。在許多實施例中，PBMC中的基因表達變化與患者結果之間的相關性通過Cox成比例危險模型、Spearman相關分析(Spearman correlation)或基於等級的相關性量度(class-based correlation metric)判定。本發明的基因標誌可用作實體腫瘤預後的替代標誌。其也可用作抗癌藥物功效的藥物基因組學指標。
一方面，本發明提供用於所關注的患者的實體腫瘤的預後或評估所關注的患者的實體腫瘤的治療效力的方法。所述方法包含檢測抗癌治療期間所關注的患者的外周血細胞中至少一個基因的表達水平的變化，和比較所檢測的變化與參考變化。罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的患者的PBMC中基因的表達水平變化與這些患者的臨床結果相關。因此，所關注的患者的表達水平變化的量值指示患者治療的預後或效力。在許多實施例中，參考變化具有經驗上或實驗上確定的值。如果所關注的患者的表達水平變化大於或小於參考變化，那麼視為所關注的患者具有良好或不良預後。在許多其他實施例中，參考變化為罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的參考患者的外周血細胞中基因的表達水平變化。也可使用其他量度或標準計算參考變化。
可使用多種類型的血樣確定所關注的患者的基因表達變化。這些血樣的實例包括(但不限於)全血樣品或包含高濃度或純化PBMC的樣品。也可使用其他類型的血樣。在適當的相關模型下，這些樣品中的基因表達水平變化在統計上與患者結果顯著相關。
符合本發明的實體腫瘤包括(但不限於)腎細胞癌(RCC)、前列腺癌或頭/頸癌。可根據本發明加以評定的抗癌治療包括(但不限於)藥物療法、化學療法、激素治療、放射療法、免疫療法、手術、基因療法、抗血管生成療法、姑息療法或其他常規或實驗療法或其組合。可使用任何與時間相關的臨床指標評估所關注的患者的治療的預後或效力。這些臨床指標的非限定性實例包括疾病進展時間(TTP)或死亡時間(TTD)。
可使用多種相關法或統計法評定抗癌治療期間外周血基因表達變化與患者結果之間的相關性。這些方法包括(但不限於)Cox成比例危險模型、最近鄰體分析(nearest-neighbor analysis)、微陣列顯著性分析(significance analysis of microarrays)(SAM)法、支持向量機(support vector machines)、人工神經網絡(artificial neuralnetwork)或其他秩檢驗(rank test)、生存分析(survival analysis)或相關性量度(correlationmetric)。
在一個實施例中，使用單變量Cox成比例危險模型確定CCI-779治療開始後RCC患者的PBMC中基因表達水平變化與這些患者的臨床結果的時間量度(例如，TTP或TTD)之間的相關性。Cox成比例危險模型所鑑別的預後性基因的非限定性實例描述於表4A、4B、5A及5B中。這些預後性基因可用於預測臨床結果或評估所關注的RCC患者的抗癌治療的效力。
在一個實施例中，本發明中所使用的預後性基因的估計危險比率小於1。因此，所關注的患者的外周血細胞中較高值的基因表達水平的變化暗示患者的較佳預後。相反地，所關注的患者的較低值的變化指示較差預後。
在另一實施例中，本發明中所使用的預後性基因的危險比率大於1。結果，所關注的患者的外周血細胞中較高值的基因表達水平的變化指示患者的較差預後，且所關注的患者的較低值的變化暗示較佳預後。
所關注的患者的表達水平變化可從任何參考點起度量。在適當的相關模型下，所度量的表達水平變化在統計上與患者結果顯著相關。在許多情況下，預後性基因的表達水平變化通過度量抗癌治療開始後特定時間基因的外周血表達水平與基因的基線外周血表達水平之間的改變來確定。在一非限定性實例中，特定時間為治療開始後約16周。也可使用小於或大於16周(例如，治療開始後4、8、12、20、24或28周)的特定時間。
本發明的特徵也在於兩個或兩個以上基因標誌或多變量Cox模型用於實體腫瘤的預後的用途。另外，本發明的特徵在於適用於RCC或其他實體腫瘤的預後的試劑盒。各試劑盒包括至少一個用於本發明的預後性基因的探針或大體上由其組成。
另一方面，本發明的特徵在於使用羅吉斯回歸(logistic regression)、ANOVA(方差分析(analysis of variance))、ANCOVA(協方差分析(analysis of covariance))、MANOVA(方差多重分析(multiple analysis of variance))或其他用於所關注的患者的實體腫瘤的預後或評估其治療效力的相關法或統計法。這些方法包含檢測抗癌治療開始後特定時間所關注的患者的外周血細胞中至少一個實體腫瘤預後性基因的表達水平和將表達水平輸入相關模型或統計模型中以確定所關注的患者的治療的預後或效力。相關模型或統計模型描述罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的患者的PBMC中實體腫瘤預後性基因的表達水平與這些患者的臨床結果之間的統計上顯著的相關性。在許多實例中，相關模型或統計模型能夠產生所關注的患者的臨床結果的定性預測(例如，良好或不良預後)。適於此目的的統計模型或分析包括(但不限於)羅吉斯回歸或基於等級的相關性量度。在許多其他實例中，相關模型或統計模型能夠產生所關注的患者的臨床結果的定量預測(例如，估計TTD或TTP)。適於此目的的統計模型或分析包括(但不限於)多種回歸、ANOVA或ANCOVA模型。
用於預測所關注的患者的表達水平可為從基線或抗癌治療開始後另一參考時間點起度量的相對表達水平。也可使用絕對表達水平預測所關注的患者。在後一種情況中，可使用基線或另一特定參考時間的表達水平作為預測模型中的協變量。
本發明的其他特徵、目標及優點易見於下文具體實施方式
中。然而，應理解當實施方式說明本發明的實施例時，其僅以說明的方式而非限定性方式給出。由具體實施方式
，本發明的範疇內的多種變化和修改對所屬領域的技術人員來說將變得顯而易見。



無
具體實施例方式 本發明提供用於RCC或其他實體腫瘤的預後的方法和系統。實體腫瘤預後性基因可通過本發明加以鑑別。抗癌治療開始後，實體腫瘤患者的PBMC中各預後性基因均具改變的表達分布，且這些改變的量值與此等患者的臨床結果相關。在許多實施例中，表達分布改變從基線起度量，且表達分布改變與患者結果之間的相關性通過Cox成比例危險模型加以評定。
可使用本發明的預後性基因作為替代標記，以用於所關注的實體腫瘤患者的預後或監測所關注的實體腫瘤患者的治療效力。歸因於疾病的分子機理的個別異質性，不同患者對治療可能會具有不同臨床反應。與患者反應相關的基因表達模式的鑑別使得臨床醫師得以基於預測的患者反應選擇治療且從而避免不利反應。此提供改進的臨床試驗安全性和增加的藥物及其他抗癌治療的效益/風險比。外周血為通常以最低侵襲性的方式從患者獲得的組織。通過確定患者結果與外周血中基因表達變化之間的相關性，本發明代表臨床藥物基因組學和實體腫瘤治療的重大發展。
本發明的多個方面更詳細地描述於以下分部中。使用分部並不旨在限制本發明。各分部可適用於本發明的任何方面。在本申請案中，除非上下文另有明確規定，否則單數形式「一」包括複數涵義，且除非另有說明，否則使用「或」意謂「和/或」。
I.鑑別實體腫瘤預後性基因的一般方法 本發明鑑別外周血基因表達分布的改變與實體腫瘤患者的臨床結果之間的統計上顯著的相關性。可鑑別具有所述相關性的基因。這些基因為實體腫瘤預後性基因且可用作替代標記，以用於實體腫的預後或評估實體腫瘤的治療效力。
適於本發明的相關性分析包括(但不限於)Cox成比例危險模型(Cox，Journal of theRoyal Statistical Society，Series B 34187(1972))、Spearman秩相關性(Snedecor和Cochran，Statistical Methods(第8版，Iowa State University Press，Ames，Iowa，第503頁，1989))、最近鄰體分析(Golub，等人，Science，286531-537(1999)；和Slonim，等人，Procs.of theFourth Annual International Conference on Computational Molecular Biology，Tokyo，Japan，4月8-11日，第263-272頁(2000))、微陣列顯著性分析(SAM)法(Tusher，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，985116-5121(2001))、支持向量機及人工神經網絡。也可使用其他秩檢驗、生存分析、相關性量度或統計法。
Cox成比例危險模型為最常使用的檢查生存資料的回歸模型。參見，例如Tibshirani，Clinical&Investigative Medicine，563-68(1982)；Allison，Survival Analysis Using the SASSystemA Practical Guide(Gary NCSAS Institute，1995)；及Therneau和Grambsch，Modeling Survival DataExtending the Cox Model(New YorkSpringer，2000)。Cox模型檢查生存與一個或一個以上協變量或預測因子之間的關係。如本文所使用，術語「生存」不限於真正的死亡或生存。實情為術語應廣泛解釋為涵蓋任何時間相關的事件。通常視Cox成比例危險模型比許多其他回歸模型更一般，因為Cox模型並不基於任何關於基本生存分布的性質或形態的假設。Cox模型假設基本危險率隨獨立協變量或預測因子而變化，且不對危險函數的性質或形態進行假設。
Cox成比例危險模型的非限定性實例通過以下等式描述 其中i是個體的下標，且Hi(t)為時間t時的危險且代表時間t時的終點(例如，死亡、疾病進展或另一時間相關的事件)的概率，假定個體生存直到時間t。Xj表示預測因子或協變量，其可為連續(continuous)、二分(dichotomous)或其他有序分類(orderedcategorical)變量。Cox成比例回歸模型假設預測因子的效應隨時間為恆定的。在許多實施例中，Xj代表抗癌治療開始後實體腫瘤患者的外周血細胞(例如，PBMC)中基因j表達水平的變化。其中Xj具有高度偏斜分布，可執行對數轉換來降低極值效應。H0(t)為時間t時的基線危險，且表明當所有獨立協變量都等於0時，各個體的危險。在Cox模型中，未指定基線危險函數。即使缺乏特定的基線危險函數，但仍可(例如)通過部分似然法(method of parial likeihood)估計Cox模型。
等式(1)所描繪的Cox模型為半參數的，因為當基線危險可採用任何形式時，均可估計協變量的係數。考慮x值隨相應線性預測因子而不同的兩個觀察結果i和i′ 和 Hi(t)與Hi′(t)的比率 Hi(t)/Hi′(t)＝[H0(t)exp(PI)]/[H0(t)exp(PI′)]＝exp(PI)/exp(PI′)(4) 與時間t無關。因此，等式(1)中的Cox模型為成比例危險模型。
等式(5)描述單變量Cox模型，其中僅單個預測因子通過Cox回歸加以評定 Hi(t)＝H0(t)exp(βxi)(5) 危險比率(RR)定義為exp(β)，其代表預測因子一個單位變化的事件(例如，死亡或疾病進展)的相對風險。在許多應用中，PBMC表達值表現為以2為底的對數，且一個單位變化對應於雙重表達。危險比率的自然對數產生係數β。當使用S-Plus或R程序包時，危險比率RR可使用程序包中的「coxph」函數產生。
在單變量Cox分析中，小於1的危險比率指示係數β為負。結果，預測因子的值的增加產生降低的事件(例如，死亡或疾病進展)瞬時風險。相反地，預測因子的值的減小產生較高的事件瞬時風險。同樣地，大於1的危險比率暗示係數β為正。因此，預測因子的值的增加(或減小)產生較高(或較低)的事件瞬時風險。
作為非限定性實例，當係數β為負時，與預測因子χi′相比預測因子xi的增加產生較低的PI，因此，產生與Hi′(t)相比較低的Hi(t)。參見等式(2)、(3)及(4)，其中k＝1。相反地，xi的減小產生與Hi′(t)相比較高的Hi(t)。當係數β為正時，xi的增加(或減小)產生與Hi′(t)相比較高(或較低)的Hi(t)。因此，可使用Cox成比例危險模型評估不同個體之間的時間相關事件的相對風險。
一旦擬合Cox模型時，就可使用至少三個假設檢驗評定協變量的統計顯著性。這些檢驗為似然比檢驗(likelihood ratio test)、Wald檢驗和計分檢驗(score test)。在許多實施例中，通過一種或一種以上用於基因表達從基線的變化與患者結果之間的相關性的這些檢驗所確定的p值為至多0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。本發明的預後性基因的危險比率可小於1，諸如至多0.5、0.33、0.25、0.2、0.1或更低。基因的危險比率也可大於1，諸如至少2、3、4、5、10或更大。小於1的危險比率指示實體腫瘤患者的外周血細胞中基因表達水平的增加暗示患者的良好預後，而大於1的危險比率暗示患者的外周血細胞中基因表達水平的增加指示患者的不良預後。
本發明也涵蓋使用多變量Cox模型使實體腫瘤患者的外周血基因表達變化與臨床結果相關。各多變量Cox模型包括兩個或兩個以上協變量或預測因子，且各協變量代表抗癌治療期間實體腫瘤患者的外周血細胞(例如，PBMC)中預測因子基因表達水平的變化。在許多實施例中，表達水平的變化從基線起度量。也可將不同協變量間的相互作用引入模型中。
可在多變量模型中檢驗對單變量分析為顯著(例如，具有至多0.05、0.01、0.005、0.001或更低的p值)的預測因子。在一實例中，使用正向逐步選擇法(forward stepwiseselection)選擇用於多變量分析的預測因子。舉例來說，可首先將對單變量分析為單一最顯著的預測因子輸入多變量模型中，接著輸入次最顯著的預測因子等等。在一些情況下，在不損害模型的預測性能的情況下，使用降維法(dimension reduction method)(諸如主成分分析(principal component analysis)或分片逆回歸(sliced inverse regression))潛在減少多變量模型中的預測因子的數目。
可利用多種電腦程式進行Cox回歸分析。這些程序的實例包括(但不限於)S-Plus、SAS或SPSS程序包。參見，例如Allison，Survival Analysis Using the SAS SystemAPractical Guide(Gary NCSAS Institute，1995)；和Therneau，A Package for SurvivalAnalysis in S(Technical Report，www.mayo.edu/hsr/people/therneau/survival.ps，MayoFoundation，1999)。
也可使用修改的Cox模型。舉例來說，可將分層因子引入Cox模型中以允許變量各級之間存在非成比例的危險。可使用殘差發現預測因子的修正函數形式，鑑別通過模型不良預測的個體或評定成比例危險假設。另外，可通過修改的Cox模型分析隨時間變化的協變量、時間依賴性係數、多個/相關觀察結果或多個時標。也可使用處罰Cox模型(Penalized Cox model)或脆弱模型(frailty model)。
本發明的特徵也在於使用其他相關法或統計法鑑別外周血基因表達變化與患者結果之間的相關性。這些方法包括(但不限於)加權投票(weighted voting)(Golub，等人，Science，286531-537(1999))、支持向量機((Su，等人，CANCER Research，617388-93(2001))、K-最鄰近法(K-nearest neighbor)(Ramaswamy，等人，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA，9815149-15154(2001))、相關係數(van′tVeer，等人，NATURE，415530-536(2002))或其他合適模式識別程序。
可根據本發明加以評估的實體腫瘤治療的實例包括(但不限於)藥物療法(例如，CCI-779療法)、化學療法、激素療法、放射療法、免疫療法、手術、基因療法、抗血管生成療法、姑息療法或其他常規或非常規療法或其任何組合。符合本發明的實體腫瘤包括(不限於)RCC、前列腺癌、頭/頸癌、卵巢癌、睪丸癌、腦腫瘤、乳癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮頸癌、子宮癌、肝癌或其他不具有血液或淋巴細胞起源的腫瘤。可使用直接或間接觀測進程評估實體腫瘤的狀況或進展。合適觀測法包括(但不限於)掃描(諸如X射線(X-ray)、計算機化軸向層面X射線攝影法(computerized axial tomography)(CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging)(MRI)、電子發射斷層掃描(positron emission tomography)(PET)或超聲波掃描術(ultrasonography)(U/S))、活檢、觸診、內窺鏡檢查、腹腔鏡檢查或所屬領域的技術人員了解的其他合適方法。
可通過大量標準評定實體腫瘤的臨床結果。在許多實施例中，基於患者對治療性治療的反應度量臨床結果。時間相關的臨床結果量度的實例包括(但不限於)疾病進展時間(TTP)、死亡時間(TTD或生存)、完全反應時間、部分反應時間、微小反應時間、疾病穩定時間或其組合。
TTP是指治療開始的日期到度量疾病進展的第一天之間的間隔。TTD是指治療開始的日期到死亡時間之間的間隔。完全反應、部分反應、微小反應、疾病穩定或疾病進展可使用(不限於)WHO報導標準(WHO Reporting Criteria)，諸如WHO公開案第48號(World Health Organization，Geneva，Switzerland，1979)所述的標準加以評估。以此標準，在每次評定中度量一維或二維可度量的病變。當多個病變存在於任一器官中時，那麼可選擇多達6個(如果可用)代表性病變。
在許多情況下，「完全反應」(CR)定義為通過兩次相隔不少於4周的觀察判定所有可度量且可評估的疾病完全消失。不存在新的病變且不存在疾病相關症狀。「部分反應」(PR)在提及二維可度量疾病時意謂通過2次相隔不少於4周的觀察判定所有可度量的病變的最大垂直直徑的乘積的和減少至少約50％。「部分反應」在提及一維可度量疾病時意謂通過2次相隔不少於4周的觀察判定所有病變的最大直徑的和減少至少約50％。就部分反應來說，不必所有病變均退回至合格狀態，但任何病變均不應進展且不應出現任何新的病變。評定應為客觀的。「微小反應」在提及二維可度量疾病時意謂所有可度量的病變的最大垂直直徑的乘積的和減少約25％或更多但減少小於約50％。「微小反應」在提及一維可度量疾病時意謂所有病變的最大直徑的和減少至少約25％但小於約50％。
「疾病穩定」(SD)在提及二維可度量疾病時意謂所有可度量的病變的最大垂直直徑的乘積的和減少小於約25％或增加小於約25％。「疾病穩定」在提及一維可度量疾病時意謂所有病變的直徑的和減少小於約25％或增加小於約25％。不應出現任何新的病變。「疾病進展」(PD)是指至少一個二維(最大垂直直徑的乘積)或一維可度量病變的尺寸增加大於或等於約25％或出現新的病變。如果通過陽性細胞學證實出現胸膜積液或腹水，那麼也視為疾病進展。病理性骨折或骨骼斷裂不一定證明疾病進展。
在一非限定性實例中，根據表1判定一維和二維可度量疾病的總體個體腫瘤反應。
表1總體個體腫瘤反應 舉例來說，在以下情形中可評定非可度量疾病的總體個體腫瘤反應 a)總體完全反應如果存在非可度量疾病，那麼其應完全消失。否則，個體不能視為「總體完全反應者」。
b)總體進展在非可度量疾病的尺寸顯著增加或出現新的病變的情況下，總體反應將進展。
就相關性研究來說，實體腫瘤患者可基於其各自的臨床結果分等級。其也可使用傳統的臨床風險評定法分等級。在許多情況下，這些風險評定法使用若干將實體腫瘤患者分為不同預後或風險群組的預後性因子。這些方法的一個實例為用於RCC的Motzer風險評定，描述於Motzer，等人，J Clin Oncol，172530-2540(1999)中。不同風險群組中的患者對療法可具有不同反應。
可使用多種類型的外周血樣鑑別外周血基因表達變化與患者結果之間的相關性。適於此目的的外周血樣包括(但不限於)全血樣或包含高濃度PBMC的樣品。「高濃度」意謂樣品中PBMC的百分率比全血中的高。在許多情況下，高濃度樣品中的PBMC百分率比全血中的高至少1、2、3、4、5或更多倍。在許多其他情況下，高濃度樣品中的PBMC百分率為至少90％、95％、98％、99％、99.5％或更高。含高濃度PBMC之血樣可通過使用諸如菲科爾梯度離心(Ficoll gradients centrifugation)或CPT(細胞純化管(cellpurification tube))的所屬領域中已知的任何方法加以製備。
本發明中所使用的外周血樣可在抗癌治療之前、期間或之後的任何時候加以分離。舉例來說，外周血樣可在治療性治療之前分離。這些樣品在本文中稱為「基線」或「預處理」樣品。這些樣品中的基因表達分布在本文中稱為「基線」或「預處理」分布。另一實例，外周血樣可在抗癌治療開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周從實體腫瘤患者中分離。也可使用其他時間間隔來製備血樣。
在許多實施例中，基因表達變化通過度量抗癌治療開始後特定時間的基因表達分布與基線表達分布之間的改變來確定。也可使用不為基線的參考時間點。
外周血基因表達變化可使用全基因表達分析加以評估。適於此目的的方法包括(但不限於)核酸陣列(諸如cDNA或寡核苷酸陣列)、蛋白質陣列、雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳/質譜及其他高通量核苷酸或多肽檢測技術。
核酸陣列允許一次定量檢測大量基因的表達水平。核酸陣列的實例包括(但不限於)來自Affymetrix(Santa Clara，CA)的Genechip微陣列、來自Agilent Technologies(PaloAlto，CA)的cDNA微陣列及美國專利第6,288,220號和第6,391,562號中所述的微珠陣列。
待與核酸陣列雜交的聚核苷酸可用一或多個標記部分加以標記以允許檢測雜交的聚核苷酸複合體。標記部分可包括通過光譜法、光化學法、生物化學法、生物電子法、免疫化學法、電法、光學法或化學法可檢測的組合物。例示性標記部分包括放射性同位素、化學發光化合物、經標記的結合蛋白、重金屬原子、諸如螢光標記以及染料的光譜標記、磁標記、聯結酶、質譜標記、自旋標記、電子轉移供體和受體等。也可使用未經標記的聚核苷酸。聚核苷酸可為DNA、RNA或其經修飾形式。
雜交反應可以完美雜交或差異雜交格式執行。在完美雜交格式中，使由一個諸如抗癌治療期間的特定時間自實體腫瘤患者分離的外周血樣的樣品製備的聚核苷酸與核酸陣列雜交。形成雜交複合體後所檢測到的信號指示樣品中的聚核苷酸水平。在差異雜交格式中，用不同標記部分標記由兩個生物樣品(諸如一個來自所關注的患者和另一來自參考患者)製備的聚核苷酸。將這些經不同標記的聚核苷酸的混合物添加到核酸陣列中。然後，在來自不同標記的發射可個別檢測的條件下檢查核酸陣列。在一個實施例中，使用螢光團Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)作為差異雜交格式的標記部分。
可使用諸如由Affymetrix或Agilent Technologies提供的軟體的市售軟體分析從核酸陣列收集的信號。雜交實驗中可包括諸如掃描靈敏性、探針標記及cDNA/cRNA定量的對照。在許多實施例中，在核酸陣列表達信號經受進一步的分析之前，使其按比例調整或歸一化。舉例來說，當在相似檢驗條件下使用一個以上陣列時，可使各基因的表達信號歸一化以考慮雜交強度的改變。也可使用源自各陣列上所包含的內標歸一化對照的強度使個別聚核苷酸複合體雜交的信號歸一化。另外，可使用在所有樣品中具有相對一致的表達水平的基因使其他基因的表達水平歸一化。在一個實施例中，使基因的表達水平在所有樣品中歸一化以致平均值為0且標準偏差為1。在另一實施例中，使通過核酸陣列所檢測到的表達資料經受排除展示所有樣品中最小或可忽略改變的基因的改變過濾器。
II.鑑別RCC預後性基因 RCC包含所有腎癌病例中的大部分且在工業化國家中為十大最常見癌症之一。晚期RCC的5年生存率小於5％。RCC通常通過成像方法檢測，30％明顯非轉移性患者經受手術後復發且最終死於疾病。新近表達分布研究已證明原發性惡性腫瘤的轉錄分布根本地由相應正常組織的轉錄分布改變而來(請參見Slonim，Pharmacogenomics，2123-136(2001))。詳細檢查RCC腫瘤轉錄分布的特異性微陣列研究(Young，等人，Am.J.Pathol.，1581639-1651(2001))已鑑別許多等級的在正常腎組織與原發性RCC腫瘤之間變化的基因。
已為診斷有RCC的患者開發出數個預後性因子和計分指數，典型例子為數個關鍵指標的多變量評定。一個實例為Motzer風險評定計分，其使用5個由Motzer，等人，J ClinOncol，172530-2540(1999)提出的預後性因子，即Karnofsky身體狀況評分、血清乳酸脫氫酶、血紅蛋白、血清鈣及先前存在/不存在腎切除。可基於各自的Motzer風險評定計分將RCC患者分為良好、中等或不良預後等級。
本發明的特徵在於用於RCC的預後的替代基因標誌。RCC患者的外周血細胞中這些基因的表達水平在CCI-779療法期間發生變化，且這些與基線表達水平的變化的量值與諸如TTP或TTD的臨床結果的連續量度相關。
CCI-779為mTOR通路的小分子抑制劑，其當前在腫瘤學領域中的多種適應症中及諸如多發性硬化症之適應症中作為細胞生長抑制劑經受評估。CCI-779為免疫抑制雷帕黴素(rapamycin)的酯類似物且其本身為雷帕黴素的哺乳動物標靶的有效的選擇性抑制劑。雷帕黴素的哺乳動物標靶(mTOR)會激活包括p70s6激酶的磷酸化的多個信號傳輸通路，此導致編碼涉及翻譯和進入細胞周期G1期的蛋白質的5′TOP mRNA的翻譯的增加。歸因於CCI-779對mTOR及細胞周期控制的抑制效應，其充當細胞生長抑制劑和免疫抑制劑。
用25mg、75mg或250mg CCI-779靜脈內(IV)輸液每周一次地治療111位晚期RCC患者(34位女性和77位男性)直到證明疾病進展。進一步分析一45位患者(18女性和27位男性)子組的基因表達結果。將這45位患者的RCC腫瘤在臨床場所分類為常規(透明細胞)癌(24)、顆粒狀(1)、乳頭狀(3)或混合亞型(7)。10個腫瘤分類為未知的。RCC患者主要是高加索人血統(Caucasian descent)(44位高加索人、1位美裔非洲人)且平均年齡為58歲(在40-78歲範圍內)。納入標準包括先前已接受晚期疾病的療法或先前尚未接受晚期疾病的療法但不是接受高劑量IL-2療法的適當候選者的組織學上確認為晚期腎癌的患者。其他納入標準包括具有以下特徵的患者(1)疾病的二維可度量的證據；(2)進入研究之前證明疾病進展；(3)年齡在18歲或更大；(4)ANC＞1500/μL，血小板＞100,000/μl且血紅蛋白＞8.5g/dL；(5)由血清肌酸酐＜1.5×正常值上限證明腎功能足夠；(6)由膽紅素＜1.5×正常值上限和AST＜3×正常值上限(或如果存在肝轉移，那麼AST＜5×正常值上限)證明肝功能足夠；(7)血清膽固醇＜350mg/dL，三酸甘油酯＜300mg/dL；(8)ECOG身體狀況評分0-1；以及(9)至少12周的預期壽命。排除標準包括具有以下特徵的患者(1)存在已知CNS轉移；(2)給藥開始3周內進行手術或放射療法；(3)給藥開始4周內進行RCC化學療法或生物療法；(4)給藥開始4周內用先前研究劑治療；(5)免疫受損的狀況，包括那些已知HIV為陽性或接受包括皮質類固醇的免疫抑制劑的同時使用的患者；(6)主動感染；(7)需要抗痙攣療法治療；(8)危急生命的心律失常治療6個月內/或正在進行過程中存在不穩定的絞痛/心肌梗塞；(9)在過去3年裡有先前惡性腫瘤病史；(10)對大環內脂類抗菌素過敏；以及(11)懷孕或任何其他大體上將增加與參與研究相關的風險的疾病。試驗整段時間內以每周一次30分鐘的靜脈內輸液所投與的三種劑量(25mg、75mg或250mg)中的一種的CCI-779治療所選擇的RCC患者。
治療之前及CCI-779療法開始後每8周記錄殘餘、復發性或轉移性疾病的臨床病期及尺寸。腫瘤尺寸以釐米度量且報導為最長直徑與其垂直直徑的乘積。可度量疾病定義為通過CT掃描、X射線或觸診這兩個直徑均大於1.0cm的任何二維可度量病變。腫瘤反應通過所有可度量病變的乘積的和加以判定。指定臨床反應的類別由臨床方案定義給出(亦即，疾病進展、疾病穩定、微小反應、部分反應及完全反應)。也使用以Motzer風險評定指定的預後的類別(良好對中等對不良)。在45位RCC患者中，6位指定為良好風險評定，17位患者擁有中等風險計分且22位患者收到不良預後等級。除分類等級外，也監測總生存及疾病進展時間作為臨床終點。
在CCI-779療法之前及治療開始後每8周從RCC患者的外周血分離PBMC。由所分離的PBMC製備核酸樣品且根據製造商指南使其與HG-U95A基因晶片(Affymetrix，Santa Clara，CA)雜交。參見GeneChipExpression Analysis-Technical Manual(第701021部分，第1修訂本，Affymetrix，Inc.1999-2001)，其整體內容以引用的方式併入本文中。通過MAS 4算法由探針強度計算信號，且使用如實例中所述的尺度頻率歸一化法(scalefrequency normalization method)將信號強度轉化為頻率。
為鑑別與患者結果相關的PBMC中轉錄水平的特異性改變，使用考慮臨床結果量度的檢查效應的Cox成比例危險回歸以將結果建立為Log2轉換的表達水平的函數(以ppm為單位)的模型。對已通過最初過濾標準的5,469個合格者中的每一個均執行兩個臨床結果量度TTP和TTD的Cox回歸分析(整個資料集至少1個「存在」呼叫，及至少一個＞10ppm頻率的轉錄物；參見實例3)。在Cox成比例危險分析中，與各轉錄物相關的危險比率指示良好或非良好結果的似然性，其中小於1的危險比率指示增加協變量的水平的風險較低且大於1的危險比率指示風險較高。
對各轉錄物和結果量度來說，計算危險比率且計算假設危險比率等於1(亦即，無風險)的Wald p值。就5個I型(亦即，假陽性)誤差水平，計算對各結果量度所執行的5,469個檢驗中名義上顯著的檢驗的數目。為調整5,469個檢驗不獨立的事實，然後使用基於排列的方法評估所觀察到的顯著性檢驗的數目將在無風險的零假設下出現的頻率。
Cox成比例危險回歸模型適於評定通過HG-U95AAffymetrix微陣列度量的基因表達水平與臨床結果之間的聯繫。使用來自在基線、8周及16周樣品中通過最初過濾標準的5,469個合格者中的每一個的表達水平擬合模型(所有樣品至少1個「存在」呼叫及至少一個＞10ppm頻率的轉錄物)。就其與從基線成比例頻率之變化的聯繫，檢驗兩個臨床量度TTD和TTP。基於Log2轉換的成比例頻率值計算從基線的變化，且計算基線後8周和16周的變化。
臨床結果與從基線表達水平的變化的比較結果，8周的變化概述於表2A和2B中，且16周的變化概述於表3A和3B中。臨床結果與從基線基因表達的變化之間的聯繫的證據對16周的兩個結果變量來說更有力。
表2A.8周從基線Log2轉換的頻率變化的TTD臨床結果的Cox成比例危險回歸的排列結果(n＝30位患者) *就5,469個基因來說(通過「至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm」過濾) 表2B.8周從基線Log2轉換的頻率變化的TTP臨床結果的Cox成比例危險回歸的排列結果(n＝30位患者) *就5,469個基因來說(通過「至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm」過濾) 表3A.16周從基線Log2轉換的頻率變化的TTD臨床結果的Cox成比例危險回歸的排列結果(n＝22位患者) *就5,469個基因來說(通過「至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm」過濾) 表3B.16周從基線Log2轉換的頻率變化的TTP臨床結果的Cox成比例危險回歸的排列結果(n＝22位患者) *就5,469個基因來說(通過「至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm」過濾) 表4A和4B提供PBMC中的20個例示性基因，其具有就TTP來說各自與低風險(危險比率＜1.0)或高風險(危險比率＞1.0)相關的16周轉錄水平變化。表5A和5B列出PBMC中的20個例示性基因，其具有就TTD來說各自與低風險(危險比率＜1.0)或高風險(危險比率＞1.0)相關的16周轉錄水平變化。表6提供這些基因的註解。
表4A.展示與TTP顯著相關的16周變化的經CCI-779治療的患者的RCCPBMC中的20個例示件基因 (16周時表達增加暗示進展的良好預後) 表4B.展示與TTP顯著相關的16周變化的經CCI-779治療的患者的RCC PBMC中的20個例示性基因 (16周時表達增加暗示進展的不良預後) 表5A.展示與TTD顯著相關的16周變化的經CCI-779治療的患者的RCC PBMC中的20個例示性基因 (16周時表達增加暗示生存的良好預後) 表5B.展示與TTD顯著相關的16周變化的經CCI-779治療的患者的RCC PBMC中的20個例示性基因 (16周時表達增加暗示生存的不良預後) 表6.RCC預後性基因的註解 表4A、4B、5A和5B中的各合格者代表HG-U95A基因晶片上的寡核苷酸探針組合。通過合格者鑑別的基因的RNA轉錄物可在核酸陣列雜交條件下與合格者的至少一個寡核苷酸探針(PM或完美匹配探針)雜交。較佳地，基因的RNA轉錄物在核酸陣列雜交條件下不與PM探針的錯配探針(MM)雜交。除錯配探針中心處或附近的單一同數取代外，MM探針與相應PM探針相同。對25-基體的PM探針來說，MM探針在第13個位置處具有同數鹼基變化。
在許多情況下，通過合格者鑑別的基因的RNA轉錄物可在核酸陣列雜交條件下與這一合格者的PM探針的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％雜交，但不與其相應MM探針雜交。在許多其他情況下，如由相應探針對的雜交強度差(亦即，PM-MM)與總雜交強度(亦即，PM+MM)的比率所度量，這些PM探針的每一個的差別計分(R)為至少0.015、0.02、0.05、、0.2、0.3、0.4、0.5或更高。又在許多其他情況下，通過合格者鑑別的基因的RNA轉錄物可在例如臨界值Tau為0.015且顯著性水平α1為0.4的基因晶片的默認設置值下產生「存在」呼叫。參見GeneChipExpression Analysis-DataAnalysis Fundamentals(第701190部分，第2修訂本，Affymetrix，Inc.2002)，其整體內容以引用的方式併入本文中。
HG-U95A基因晶片上各PM探針的序列和從其得到PM探針的相應靶序列可獲自Affymetrix序列資料庫。參見，例如www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx？product＝hgu133。所有這些PM探針序列和其相應靶序列均以引用的方式併入本文中。
表4A、4B、5A及5B中所列的各基因和相應單一基因ID以及Entrez入藏登記號根據HG-U95A基因晶片註解確定。單一基因包含非冗餘集合的定向基因簇。認為各單一基因簇包括代表單一基因的序列。表4A、4B、5A及5B中所列的基因的其他信息可基於相應單一基因ID或Entrez入藏登記號獲自美國國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)(Bethesda，MD)的Entrez資料庫。
由HG-U95A合格者鑑別的基因也可通過對人類基因組序列資料庫BLAST檢索合格者的靶序列來判定。適於此目的的人類基因組序列資料庫包括(但不限於)NCBI人類基因組資料庫。NCBI提供諸如「blastn」的BLAST程序用於檢索其序列資料庫。在一個實施例中，通過使用合格者的靶序列的明確片段(例如，最長明確片段)進行NCBI人類基因組資料庫的BLAST檢索。將由合格者代表的基因鑑別為那些與明確片段具有顯著序列一致性的基因。在許多情況下，所鑑別的基因與明確片段的序列一致性至少為95％、96％、97％、98％、99％或更高。
如本文所使用，表4A、4B、5A及5B中由合格者代表的基因不僅包括那些其中明確描述的基因，而且包括那些表格中未列出但能夠與表格中的合格者的PM探針雜交的基因。所有這些基因均可用作用於RCC或其他實體腫瘤的預後的生物標誌。
上述分析使用Cox成比例危險回歸鑑別與臨床結果TTP和TTD的連續量度相關的RCC患者的PBMC中(從基線水平)8或16周的轉錄水平的變化。排列分析指示16周變化與臨床結果TTP和TTD之間存在顯著聯繫，但8周PBMC轉錄變化與這些臨床結果之間存在不太顯著的聯繫。
PBMC中的轉錄變化似乎「滯後」CCI-779暴露的發現受到極大關注，因為其支持以下理論CCI-779療法後PBMC中的轉錄改變反映外周血的循環細胞對腫瘤變化的反應而非通過血液中的CCI-779指導轉錄改變。這一理論解釋16周PBMC轉錄水平的變化與臨床結果更顯著地相關的觀察結果，因為實現血液中CCI-779的穩態水平與PBMC對腫瘤變化的反應之間會存在滯後。因此，可使用根據本發明鑑別的轉錄物作為藥物功效的早期藥物基因組學指標。應注意，在大部分轉錄物中，其與16周的臨床結果的顯著聯繫的方向與8周的一致，但顯著性低，此暗示8周PBMC中的轉錄模式與16周的顯示類似趨勢，但與所關注的臨床結果的顯著聯繫與16周不同。
在顯示與疾病進展顯著負面相關的增加的轉錄物中(亦即，當16周表達的增加值升高時，PBMC轉錄物與RCC患者中的越發更短的TTP相關)，存在數個所關注的觀察結果。與跳躍易位斷點編碼的轉錄物同源的兩個獨立序列在具有更短TTP的患者的PBMC中增加。另外，20個與疾病進展負面相關的例示性轉錄物(表4B)中的三個編碼涉及真核翻譯開始和延伸的因子。這些真核翻譯相關因子的鑑別受到關注，因為歸因於CCI-779抑制mTOR通路，其最終抑制哺乳動物翻譯。
跳躍易位斷點蛋白JTB在具有快速進展時間的患者的PBMC分布中16周時急劇增加。正常蛋白編碼高度保守的膜轉運體蛋白，跳躍易位現象後，此產生缺乏跨膜域的截斷蛋白(Hatakeyama，等人，Oncogene，182085-2090(1999))。在20個16周時增加與快速疾病進展顯著相關的轉錄物中，鑑別對應於這一轉錄的兩個獨立合格者(表4B中的41833_at和41834_g_at)。這一發現暗示這些患者中的總染色體組不穩定性可出現於PBMC的替代組織中，因為RCC患者的PBMC中所度量的表達水平未必反映源自在血液中循環的轉移性腎癌細胞的任何轉錄(Twine，等人，CANCER Res.，636069-6075(2003))。
就生存來說，在具有更短死亡時間的患者中，大量編碼核糖體蛋白的轉錄物增加。展示編碼核糖體蛋白的轉錄物的表達水平與數個研究中的淋巴細胞含量強烈相關(數據未展示)。因為淋巴細胞在具有較短TTP與較長TTP的患者之間無差異分布(數據未展示)，所以隱含療法約4個月後，循環淋巴細胞中的轉錄激活可能不良預示RCC患者的總生存。因此，可使用循環淋巴細胞反應指示RCC患者中的不良預後。
預示其他時間相關臨床事件的基因也可使用與Cox成比例危險模型組合的探針陣列加以鑑別。抗癌治療期間實體腫瘤患者的外周血細胞中的這些基因的表達水平的變化統計上與患者結果顯著相關。
III.RCC或其他實體腫瘤的預後 本發明的特徵在於PBMC中的表達分布變化與實體腫瘤患者的臨床結果相關的預後性基因。這些預後性基因可用作RCC或其他實體腫瘤的預後的替代標誌。其也可用作CCI-779或其他抗癌藥物的功效的藥物基因組學指標。
可通過本發明評定的臨床終點的實例包括(但不限於)死亡、疾病進展或其他時間相關事件。這些臨床終點的合適量度包括TTP、TTD或其他時間依賴性臨床量度。任何實體腫瘤或抗癌治療均可根據本發明加以評估。
一方面，所關注的患者的預後涉及以下步驟 檢測抗癌治療開始後所關注的患者的外周血細胞(例如，PBMC)中的一個或一個以上預後性基因的表達水平的變化；和 比較所檢測的變化與參考變化。
抗癌治療開始後，預後性基因各具有改變的表達水平，且罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的患者的PBMC中的這一改變的量值與這些患者的臨床結果相關。因此，在所關注的患者中檢測到的變化預示患者的臨床結果。
所關注的患者的基因表達變化可從任何參考點起度量，且在適當相關模型(例如，Cox模型或諸如最近鄰體分析的基於等級的相關性量度)下，罹患相同實體腫瘤的患者中從某點起度量的表達水平的變化與這些患者的臨床結果相關。在許多實施例中，所關注的患者的預後性基因的表達水平的變化通過度量抗癌治療開始後特定時間所關注的患者的外周血中基因表達水平與預後性基因的基線表達水平之間的改變來判定。
可選擇確定所關注的患者的基因表達變化所使用的特定時間以使此段時間所度量的變化與患者結果之間在排列分析下存在顯著相關性。排列分析評估所觀察到的顯著性檢驗的數目將在無風險的零假設下出現的頻率。在一實例中，選擇特定時間以使預定α置信水平(例如，0.05、0.01、0.005或更低)下名義上顯著相關的數目等於或超過所觀察到數目的排列百分率低於10％、5％、1％、0.5％或更低。在一非限定性實例中，特定時間為抗癌治療開始後至少16周。也可使用抗癌治療開始後小於16周的時間，諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周。
在許多實施例中，所關注的患者的預後所使用的參考變化為參考患者的基因表達變化。參考患者罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的抗癌治療。參考患者也可為Cox成比例危險模型或另一相關模型所使用的「虛擬」患者。參考變化可使用與所關注的患者的相同或相當的方法來確定。所關注的患者的變化與參考變化之間的差值暗示所關注的患者與參考患者相比的相對預後。參考變化和所關注的患者的變化可同時或相繼確定。
在一個實施例中，所關注的患者與參考患者均罹患RCC且這兩種患者接受相同抗癌治療(例如，CCI-779療法)。所關注的患者和參考患者的基因表達的變化通過度量治療開始後特定時間(例如，16周)各患者的外周血細胞中的一個或一個以上預後性基因的表達水平與預後性基因的基線表達水平之間的改變來確定。在Cox成比例危險模型下，接受相同抗癌治療的RCC患者的PBMC中的這些改變的量值與這些患者的臨床結果相關。
當預後性基因具有大於1的危險比率時，與參考患者相比所關注的患者的外周血細胞中較高的基因表達水平變化指示與參考患者相比所關注的患者的較差預後。相反地，與參考患者相比，所關注的患者的較小變化指示所關注的患者的較佳預後。
當預後性基因具有小於1的危險比率時，與參考患者相比所關注的患者的外周血細胞中較高的基因表達水平變化指示所關注的患者的較佳預後。相反地，所關注的患者的較小變化指示所關注的患者的較差預後。
適於此目的的預後性基因包括(但不限於)表4A、4B、5A及5B中所描繪的那些基因。選自表4A和4B中的基因可用於評定所關注的患者的相對TTP，而選自表5A和5B中的基因可用於評估所關注的患者的相對TTD。
也可使用其他預後性基因。在許多實施例中，本發明中所使用的各預後性基因展示抗癌治療(例如，CCI-779療法)開始後RCC患者的PBMC中表達水平的變化與這些患者的臨床結果之間的統計上顯著的相關性。在許多情況下，這一相關性的p值為至多0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。預後性基因的危險比率可為至多0.5、0.33、0.25、0.2、0.1或更低。危險比率也可為至少2、3、4、5、10或更高。
在許多實施例中，所關注的患者的預後所使用的參考變化具有經驗上或實驗上確定的值。如果所關注的患者的表達水平變化大於或小於經驗上或實驗上確定的值，那麼視所關注的患者具有不良或良好預後。舉例來說，當預後性基因具有小於1(或大於1)的危險比率時，所關注的患者的外周血細胞中基因的表達水平從基線的變化超過經驗上確定的值的觀察結果預示所關注的患者的良好(或不良)預後。
在一個實施例中，經驗上或實驗上確定的值代表抗癌治療開始後特定時間參考患者的外周血細胞(例如，PBMC)中預後性基因的表達水平與基線表達水平之間的平均變化。用於此目的的合適平均法包括(但不限於)算術平均、調和平均、絕對值平均、log轉換值平均或加權平均。參考患者罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療。在許多情況下，參考患者包含具有類似預後(例如，良好、中等或不良預後)的患者。
本發明的特徵在於使用單變量或多變量Cox模型以用於所關注的患者的預後。單變量Cox分析(例如，等式(5))提供一個預測因子一個單位變化的時間相關事件(例如，死亡或疾病進展)的相對風險。在許多實施例中，預測因子代表抗癌治療開始後實體腫瘤患者的外周血細胞中預後性基因的表達水平的變化。如上所述，可選擇將所關注的患者劃分到處於臨界值的不同預後群組中，其中具有臨界值以上的表達水平變化的患者具有較高風險，且具有臨界值以下的表達水平變化的患者具有較低風險，或反之亦然，視基因是不良(RR＞1)還是良好(RR＜1)預後的指標而定。另外，模型擬合可提供基線危險H0(t)或係數β的估計，從而能夠更定量地評定所關注的患者的臨床結果。由單變量Cox分析鑑別的預後性基因可個別或組合用於所關注的患者的預後。
在多變量Cox模型(例如，等式(1))中，可使用線性預測因子PI作為所關注的患者預後的風險指數。在許多情況下，多變量Cox模型可通過將各個別基因逐步輸入模型中來建立，其中所輸入的第一基因係預選自那些具有顯著單變量p值的基因，且選擇用於在各隨後步驟輸入模型中的基因為最佳改進模型對資料的擬合的基因。
可用訓練集(training set)計算風險指數值的分布從而確定適當的割點來區分高風險和低風險。可檢查割點的連續統。使用風險指數函數和訓練集中所估計的高/低風險割點，可計算各檢驗實例的風險指數值且用於將所關注的患者指定為高或低風險群組。
在許多實施例中，預測所關注的患者的臨床結果的精度(亦即，正確呼叫與正確和不正確呼叫的總和的比率)為至少50％、60％、70％、80％、90％或更高。臨床結果預測的效力也可通過靈敏性和特異性度量。在許多實施例中，本發明中所使用的預後性基因的靈敏性和特異性為至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。此外，基於外周血的預後可與其他臨床證據組合以提高最終臨床結果預測的精度。
可使用多種血樣類型確定所關注的患者或參考患者的基因表達變化。適於此目的血樣的實例包括(但不限於)全血樣品或包含高濃度PBMC的樣品。也可使用其他血樣，且患者結果與這些血樣的基因表達變化之間存在統計上顯著的相關性。
大量方法可用於檢測所關注的血樣中的基因表達水平。舉例來說，基因的表達水平可通過度量基因的RNA轉錄的水平來確定。出於此目的的合適方法包括(但不限於)定量RT-PCT、RNA印跡法(Northern Blot)、原位雜交、狹縫印跡(slot-blotting)、核酸酶保護分析或核酸陣列(包括微珠陣列)。基因的表達水平也可通過度量基因所編碼的多肽的水平來確定。出於此目的的合適方法包括(但不限於)免疫分析(諸如ELISA、RIA、FACS或蛋白印跡(Western Blot))、雙向凝膠電泳(2-dimensional gelelectrophoresis)、質譜或蛋白質陣列。
一方面，通過度量外周血樣中基因的RNA轉錄水平來確定預後性基因的表達水平。可使用多種方法將RNA從外周血樣中分離。例示性方法包括異硫氰酸胍/酸酚法、TRIZOLReagent(Invitrogen)或Micro-FastTrackTM 2.0或FastTrackTM 2.0mRNAIsolation Kits(Invitrogen)。所分離的RNA可為總RNA或mRNA。所分離的RNA可擴增到cDNA或cRNA，隨後檢測或定量。擴增可為特異性的或非特異性的。合適的擴增方法包括(但不限於)逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、等溫擴增、連接酶鏈反應及Qβ複製酶。
在一個實施例中，擴增方案使用逆轉錄酶。可使用逆轉錄酶及由寡聚d(T)和編碼噬菌體T7啟動子的序列組成的引物將所分離的mRNA逆向轉錄為cDNA。所產生之cDNA為單鏈。使用與分解DNA/RNA雜合體的核糖核酸酶(RNase)組合的DNA聚合酶合成cDNA的第二條鏈。雙鏈cDNA合成後，添加T7RNA聚合酶且然後從雙鏈cDNA的第二條鏈轉錄cRNA。可通過與經標記的探針雜交檢測或定量擴增的cDNA或cRNA。擴增過程期間也可標記cDNA或cRNA且然後檢測或定量。
在另一實施例中，可使用定量RT-PCR(諸如TaqMan，ABI)檢測或比較所關注的預後性基因的RNA轉錄水平。定量RT-PCR涉及將RNA逆轉錄(RT)為cDNA，接著相對定量PCR(RT-PCR)。
在PCR中，擴增的靶DNA的分子數目每個反應周期增加近兩倍直到某試劑變得有限。此後，擴增速率變得逐漸減弱直到周期之間不存在擴增靶的增加。如果以周期數為X軸且擴增靶DNA的濃度log為Y軸作曲線圖，那麼通過連接作圖點可形成具有特徵形態的曲線。從第一周期起，線的斜率為正且為恆定的。此稱為曲線的線性部分。某試劑變得有限後，線的斜率開始減小且最終變為0。此時，擴增靶DNA的濃度變得漸近某一固定值。此稱為曲線的平坦部分。
PCR的線性部分中靶DNA的濃度與PCR開始之前靶的起始濃度成比例。通過測定已完成相同周期數且處於線性範圍內的PCR反應中的靶DNA的PCR產物的濃度，有可能確定原始DNA混合物中特異性靶序列的相對濃度。如果DNA混合物為由從不同組織或細胞分離RNA所合成的cDNA，那麼可測定各組織或細胞的從其得到靶序列的特異性mRNA的相對豐度。在PCR反應的線性範圍部分，PCR產物的濃度與相對mRNA豐度之間確實成正比例關係。
曲線平坦部分中靶DNA的最終濃度通過反應混合物中可用的試劑來確定且與靶DNA的原始濃度無關。因此，在一個實施例中，當PCR反應處於其曲線的線性部分時，進行擴增PCR產物的取樣及定量。另外，可使可擴增的cDNA的相對濃度歸一化為某可基於內部存在的RNA物質或外部引入的RNA物質的獨立標準物。特定mRNA物質的豐度亦可相對於樣品中所有mRNA物質的平均豐度確定。
在一個實施例中，PCR擴增利用大致與靶一樣豐富的PCR內標物。如果在PCR擴增的線性階段期間取樣其產物，那麼這一策略有效。如果當反應接近平坦階段時，取樣產物，那麼不太豐富的產物可能變得相對過量。許多不同RNA樣品的相對豐度的比較以使所呈現的RNA的相對豐度的差值小於實際上的差值的方式變得不正常，當就差異表達檢查RNA樣品時通常就是這樣。如果內標物比靶豐富得多，那麼此可改進。如果內標物比靶豐富，那麼可進行RNA樣品之間的直接線性比較。
臨床樣品的固有問題在於其具有可變的數量或質量。如果用內標物執行相對定量RT-PCR，那麼這一問題可得以克服，其中內標物為比靶cDNA片段大的可擴增的cDNA片段且其中編碼內標物的mRNA的豐度比編碼靶的mRNA高約5-100部。這一分析度量相對豐度，而不是各自mRNA物質的絕對豐度。
在另一實施例中，相對定量RT-PCR使用外標物方案。在這一方案中，在PCR產物擴增曲線的線性部分取樣PCR產物。各靶cDNA片段的取樣最佳PCR周期數可憑經驗確定。另外，從各種樣品分離的各RNA群的逆轉錄酶產物可歸一化為等濃度的可擴增cDNA。雖然經驗確定cDNA製劑的擴增曲線和歸一化的線性範圍是冗長且耗時的過程，但在某些情況下，所得RT-PCR分析可能優於那些源自用內標物相對定量RT-PCR的分析。
在又一實施例中，可使用核酸陣列(包括微珠陣列)檢測或比較所關注的預後性基因的表達分布。核酸陣列可為商業寡核苷酸或cDNA陣列。其也可為包含用於本發明的預後性基因的濃探針的定製陣列。在許多實例中，本發明的定製陣列上至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的總探針為用於RCC或其他實體腫瘤預後性基因的探針。這些探針可在嚴格或核酸陣列雜交條件下與相應預後性基因的RNA轉錄物或其補體雜交。
如本文所使用，「嚴格條件」至少與(例如)表6中所展示的條件G-L一樣嚴格。「高度嚴格條件」至少與表6中所展示的條件A-F一樣嚴格。雜交在雜交條件(雜交溫度和緩衝液)下進行約4小時，接著在相應洗滌條件(洗滌溫度和緩衝液)下進行兩次20分鐘的洗滌。
表6.嚴格條件 1雜合體長度為雜交聚核苷酸的雜交區所預期的長度。當將聚核苷酸與未知序列的靶聚核苷酸雜交時，假定雜合體長度為雜交聚核苷酸的長度。當雜交已知序列的聚核苷酸時，雜合體長度可通過比對聚核苷酸的序列且鑑別具有最佳序列互補性的區加以確定。
H雜交和洗滌緩衝液中，可用SSPE(1×SSPE為0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA(pH 7.4))代替SSC(1×SSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)。
TB*-TR*預期長度小於50個鹼基對的雜交的雜交溫度應小於雜合體的熔融溫度(Tm)5-10℃，其中Tm根據以下等式確定。對長度小於18個鹼基對的雜合體來說，Tm(℃)＝2(A+T鹼基的#)+4(G+C鹼基的#)。對長度在18個與49個鹼基對之間的雜合體來說，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+]+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N為雜合體中鹼基的數目，且[Na+]為雜交緩衝液中鈉離子的摩爾濃度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。
在一實例中，本發明的核酸陣列包括至少2、5、10或更多個不同探針。這些探針中的每一個均能夠在嚴格或核酸陣列雜交條件下與本發明的各個不同預後性基因(例如，選自表4A、4B、5A和5B的基因)雜交。可使用相同預後性基因的多個探針。核酸陣列的探針密度可在任何範圍內。
本發明的預後性基因的探針可為DNA、RNA、PNA或其經修飾形式。各探針中的核苷酸殘基可為天然存在的殘基(諸如脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸、脫氧鳥苷酸、脫氧胸苷酸、腺苷酸、胞苷酸、鳥苷酸及尿苷酸)或能夠形成想要的鹼基對關係的合成產生的類似物。這些類似物的實例包括(但不限於)氮和去氮嘧啶類似物、氮和去氮嘌呤類似物和其他雜環鹼基類似物，其中嘌呤和嘧啶環的一個或一個以上碳和氮原子經諸如氧、硫、硒及磷的雜原子取代。類似地，探針的聚核苷酸主鏈可為天然存在的(諸如通過5′到3′的鍵)或經修飾的。舉例來說，核苷酸單元可經由諸如5′到2′的鍵的非典型鍵連接，只要鍵不幹擾雜交。另一實例，可使用肽核酸，其中構成鹼基通過肽鍵而非磷酸二酯鍵結合。
預後性基因的探針可與核酸陣列上的離散區穩定連接。「穩定連接」意謂雜交和信號檢測期間探針相對於所連接的離散區保持其位置。核酸陣列上各離散區的位置可為已知的或可測定的。可使用所屬領域中已知的任何方法製造本發明的核酸陣列。
在另一實施例中，可使用核酸酶保護分析定量外周血樣中的RNA轉錄水平。存在許多不同版本的核酸酶保護分析。這些核酸酶保護分析的共同特徵在於其涉及使反義核酸與待定量的RNA雜交。然後用分解單鏈核酸比分解雙鏈分子更有效的核酸酶分解所得的雜交雙鏈分子。分解生存的反義核酸的量為待定量的靶RNA物質的量的量度。合適核酸酶保護分析的實例包括由Ambion，Inc.(Austin，Texas)提供的核糖核酸酶保護分析。
本發明的預後性基因的雜交探針或擴增引物可通過使用所屬領域中已知的任何方法製備。對染色體組位置尚未確定或一致性僅基於EST或mRNA資料的預後性基因來說，這些基因的探針/引物可源自相應合格者的靶序列或相應EST或mRNA序列。
在一個實施例中，預後性基因的探針/引物顯著偏離其他預後性基因的序列。此可通過對照諸如NCBI的Entrez資料庫的人類基因組序列資料庫檢查潛在探針/引物序列來實現。適於此目的的一種算法為BLAST算法。這一算法涉及首先通過在詢問序列中鑑別長度W的短字來確定高計分序列對(HSP)，當短字與資料庫序列中的相同長度的字比對時，匹配或符合某個正值臨界值計分T。T稱作鄰近字計分臨界值。最初鄰近字匹配充當引發尋找含有其的更長HSP的檢索的開端。然後沿各序列雙向延伸字匹配以增加累積比對計分。對核苷酸序列使用參數M(一對匹配殘基獲得計分；總＞0)和N(錯配殘基處罰計分；總＜0)計算累積計分。BLAST算法參數W、T及X確定比對的靈敏性和速度。如所屬領域的技術人員所了解，這些參數可隨不同目的而調整。
另一方面，通過度量預後性基因所編碼的多肽的水平確定本發明的預後性基因的表達水平。適於此目的的方法包括(但不限適於)免疫分析(諸如ELISA、RIA、FACS、點印跡、蛋白印跡)、免疫組織化學及基於抗體的放射成像。另外，可使用高產量蛋白定序、雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、質譜或蛋白陣列。
在一個實施例中，使用ELISA檢測靶蛋白的水平。在例示性ELISA中，將能夠與靶蛋白結合的抗體固定在所選擇的展示蛋白親和性的表面上，諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯微量滴定板的孔。然後，將待測試的樣品添加到孔中。結合且洗滌以移除非特異性結合的免疫複合體後，可檢測所結合的抗原。檢測可通過添加對靶蛋白具有特異性且與可檢測標記聯結的第二抗體實現。檢測也可通過添加第二抗體，接著添加對第二抗體具有結合親和性的第三抗體實現，其中第三抗體與可檢測標記聯結。在樣品中的細胞添加到微量滴定板之前，可將其溶解或萃取以從潛在性幹擾物質中分離靶蛋白。
在另一例示性ELISA中，將懷疑含有靶蛋白的樣品固定於孔表面上且然後與抗體接觸。結合且洗滌以移除非特異性結合的免疫複合體後，檢測所結合的抗原。當最初抗體與可檢測標記聯結時，可直接檢測免疫複合體。也可使用對第一抗體具有結合親和性的第二抗體檢測免疫複合體，其中第二抗體與可檢測標記聯結。
另一例示性ELISA涉及在檢測中使用抗體競爭。在這一ELISA中，將靶蛋白固定在孔表面。將經標記的抗體添加到孔中，使其與靶蛋白結合且藉助於其標記檢測。然後，通過在與塗布孔一起培養之前或期間將樣品與標記抗體混合測定未知樣品中靶蛋白的量。未知樣品中的靶蛋白的存在作用於減少可與孔結合獲得的抗體的量，且從而降低最終信號。
不同ELISA格式可具有某些共同特徵，諸如塗布、培養或結合、洗滌以移除非特異性結合的物質和檢測所結合的免疫複合體。舉例來說，在用抗原或抗體塗布板期間，可將板的孔與抗原或抗體溶液一起培養整夜或數小時的特定時間。然後，洗滌板的孔以移除不完全吸附的物質。然後，用對測試樣品來說為抗原性中性的非特異性蛋白「塗布」孔的任何剩餘可用表面。這些非特異性蛋白的實例包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白及奶粉溶液。塗布可阻斷固定表面上的非特異性吸附部位且因此降低由表面上抗血清的非特異性結合引起的本底(background)。
在ELISA中，可使用第二或第三檢測方法。在蛋白或抗體與孔結合，用非反應性物質塗布以降低本底，以及洗滌以移除未結合的物質後，使固定表面與待測試的對照或臨床或生物樣品在有效允許免疫複合體(抗原/抗體)形成的條件下接觸。這些條件可包括(例如)用諸如BSA、牛γ球蛋自(BGG)及磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/Tween的溶液稀釋抗原和抗體，以及在室溫下將抗體和抗原培養約1到4小時或在4℃培養整夜。通過使用經標記的第二結合配位體或抗體或第二結合配位體或抗體與經標記的第三抗體或第三結合配位體的組合使得免疫複合體的檢測變得方便。
緊跟著ELISA中所有培養步驟，可洗滌接觸表面以移除非複合的物質。舉例來說，可用諸如PBS/Tween或硼酸酯緩衝液的溶液洗滌表面。測試樣品與最初結合的物質之間形成特異性免疫複合體且隨後洗滌後，可測定存在的免疫複合體的量。
為提供檢測方法，第二或第三抗體可具有相關標記以允許檢測。在一個實施例中，標記為與適當發色底物一起培養後產生顯色的酶。因此，例如，使第一或第二免疫複合體與尿素酶、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶或過氧化氫酶結合的抗體接觸且將兩者可在有利於進一步形成免疫複合體的條件下一起培養一段時間(例如，在室溫下在諸如PBS-Tween的含PBS的溶液中培養2小時)。
在與經標記的抗體一起培養且隨後洗滌以移除未結合的物質後，可(例如)通過與諸如尿素和溴甲酚紫或2，2′-疊氮基-二-(3-乙基)-苯並噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和H2O2(在過氧化酶的情況下，作為酶標記)的發色底物一起培養來定量標記的量。可通過(例如)使用分光光度計度量所產生的色度實現定量。
適於檢測多肽水平的另一方法為RIA(放射免疫分析)。例示性RIA基於經放射性標記的多肽與未標記的多肽之間與有限數量的抗體結合的競爭。合適的放射性標記包括(但不限於)I125。在一個實施例中，將固定濃度的經I125標記的多肽與一系列對多肽具有特異性的抗體的稀釋液一起培養。當將未標記的多肽添加到系統中時，與抗體結合的I125多肽的量減少。因此，可構造標準曲線以代表隨未標記的多肽的濃度變化的抗體結合的I125多肽的量。由這一標準曲線，可確定未知樣品中多肽的濃度。執行RIA的方案在所屬領域中為熟知的。
本發明的合適抗體包括(但不限於)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人化抗體、單鏈抗體、Fab片段或通過Fab表達庫產生的片段。也可使用中和抗體(亦即，那些抑制二聚體形成的抗體)。製備這些抗體的方法在所屬領域中為熟知的。在一個實施例中，本發明的抗體可與相應預後性基因產物或其他想要的抗原以至少104M-1、105M-1、106M-1、107M-1或更高的結合親和性結合。
本發明的抗體可用一個或一個以上可檢測部分標記以允許檢測抗體-抗原複合體。可檢測部分可包括可通過光譜法、酶法、光化學法、生物化學法、生物電子法、免疫化學法、電法、光學法或化學法檢測的組合物。可檢測部分包括(但不限於)放射性同位素、化學發光化合物、經標記的結合蛋白、重金屬原子、諸如螢光標記以及染料的光譜標記、磁標記、聯結酶、質譜標記、自旋標記、電子轉移供體和受體等等。
本發明的抗體可用作構造檢測預後性基因的表達分布的蛋白陣列的探針。製造蛋白陣列或生物晶片的方法在所屬領域中為熟知的。在許多實施例中，本發明的蛋白陣列上的探針的本質部分為對預後性基因產物具有特異性的抗體。舉例來說，蛋白陣列上的至少10％、20％、30％、40％、50％或更多探針可為對預後性基因產物具有特異性的抗體。
又一方面，通過度量這些基因的生物功能或活性來確定預後性基因的表達水平。當已知預後性基因的生物功能或活性時，可開展合適的活體外或活體內分析來評估這一功能或活性。接著，可使用這些分析來評定預後性基因的表達水平。
本發明中所使用的基因表達水平可為絕對水平、歸一化水平或相對水平。合適的歸一化進程包括(但不限於)那些常規核酸陣列分析中所使用的進程或那些由Hill等人在Genome Biol，2research0055.1-0055.13(2001)中所述的進程。在一實例中，使表達水平歸一化以致平均值為0且標準偏差為1。在另一實例中，使表達水平基於內部或外部對照歸一化。在又一實例中，使表達水平相對於一個或一個以上在血樣中具有已知豐度的對照轉錄物歸一化。在許多實施例中，使用相同或相當的方法學確定用於評定所關注的患者和參考患者的基因表達變化的表達水平。
本發明的特徵也在於適用於RCC或其他實體腫瘤的預後的電子系統。這些系統包括用於接收或計算所關注的實體腫瘤患者的基因表達變化和參考表達變化的輸入或計算裝置。參考表達變化也可存儲在資料庫或另一媒體中，且可通過本發明的電子系統取回。所關注的患者的基因表達變化與參考表達變化之間的比較可諸如通過處理器或計算機來電子化執行。在許多實施例中，系統也包括或能夠從另一資源(例如，網際網路伺服器)下載的一個或一個以上程序，諸如Cox模型、k-最近鄰體分析或加權投票算法。這些程序可用於比較所關注的患者的基因表達變化與參考變化，或用於使實體腫瘤患者的基因表達變化與這些患者的臨床結果相關。在一實例中，本發明的電子系統耦連於核酸陣列以接收或處理由陣列所產生的表達資料。
又一方面，本發明提供適用於RCC或其他實體腫瘤的預後的試劑盒。各試劑盒包括至少一個用於RCC或實體腫瘤預後性基因(例如，選自表4A、4B、5A或5B的基因)的探針或大體上由其組成。也可包括有助於試劑盒使用的試劑或緩衝液。本發明中可使用任何類型的探針，諸如雜交探針、擴增引物、抗體或其他高親和性結合劑。
在一個實施例中，本發明的試劑盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個聚核苷酸探針或引物或大體上由其組成。可使各探針/引物在嚴格或核酸陣列雜交條件下與不同實體腫瘤預後性基因(諸如選自表4A、4B、5A或5B的那些基因)雜交。如本文所使用，如果聚核苷酸可與基因的RNA轉錄物或其補體雜交，那麼聚核苷酸可與基因雜交。
在另一實施例中，本發明的試劑盒包括一個或一個以上抗體或大體上由其組成，其中各抗體均能夠與由不同實體腫瘤預後性基因(諸如，那些選自表4A、4B、5A或5B的基因)編碼的多肽結合。
本發明中所使用的探針可經標記或未標記。經標記的探針可通過光譜法、光化學法、生物化學法、生物電子法、免疫化學法、電法、光學法、化學法或其他合適方法檢測。用於探針的例示性標記部分包括放射性同位素、化學發光化合物、經標記的結合蛋白、重金屬原子、諸如螢光標記以及染料的光譜標記、磁標記、聯結酶、質譜標記、自旋標記、電子轉移供體和受體等。
本發明的試劑盒也可具有含有緩衝液或報導基因構件的容器。另外，試劑盒可包括執行陽性或陰性對照的試劑。在一個實施例中，本發明中所使用的探針穩定地與一個或一個以上底物支撐物連接。核酸雜交或免疫分析可直接在底物支撐物上進行。出於此目的的合適底物支撐物包括(但不限於)玻璃、二氧化矽、陶瓷、尼龍、石英晶片、凝膠、金屬、紙、微珠、管、纖維、膠片、膜、管柱基質或微量滴定板孔。在許多實施例中，本發明的試劑盒中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多的總探針為用於實體腫瘤預後性基因的探針。
另一方面，本發明的特徵在於使用羅吉斯回歸、ANOVA(方差分析)、ANCOVA(協方差分析)、MANOVA(方差多重分析)或其他用於所關注的患者的實體腫瘤的預後的相關法或統計法。這些方法包含 檢測抗癌治療期間特定時間所關注的患者的外周血細胞中至少一個實體腫瘤預後性基因的表達水平；和 將表達水平輸入相關模型或統計模型中以確定所關注的患者的預後。
相關模型或統計模型定義罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的患者的PBMC中實體腫瘤預後性基因的表達水平與這些患者的臨床結果之間的統計上顯著的相關性。在許多實例中，相關模型或統計模型能夠產生所關注的患者的臨床結果的定性預測(例如，良好或不良預後)。適合此目的的統計模型或分析包括(但不限於)羅吉斯回歸或基於等級的相關性量度。在許多其他實例中，相關模型或統計模型能夠產生所關注的患者的臨床結果的定量預測(例如，估計TTD或TTP)。適於這一目的的統計模型或分析包括(但不限於)多種回歸、ANOVA或ANCOVA模型。
用於建立相關模型/統計模型或預測所關注的患者的表達水平可為從基線或從相應患者治療開始後另一特定參考時間點起度量的相對表達水平。也可使用絕對表達水平建立相關模型/統計模型或預測所關注的患者。在後一種情況中，可使用基線或另一特定參考時間的表達水平作為預測模型中的協變量。
IV.抗癌治療功效的評估 本發明允許個性化治療RCC或其他實體腫瘤。可在抗癌治療期間預測所關注的患者。良好的預後指示治療可繼續，而不良預後暗示治療可停止且應使用不同方法治療患者。這一分析幫助患者避免不必要的不利反應。此也提供改進的安全性和增加的治療效益/風險比。
在一個實施例中，在CCI-779療法期間預測所關注的RCC患者。適於此目的的預後性基因包括(但不限於)表4A、4B、5A及5B中所描繪的那些基因。所關注的患者的外周血細胞中這些預後性基因的表達水平的變化可通過使用RT-PCR、ELISA、核酸陣列、蛋白陣列、蛋白質功能分析或其他合適方法確定。將這些變化與參考變化比較以確定所關注的患者的預後。良好預後指示CCI-779治療適用於所關注的RCC患者。
任何類型的抗癌治療均可由本發明評估。在一個非限定性實例中，抗癌治療為藥物療法。抗癌藥物的實例包括(但不限於)細胞激素，諸如幹擾素或介白素2；和化學療法藥物，諸如CCI-779、AN-238、長春鹼(vinblastine)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶或他莫昔芬(tamoxifen)。AN238為具有與生長抑素(SST)載劑八肽連接的2-吡咯啉並阿黴素(2-pyrrolinodoxorubicin)的細胞毒素劑。AN238可標靶RCC腫瘤細胞表面上的SST受體。化學療法藥物可個別使用或與其他藥物、細胞激素或療法組合使用。另外，也可使用單克隆抗體、抗血管生成藥物或抗生長因子藥物治療RCC或其他實體腫瘤。
抗癌治療也可為手術。適用於RCC的手術選擇包括(但不限於)根治性腎切除術(radical nephrectomy)、部分腎切除(partial nephrectomy)、轉移的移除(removal ofmetastases)、動脈栓塞術(arterial embolization)、腹腔鏡腎切除術(laparoscopicnephrectomy)、刀冷凍術(cryoablation)和保留腎單位手術(nephron-sparing surgery)。此外，可使用放射、基因療法、免疫療法、過繼性免疫療法或其他常規或實驗療法治療實體腫瘤。
應了解上述實施例及其後實例以說明的方式而非限定性方式給出。由本發明說明書，本發明的範疇內的多種變化和修改對所屬領域的技術人員來說將變得顯而易見。
V.實例 實例1.PBMC和RNA的純化 在CCI-779療法開始之前及療法8或16周後從RCC患者收集全血。將血樣抽取到CPT Vacutainer細胞製備管(Cell Preparation Vacutainer Tube)(Becton Dickinson)中。對各樣品來說，目標體積為8ml。根據製造商的方案(Becton Dickinson)經菲科爾梯度(Ficoll gradient)分離PBMC。將PBMC小球存儲在-80℃下直到加工樣品用於RNA。
使用QIA切碎機和Qiagen Rneasy迷你試劑盒執行RNA純化。將樣品採集在含0.1％β-巰基乙醇的RLT溶解緩衝液(Qiagen，Valencia，CA，USA)中且使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)加工用於總RNA分離。使用96孔板UV讀數器在A260/280下監測來定量洗脫的RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳以2％瓊脂糖凝膠核對RNA的質量(波段為18S和28S)。將剩餘RNA存儲在-80℃下直到加工用於Affymetrix基因晶片雜交。
實例2.RNA擴增和基因晶片雜交探針的產生 使用Lockhart等人在NATURE Biotechnology，141675-1680(1996)中所述的程序的修正製備寡核苷酸陣列的經標記的靶。使用在5′末端含有T7DNA聚合酶啟動子的寡聚-d(T)24引物使2微克總RNA轉化為cDNA。將cDNA用作模板用於使用T7DNA聚合酶試劑盒(Ambion，Woodlands，TX，USA)和經生物素標記的CTP和UTP(Enzo，Farmingdale，NY，USA)活體外轉錄。使經標記的cRNA在94℃下在40mM Tris-乙酸鹽(pH 8.0)、100mM KOAc、30mM MgOAc中以40mL的最終體積成為碎片歷時35分鐘。將10微克經標記的靶以具有100mg/mL鯡魚精DNA和50mg/mL乙醯化BSA的IX MES緩衝液稀釋。為相對彼此歸一化陣列且估計寡核苷酸陣列的靈敏性，如Hill等人在Genome Biol.，2research0055.1-0055.13(2001)中所述，在各雜交反應中包括11個細菌基因的活體外合成轉錄物。這些轉錄物的豐度以每總轉錄物的對照轉錄物的數目為單位陳述在1∶300000(3ppm)到1∶1000(1000ppm)範圍內。如這些對照轉錄物的信號反應所判定，陣列的檢測靈敏性介於每百萬份2.33與4.5複本之間的範圍內。
使經標記的序列在99℃下變性5分鐘且然後在45℃下變性5分鐘且與由大量人類基因組成的寡核苷酸陣列(HG-U95A或HG-U133A，Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)雜交。在以60rpm旋轉下，使陣列在45℃下雜交16小時。雜交後，移出且存儲雜交混合物，洗滌陣列且使用GeneChip Fluidics Station 400用抗生蛋白鏈菌素R-藻紅素(分子探針(Molecular Probe))染色且按照製造商的說明書用Hewlett Packard GeneArrayScanner掃描。這些雜交及洗滌條件共同稱為「核酸陣列雜交條件」。
實例3.基因表達頻率的測定和表達資料的處理 使用Affymetrix MicroArray Suite軟體(MAS)處理陣列圖像以使用MAS的桌面版本將通過陣列掃描機產生的原始陣列圖像資料(.dat)文件變為探針特徵水平的強度概述(.eel文件)。使用基因表達資料系統(GEDS)作為圖形用戶界面，用戶提供表達分布信息和知識系統(EPIKS)奧雷克爾資料庫(Oracle database)的樣品描述且使修正.eel文件與描述相關聯。資料庫處理然後調用MAS軟體產生探針集概述值；對各探針集使用Affymetrix Average Difference算法和Affymetrix Absolute Detection量度(不存在、存在或臨界)概述每次信息的探針強度。也使用MAS通過將截尾均值調整為值100首過歸一化。資料庫處理也會計算一系列晶片質量控制量度且將所有原始資料和質量控制計算值存儲於資料庫中。
使用MAS軟體(Affymetrix)以原始螢光強度值執行數據分析和不存在/存在呼叫測定。通過基於與本底相比的基因信號的強度估計樣品中是否檢測到轉錄物由MAS軟體計算「存在」呼叫。使用成比例頻率歸一化法(Hill，等人，Genome Biol，2research0055.1-0055.13(2001))使各轉錄物的「平均差」值歸一化為「頻率」值，其中使用示蹤於各雜交溶液中的具有已知豐度的11個對照cKNA的平均差值產生總校正曲線。然後，使用這一校正將所有轉錄物的平均差值轉化為在1∶300,000(約百萬分之3(ppm))到1∶1000(1000ppm)範圍內的以百萬分之幾為單位陳述的頻率估計值。歸一化將各晶片的平均差值歸為由示蹤於各雜交溶液中的具有已知豐度的11個對照轉錄的平均差值所構造的校正曲線。在許多情況中，歸一化法利用截尾均值歸一化，接著擬合遍及所有晶片的匯集標準曲線，這一曲線用於計算「頻率」值和每晶片的靈敏性估計。所得量度稱為成比例頻率且在所有陣列之間歸一化。
由資料比較排除並不具有任何相關信息的基因。在無疾病PBMC與RCC PBMC的比較中，此使用兩個資料簡化過濾器實現1)從資料集中移除所有GeneChip中呼叫為不存在(如由MAS中的Affymetrix Absolute Detection量度所判定)的任何基因；2)從資料集中移除所有GeneChip中以＜10ppm的歸一化頻率表達的任何基因以確保分析集中所保留的任何基因以至少10ppm的頻率檢測至少一次。執行這些過濾步驟後，分析中的探針集的總數目為5,469。對一些多變量預測分析來說，使用更嚴格的資料簡化過濾器(P為25％且平均頻率＞5ppm)以減小鑑別低水平或不經常檢測到的轉錄物的似然性。
實例4.異常樣品的基於皮爾遜評定(Pearson′s-Based Assessment) 為鑑別異常樣品，使用Splus(5.1版本)計算所有樣品對中的成對皮爾遜相關係數的平方(r2)。具體來說，由表達值的G×S矩陣開始計算，其中G為探針集的總數目且S為樣品的總數目。計算這一矩陣中樣品間的r2值。結果為r2值的對稱S×S矩陣。這一矩陣度量各樣品與分析中的所有其他樣品之間的類似性。因為所有這些樣品均來自根據共同方案採集的人類PBMC，所以通常期望相關係數揭示高度的類似性(亦即，大部分轉錄序列的表達水平在所分析的所有樣品中類似)。為概述樣品的類似性，計算研究中各樣品與其他樣品的所有MAS信號之間的r2值的平均值且在熱圖中作曲線圖以有助於快速觀測。平均值r2的值越接近於1，樣品與分析中的其他樣品越類似。低平均r2值指示樣品的基因表達分布對總基因表達模式來說為「異常值」。異常狀況可指示樣品具有顯著偏離分析中的其他樣品的基因表達分布或樣品的技術質量為低質量。
實例5.臨床研究方案概述 從參與II期研究的20位無疾病志願者(12位女性和8位男性)和45位腎細胞癌瘤患者(18位女性和27位男性)的外周血中分離PBMC。收到臨床研究的藥物基因組學部分的同意書且項目得到參與臨床場所的地方倫理審查委員會(Institutional ReviewBoard)批准。將RCC腫瘤在各場所分類為常規(透明細胞)癌(24)、顆粒狀(1)、乳頭狀(3)或混合亞型(7)。10個腫瘤的分類不能確定。也通過多變量Motzer評定法計分籤署基線PBMC表達分布的藥物基因組學分析的書面同意書的45位患者。加入這一研究的同意的患者中，在這一研究中，6位指定為良好風險評定，17位患者擁有中等風險計分且22位患者收到不良預後分類。
用CCI-779的三種劑量(25mg、75mg或250mg)中的一種治療罹患晚期RCC病例的患者，試驗整段時間內每周一次投與30分鐘的CCI-779靜脈內輸液。治療之前及CCI-779療法開始後每8周記錄殘餘、復發性或轉移性疾病的臨床病期及尺寸。腫瘤尺寸以釐米度量且報導為最長直徑與其垂直直徑的乘積。可度量疾病定義為通過CT掃描、X射線或觸診這兩個直徑均大於1.0cm的任何二維可度量病變。腫瘤反應(完全反應、部分反應、微小反應、疾病穩定或疾病進展)通過所有可度量病變的垂直直徑的乘積的和判定。本發明藥物基因組學研究中所使用的兩個主要臨床結果量度為進展時間(TTP)和生存或死亡時間(TTD)。TTP定義為最初CCI-779治療日期到度量疾病進展的第一天或經檢查稱為無進展的最後日期之間的間隔。生存或TTD定義為最初CCI-779治療的日期到死亡時間或經檢查為已知活著的最後日期之間的間隔。
實例6.統計分析 使用Eisen等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，9514863-14868(1998)的進程執行基於表達分布類似性的基因和/或陣列的無監督分級聚類。在這些分析中，僅使用那些經過非嚴格資料簡化過濾器的轉錄物(至少1個存在呼叫，整個資料集中至少1個大於或等於10ppm的頻率)。使表達資料進行log轉換且標準化以使平均值為0且方差為1，且使用具有非中心相關類似性量度的平均聯接聚類法(average linkage clustering)產生分級聚類結果。
為用完全時程鑑別所有CCI-779治療患者中隨時間變化的轉錄物(n＝21)，使用標準ANOVA且計算各時間點(基線、8周、16周)之間的平均倍數變化。
為鑑別展示與臨床結果相關的變化的轉錄物，使用Spearman秩相關性計算各轉錄物的臨床結果的連續量度(TTP和TTD)與從基線到8到16周的基因表達的變化之間的相關性。也使用Cox成比例危險回歸模型用臨床結果的檢查量度(TTP、TTD)評定基線和8或16周之間的基因表達資料的改變。
通過卡普蘭-邁耶分析(Kaplan Meier analysis)評定各組患者的生存資料，且使用Wilcoxon檢驗建立顯著性。
本發明的上述描述提供對本發明的說明和描述，但不希望詳盡本發明或將本發明局限於所揭示的精確實例中。修改和改變可能與以上教示一致或可從本發明的實踐中獲得。因此，應注意本發明的範疇由權利要求書和其等價物界定。
權利要求
1.一種用於所關注的患者的實體腫瘤的預後或評估所關注的患者的實體腫瘤的治療效力的方法，所述方法包含
檢測所關注的患者治療期間所述患者的外周血細胞中至少一個基因的表達水平變化，其中在相關模型下，罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的患者的所述變化與所述患者的臨床結果相關；和
將所關注的患者的所述變化與參考變化加以比較，
其中所關注的患者的所述變化與所述參考變化之間的差值指示所關注的患者的所述實體腫瘤的預後或治療效力。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述相關模型為Cox成比例危險模型(Coxproportional hazards model)。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述實體腫瘤為RCC且所述治療包含CCI-779療法。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所關注的患者的所述變化為所關注的患者的治療開始後特定時間所述患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所關注的患者的外周血細胞中所述至少一個基因的基線表達水平之間的變化，且其中所述參考變化為參考患者的治療開始後所述特定時間時所述參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所述參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的基線表達水平之間的變化，所述參考患者罹患所述實體腫瘤。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述特定時間為所述治療開始後約16周。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述外周血細胞包含全血細胞。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述外周血細胞包含高濃度(enriched)PBMC。
8.根據權利要求4所述的方法，其中所述至少一個基因具有小於1的危險比率，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較大值暗示所關注的患者具有比所述參考患者好的預後，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較小值暗示所關注的患者具有比所述參考患者差的預後。
9.根據權利要求4所述的方法，其中所述至少一個基因具有大於1的危險比率，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較大值暗示所關注的患者具有比所述參考患者差的預後，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較小值暗示所關注的患者具有比所述參考患者好的預後。
10.根據權利要求4所述的方法，其中所述至少一個基因各選自表4A、4B、5A或5B。
11.根據權利要求2所述的方法，其中所述參考變化具有憑經驗或憑實驗確定的值。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述實體腫瘤為RCC，且所述治療包含CCI-779療法，且其中所關注的患者的所述變化為所關注的患者治療開始後特定時間時所述患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所述患者的外周血細胞中所述至少一個基因的基線表達水平之間的變化。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述特定時間為所述治療開始後約16周。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述至少一個基因各選自表4A、4B、5A或5B，且所述外周血細胞包含全血細胞或高濃度PBMC。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所述至少一個基因具有小於1的危險比率，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較大值暗示所關注的患者的良好預後，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較小值暗示所關注的患者的不良預後。
16.根據權利要求12所述的方法，其中所述至少一個基因具有大於1的危險比率，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較大值暗示所關注的患者的不良預後，且與所述參考變化相比所關注的患者的所述變化的較小值暗示所關注的患者的良好預後。
17.根據權利要求12所述的方法，其中所述參考變化為所述參考患者的治療開始後所述特定時間時參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所述參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的相應基線表達水平之間的變化，所述參考患者各罹患所述實體腫瘤。
18.一種用於所關注的患者的實體腫瘤的預後或評估所關注的患者的實體腫瘤的治療效力的方法，所述方法包含
檢測所關注的患者治療期間所述患者的外周血細胞中兩個或兩個以上基因的表達分布變化，其中在相關模型下，罹患相同實體腫瘤且接受與所關注的患者相同的治療的患者的所述變化與所述患者的臨床結果相關；和
將所關注的患者的所述變化與參考變化加以比較，
其中所關注的患者的所述變化與所述參考變化之間的差值指示所關注的患者的所述實體腫瘤的預後或治療效力。
19.一種用於所關注的患者的實體腫瘤的預後或評估所關注的患者的實體腫瘤的治療效力的試劑盒，所述試劑盒包含一個或一個以上用於選自表4A、4B、5A或5B的基因的表達產物的探針。
20.一種鑑別實體腫瘤預後標誌的方法，其包含
在患者抗癌治療期間，檢測所述患者的外周血細胞中基因表達分布的變化，所述患者各罹患所述實體腫瘤；和
在相關模型下，鑑別所述患者的基因的所述變化與所述患者的臨床結果相關。
全文摘要
本發明提供用於實體腫瘤的預後或評估實體腫瘤治療的方法、系統和儀器。實體腫瘤的預後的基因標誌可根據本發明鑑別。抗癌治療開始後，實體腫瘤患者的PBMC中，各基因標誌均具有改變的表達模式，且所述改變的量值與所述患者的臨床結果相關。在一個實施例中，使用Cox成比例危險模型(Cox proportional hazards model)判定CCI-779治療期間RCC患者的臨床結果與所述患者的PBMC中基因表達變化之間的相關性。Cox模型所鑑別的基因的非限定性實例描繪於表4A、4B、5A及5B中。所述基因可用作RCC預後的替代標誌。其也可用作CCI-779或其他抗癌藥物的功效的藥物基因組學指標。
文檔編號G01N33/574GK101120255SQ200680005306
公開日2008年2月6日 申請日期2006年2月17日 優先權日2005年2月18日
發明者麥可·E·布爾奇斯基, 弗雷德裡克·伊默曼, 安德魯·施特拉斯, 納塔莉·C·特溫, 唐娜·斯洛尼姆, 威廉·L·特雷皮奇奧, 安德魯·J·多爾納 申請人:惠氏公司