快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙及其檢測方法
2023-04-26 17:37:06
快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙及其檢測方法
【專利摘要】一種快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙及其檢測方法，樣本墊材質為玻璃纖維膜，金結合物墊含有膠體金抗N端PCT的抗體交聯物；硝酸纖維素膜上的檢測線為包被有固相化的另外一個配對抗PCT降鈣素區域的抗體的T線，控制線為包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線。用滴定管加100微升樣本到樣本墊上；平放靜置2-30分鐘；2分鐘以上，可以進行定性或半定量檢測，對比試劑盒附帶的比色卡，估計降鈣素原含量範圍；或者等待30分鐘，使用專用的免疫層析定量讀數儀，進行定量檢測降鈣素原濃度。其檢測靈敏度達到0.1ng/ml水平；達到國際先進水平。成本低、使用方便、靈敏度高、檢測時間短。
【專利說明】快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，涉及檢測人降鈣素原的快速檢測試紙及膠體金免疫層 析測試法，具體地說是一種應用雙抗體夾心法原理的膠體金免疫層析法實現對人降鈣素原 進行定量檢測的方法。
【背景技術】
[0002] 目前臨床診斷應用最廣泛的是採用進口試劑檢測血清和血漿中的降鈣素原 (PCT)，包括化學發光免疫法（德國羅氏診斷試劑公司）、酶化學發光法（法國生物梅裡埃公 司）和膠體金免疫層析技術（德國Brahms公司）。化學發光免疫法採用抗降鈣素原（PCT) 抗體作為包被抗體，釕（羅氏）或酶（生物梅裡埃）標記的抗pct抗體為示蹤抗體。該檢測 方法建立後，廣泛用於發熱病人是否由於細菌感染的篩查，從而讓臨床醫生制定醫學治療 措施，包括抗生素治療。治療啟動後，降鈣素原（PCT)的檢測有助於判斷治療效果。該方 法靈敏度和特異性高，然而，這類進口試劑盒檢測操作複雜，費時，不宜作為獻血員的篩查， 只能用作確診試驗。同時，這類進口試劑盒測試方法需要特殊設備、操作人員需要專門的操 作技能、一次測試從採樣到孵育、洗板、顯色需要很長的時間，浪費大量人力物力，難以在缺 少設備的邊遠山區、基層醫院、診所開展。
【發明內容】
[0003] 為解決以上問題，方便測試人全血、血清或血漿中降鈣素原（PCT)水平的需求，本 發明提供了一種簡單、可靠、成本低廉、靈敏度高的快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析 試紙及其檢測方法；本檢測方法採用雙抗體夾心法，其抗體的選擇不同於市場上現有試劑 盒的設計，即膠體金標記的抗體採用抗N端PCT的單克隆抗體；而包被用的抗體則採用抗 PCT降鈣素區域的單克隆抗體；
[0004] 為了達到本發明的目的，本發明技術方案如下：一種快速檢測人血降鈣素原膠體 金免疫層析試紙，包括長方體狀盒體、位於盒體內底部的長條形黏貼支架，在黏貼支架上 方從左到右依次黏貼有樣本墊、金結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊；在硝酸纖維素膜上中 間部位從左到右設有一道檢測線和一道控制線；其特點是：所述的樣本墊材質為玻璃纖維 膜，經過主要含Tris、酪蛋白鈉鹽、PVP-10的處理液進行處理過夜；所述的金結合物墊是由 經過含Tris、S-17、牛血清白蛋白等的專用處理液處理過的玻璃纖維膜構成,含有膠體金抗 N端PCT單克隆抗體交聯物；所述的硝酸纖維素膜上的檢測線為包被有固相化的配對的抗 PCT降鈣素區域的單克隆抗體的T線；所述的硝酸纖維素膜上的控制線為包被有羊抗鼠IgG 多克隆抗體的C線。
[0005] -種快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析檢測方法，其特點是：被檢測樣本為 血液，包括人全血、血清或血漿，採用上述快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙，檢 測步驟如下：1)用加樣槍加 l〇〇ul或用滴定管加3滴血液樣本到樣本墊上；2)平放靜置 2-30分鐘；3) 2分鐘後，進行定性或半定量檢測，對比試劑盒附帶的比色卡，估計人全血、血 清或血漿中降鈣素原含量範圍；4)或等待30分鐘，使用專用的免疫層析定量讀數儀，進行 定量檢測人全血、血清或血漿中降鈣素原的濃度。
[0006] 本發明運用膠體金標記鼠單克隆抗N端PCT單克隆抗體，以雙抗體夾心法這一技 術來實現對人全血、血清或血漿中降鈣素原（PCT)的定量檢測。該方法用於測定人全血、 血清或血漿中降鈣素原（PCT)水平。正常人全血、血清或血漿中降鈣素原（PCT)水平低於 0. 05納克/暈升。
[0007] 本發明採用雙抗原夾心法和膠體金免疫層析技術，快速定量檢測人全血、血清或 血漿中的一種或同時幾種因子、抗原、蛋白，可用於炎症等感染類疾病的輔助診斷。本發明 成本低、操作簡便、快速，操作無須大型專門儀器和場所，對操作人員也沒有很高要求，且分 析結果清楚，易於判斷，不受時間和地點限制、靈敏度高、檢測時間短，可以快速檢測人全 血、血清或血漿中降鈣素原（PCT)的濃度，非常適合於在缺少設備的邊遠山區、基層醫院、 診所開展並能滿足家庭或個人在診斷、保健、體檢等方面的運用，甚至可以在床邊進行；結 果可直觀判斷，適合處理個體和批量標本，一般人員按照說明書均可正確操作，並可最大限 度地避免實驗過程中各種因素對結果的影響以及減輕操作人員的勞動強度；其檢測靈敏度 達到0. lng/ml水平。操作簡單便捷、檢測速度快、節省人力物力為特點，正好彌補了化學發 光免疫法的這一不便，使得臨床檢驗甚至可以在床邊進行，只需簡單儀器、設備及不需要復 雜的樣本處理過程，結果立等可取，真正做到了床邊檢驗（P0CT)。並可最大限度地避免實驗 過程中各種因素對結果的影響以及減輕操作人員的勞動強度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008] 圖1是本發明快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙的結構示意圖。
[0009] 圖2是本發明的0. 5-10納克/毫升降鈣素原（PCT)水平的比色卡的標準測試顏 色。根據顏色深淺判斷所測相應蛋白的含量範圍。
【具體實施方式】
[0010] 從圖1、圖2可見，本發明的快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙，包括長 方體狀盒體、位於盒體內底部的長條形黏貼支架，在黏貼支架上方從左到右依次黏貼有樣 本墊、金結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊；在硝酸纖維素膜上中間部位從左到右設有一道 檢測線和一道控制線；所述的樣本墊材質為玻璃纖維膜，經過主要含Tris、酪蛋白鈉鹽、 PVP-10的處理液進行處理過夜；所述的金結合物墊是由經過含Tris、S-17、牛血清白蛋白 等的專用處理液處理過的玻璃纖維膜構成，含有膠體金抗N端PCT單克隆抗體交聯物；所述 的硝酸纖維素膜上的檢測線為包被有固相化的配對的抗PCT降鈣素區域的單克隆抗體的T 線；所述的硝酸纖維素膜上的控制線為包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線。
[0011] 本發明的快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析檢測方法，被檢測樣本為血液， 包括人全血、血清或血漿，採用上述快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙，檢測步驟 如下：1)用加樣槍加 l〇〇ul或用滴定管加3滴血液樣本到樣本墊上；2)平放靜置2-30分 鍾；3) 2分鐘後，進行定性或半定量檢測，對比試劑盒附帶的比色卡，估計人全血、血清或血 漿中降鈣素原含量範圍；4)或等待30分鐘，使用專用的免疫層析定量讀數儀，進行定量檢 測人全血、血清或血漿中降鈣素原的濃度。
[0012] 當將樣本滴入到試紙樣本墊中，樣本通過樣本墊到達金結合物墊，樣本中的PCT 可以結合特異的金標記抗N端PCT抗體，該抗原抗體複合物向著檢測T線區和控制C線區 遷移，PCT-金標記抗體在T線區與配對抗體結合而產生酒紅色顏色。剩餘金標記抗體繼續 向右前移，與固定在控制C線區的羊抗鼠抗體反應而形成第二條酒紅色條帶；根據樣本中 降鈣素原（PCT)濃度，T線顏色從白色到紅色不等。顏色越深表明樣本中降鈣素原（PCT)含 量越多。圖2是比色卡的〈0. 5ng/ml，正常、2ng/ml和10ng/ml降鈣素原（PCT)的標準測試 顏色。
[0013] 膠體金標記的鼠抗人N端PCT單克隆抗體能特異地識別和捕獲待檢樣本中的降鈣 素原（PCT)，然後通過毛細作用移動到達檢測區。在那裡，已經捕獲樣本中PCT的膠體金-抗 體再捕獲檢測T線區中的抗PCT抗體，因此在檢測區形成膠體金酒紅色條帶的顏色會深。如 果樣本中降鈣素原（PCT)含量少，到達檢測T線區的裸露膠體金-抗體就會少，它們可以結 合位於檢測T區的抗降鈣素原（PCT)抗體就少，因此在檢測T線區形成膠體金酒紅色條帶 的顏色越淺，反映樣本中降鈣素原（PCT)含量就越少；反之，在檢測T線區形成膠體金酒紅 色條帶的顏色越深，反映樣本中降鈣素原（PCT)含量就越多。這就是採用夾心法原理的膠 體金免疫層析檢測方法。
[0014] 實施例
[0015] 一、優化鼠抗人N端降鈣素原（PCT)單克隆抗體膠體金結合
[0016] 為了達到檢測降鈣素原（PCT)的目的，我們製作了 3株單克隆抗降鈣素原（PCT) 抗體。用ELISA測試了它的敏感性和特異性。這3株單克隆抗體識別降鈣素原（PCT)的不 同抗原決定簇：N端PCT、降鈣素區域、抗鈣素區域。因為每個決定簇的電荷和疏水性是不同 的，與特異抗體的相互作用受不同因素的影響，如PH，離子強度和其他因素的存在，如化學 物質和蛋白等等。
[0017] 抗體與膠體金的交聯（結合）。抗體與膠體金的結合主要取決於獨立但相關的因 素三個：1)帶負電荷的膠體金與帶正電的蛋白質存在離子吸引力；2)抗體和膠體金表面之 間的疏水親和力；3)蛋白質的胺基酸與膠體金可能的電子和硫原子親和力。每個抗體的親 和特徵受這三個因素的影響，因此，每個抗體與膠體金的親和結合會有所不同。我們調整了 pH值和膠體金的大小來優化抗體結合條件，認為應用25nm膠體金粒子可以達到最佳狀態。 為達到這個目標，我們事先進行了滴定，最後交聯，並純化了該交聯抗體。交聯抗體最好在 蛋白質的等電點附近進行。不同pH值下（pH，7,8,9，10,等等）可用於鑑定蛋白質的等電 點。膠體金交聯的抗體可存放直到下一步使用。
[0018] 二、組裝並優化降鈣素原（PCT)快速檢測試紙
[0019] 本降鈣素原（PCT)快速檢測試紙的基本結構如圖1所示。當試紙條浸入標本，如血 液，該樣本可移動通過樣本墊到達膠體金結合墊。任何標本中降鈣素原（PCT)會特異性地 結合金標記抗體，通過毛細管作用遷移到檢測T線區和控制C線區。根據樣本中不同的降 鈣素原（PCT)濃度，T線的顏色可從白色到酒紅色變化。交聯膠體金-PCT複合物將與在T 線的固定化抗降鈣素原（PCT)抗體結合，而形成酒紅色條帶。T線的顏色反映樣本中降鈣素 原（PCT)的濃度，因此，樣本中降鈣素原（PCT)含量可以通過比較測試T線的顏色來確定。
[0020] 半定量檢測：為達到這一個目的，我們設計了標準比色卡（見圖2)。將T線條帶 與比色卡比較，根據不同的顏色判斷降鈣素原（PCT)的濃度範圍（見圖2)。標準比色卡有 不同色度代表不同的降鈣素原（PCT)濃度：〈0. 5納克/毫升，正常；2納克/毫升和10納克 /毫升三檔，可以用於判斷被檢樣本中降鈣素原（PCT)濃度範圍：〈0. 5納克/毫升，正常； 〈0.5?2納克/毫升，2?10納克/毫升，及大於10納克/毫升。正常人的血液PCT水平 是〈0.05納克/毫升。
[0021] 我們製作的快速檢測試劑盒包括試紙條，由以下幾個部分（見圖1)組成：樣本墊， 金結合物墊，硝酸纖維素膜（NC膜），吸水墊，黏貼支架，外盒。
[0022] 1)樣本墊，材質為玻璃纖維膜，經過樣本墊處理液（主要含Tris、酪蛋白鈉鹽、 PVP-10)處理過夜，樣本墊用於去除樣品中的大顆粒及緩衝檢測系統以保障環境體系中 PCT抗原與特異性抗體交聯。
[0023] 2)金結合物墊，經過專用處理液（含Tris、S_17、牛血清白蛋白等）處理過的玻璃 纖維膜,含有膠體金抗N端PCT抗體交聯物。膠體金標記抗體的確切點樣量需要嚴格測試， 以適合T線顯色檢測PCT，還要使多餘膠體金標記抗體進入C區而顯現顏色。膠體金標記抗 體不足時C區顏色將不會顯示，成為失效條。過量的膠體金標記抗體到達T區可出現假陽 性。
[0024] 3)硝酸纖維素膜（NC膜）。在硝酸纖維素膜劃線的第一個區是T線檢測區，在硝 酸纖維素膜劃線的第二個區是C線控制區。T線和C線在此膜包被成線狀。T線含固相化 的抗PCT降鈣素區域的單克隆抗體，以捕獲膠體金交聯抗體。當PCT-膠體金交聯複合物從 交聯墊以毛細運動到達C線時，該複合物將被羊抗鼠 IgG抗體捕獲，而形成可見的酒紅色條 帶。C線為控制線，以便檢驗檢測系統的有效性。如C線不出線，表明檢驗無效。
[0025] 4)吸水墊為Whatman濾紙，促進樣本層析經過樣本墊、膠體金-抗體結合物墊、硝 酸纖維素膜，到達吸水墊區，以吸收多餘的樣本而完成檢測。
[0026] 5)黏貼支架為PVC支持墊：由薄PVC塑料製成以支撐上述組件。定量檢測：為達 到這一個目的，我們設計了配套的免疫層析定量讀數儀。
[0027] 評估檢測試紙條，包括敏感性、特異性和準確性。檢測試紙條浸入標準濃度的PCT 溶液（0.5-10納克/毫升）以評估其敏感性和特異性。PCT溶液中含有肝素、EDTA、枸櫞酸 鈉、膽紅素、血紅素、膽固醇、甘油三酯和類風溼因子（IR)和蛋白對檢測無幹擾。
[0028] 本發明產品的陽性參考品符合率、重複性、穩定性、批間差、最低檢出量等指標均 符合行業標準。
[0029] 本發明產品的最低檢出量為0. Ing/mL。
[0030] 本發明產品的定性檢測時間為2分鐘，定量檢測時間為30分鐘。
[0031] 最低檢測限：用降鈣素原（PCT)企業標準品進行檢測，最低檢出限應不高於 0.lng/mL 〇
[0032] 特異性：
[0033] 陰性特異性：分別用含C反應蛋白（CRP)、白細胞介素6(IL_6)、人降鈣素 (human calcitonin)、人抗|丐素 （human katacalcin)、人 α 降|丐素基因相關膚（human alpha-calcitonin gene-related peptide，alpha_CGRP)、人 β 降|丐素基因相關膚（human beta-calcitonin gene-related peptide，beta_CGRP)的 Ong/mL PCT 液進行檢測，結果應 均為陰性。
[0034] 陽性特異性：分別用含C反應蛋白（CRP)、白細胞介素6(IL_6)、人降鈣素 (human calcitonin)、人抗I丐素 （human katacalcin)、人 α 降I丐素基因相關膚（human alpha-calcitonin gene-related peptide，alpha_CGRP)、人 β 降I丐素基因相關膚（human beta-calcitonin gene-related peptide，beta_CGRP)的 0.5ng/mL PCT 液進行檢測，結果 應均為陽性。
[0035] 陽性分級與劑量反應曲線
[0036] 取不同濃度的PCT參考品（用PCT陰性血清稀釋的重組人PCT校準品或陽性參考 血清），經配套儀器測定，得到的劑量反應曲線的線性相關係數均r > 0. 950。
[0037] 準確度：參考血清1相對低值測定數值在±20%範圍之內；參考血清2相對高值 測定數值在±20%範圍之內。
[0038] 批內重複性（批內差）：測定同一批產品（n = 10)，觀察用陰性血清稀釋的重組人 PCT校準品或陽性參考血清的PCT液，經配套儀器測定，每個批次的測定數值批內重複性， CV 批內< 30%。
[0039] 批間重複性（批間差）：任意3個批次的產品，觀察用陰性血清稀釋的重組人PCT 校準品或陽性參考血清的PCT液，經配套儀器測定，每次的測定數值CV批間< 20%。
[0040] 加速穩定性試驗：將試紙卡在37°C條件下放置21天後，分別檢測5. 1-5. 6項，檢 測結果應符合各項目的要求。
[0041] 幹擾物試驗：將試紙卡用血紅素（Hemoglobin)、膽紅素（Bilirubin)、甘 油三酯（Triglycerides)、肝素鈉（Heparin)抗凝劑、亞胺培南（Irnipenem)、頭孢 噻月虧（Cefotaxime)、萬古黴素（Vancomycin)、多巴胺（Dopamine)、去甲腎上腺素 (Noradrenalin)、多巴酌·丁胺（Dobutamine)、利尿橫胺（Furosemide)的 0ng/ml PCT 液檢 測，結果應均為陰性。
【權利要求】
1. 一種快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙，包括長方體狀盒體、位於盒體內 底部的長條形黏貼支架，在黏貼支架上方從左到右依次黏貼有樣本墊、金結合物墊、硝酸纖 維素膜、吸水墊；在硝酸纖維素膜上中間部位從左到右設有一道檢測線和一道控制線；其 特徵在於：所述的樣本墊材質為玻璃纖維膜，經過主要含Tris、酪蛋白鈉鹽、PVP-10的處理 液進行處理過夜；所述的金結合物墊是由經過含Tris、S-17、牛血清白蛋白等的專用處理 液處理過的玻璃纖維膜構成，含有膠體金抗N端PCT的抗體交聯物；所述的硝酸纖維素膜上 的檢測線為包被有固相化的抗PCT降鈣素區域的抗體的T線；所述的硝酸纖維素膜上的控 制線為包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線。
2. 根據權利要求1所述的一種快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙，其特徵在 於：所述的T線包被有固相化的抗PCT降鈣素區域的抗體，而金結合物墊中含有膠體金抗N 端PCT的抗體交聯物。
3. 根據權利要求1所述的一種快速檢測人血降鈣素原膠體金免疫層析試紙，其特徵在 於：所述樣本墊材質為玻璃纖維膜，經過主要含Tris、酪蛋白鈉鹽、PVP-10的處理液進行處 理過夜；玻璃纖維膜包被有固相化的抗PCT降鈣素區域的抗體的T線和包被有羊抗鼠IgG 多克隆抗體的C線。
4. 一種快速檢測降鈣素原的膠體金免疫層析方法，其特徵在於：被檢測樣本為血液 (血清、血漿及全血)，採用上述權利要求1至3任意一項所述的快速檢測降鈣素原的膠體金 免疫層析試紙； 1) 用加樣槍加 l〇〇ul或用滴定管加3滴血液樣本到樣本墊上； 2) 平放靜置2-30分鐘； 3) 2分鐘後，進行定性或半定量檢測，對比試劑盒附帶的比色卡，估計降鈣素原含量範 圍； 4) 或等待30分鐘，使用專用的免疫層析定量讀數儀，進行定量檢測降鈣素原的濃度。
【文檔編號】G01N33/577GK104090109SQ201410360291
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】胡曉武 申請人:胡曉武