鼠傷寒沙門氏菌特異性pcr檢測方法
2023-04-27 01:42:01 1
專利名稱：鼠傷寒沙門氏菌特異性pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種禽類及其製品安全檢驗領域的PCR檢測方法及其中的核酸和引物對，具體是一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法。
背景技術：
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙門氏菌致病常見的血清型之一，以嬰幼兒感染最常見，臨床症狀主要為發熱、噁心、嘔吐和腹瀉。該菌為革蘭氏陰性桿菌，屬沙門氏菌B群，不形成芽孢，無莢膜，但有鞭毛。該菌在自然界分布廣泛，在外界環境中抵抗力較強，常溫下可迅速繁殖，耐低溫 、乾燥，不耐熱，對酸、紫外線和各種化學消毒劑均敏感。該菌可分608個噬菌體型，20個不同的生化型，在自然界進化過程中，形成了哥本哈根變種、賓斯變種及0型變種三個變種。該菌的檢測主要依靠傳統的培養方法(參見國標GB/T4789. 4-2008)，該方法需經選擇性增菌培養，並通過生化反應及血清學測試鑑定，雖然結果可靠，但操作複雜，通常要3 5天才能得出檢測結果，不利於及時診斷病因，查找病源，控制病情的蔓延。之後，許多研究學者建立了如螢光抗體技術、免疫磁珠富集法、ELLSA、自動酶聯免疫螢光法、免疫組化、顯色培養基法、DNA探針技術等檢測方法，但在實踐中都有不同程度的局限性。PCR技術具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，逐步應用於沙門氏菌的檢疫之後，對沙門氏菌病診斷和防治工作起到了積極作用。有學者先後以鼠傷寒沙門氏菌fimA、fimY、fliC、fljB等基因為目的基因，對鼠傷寒沙門氏菌進行特異性PCR檢測，但是由於靶位點特異性不強，PCR結果產生假陽性，因而產生判斷困難。另外，有學者根據鼠傷寒沙門氏菌16S DNA、spvC、invB、fimA基因設計4對引物，通過多重PCR方法檢測鼠傷寒沙門氏菌，但與普通PCR相比，多重PCR的成本、實驗技術等要求都相對較高。經對現有技術的文獻檢索發現，尚未發明與本發明的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法、核酸及引物有關的報導。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法。採用本發明的檢測方法檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測時間短，成本低，更加具有實用性，檢測結果特異，結果判定簡單。本發明是通過以下技術方案實現的。本發明設計一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法，包括如下步驟步驟一，根據鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA序列中保守且特異的STM4493基因序列SEQ ID NO 1設計擴增引物對；所述引物對具體為正向引物序列如SEQ ID NO 2所示，反向引物序列如SEQ ID NO 3所示。步驟二，提取樣品DNA，PCR法擴增；PCR檢測體系具體為=IOXPCR反應緩衝液2. 5u L, 25mmol/L 的 Mg2+2. Ou L, 2. 5mmol/L 的 dNTPl. Ou L,5uM 引物對 I u L, Taq 酶 IU，模板溶液0. 5 2 ii L，最後用雙蒸水補至25ii L ;PCR檢測體系擴增參數具體為95°C預變性5min後開始擴增循環，每個循環的程序為95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s ;共35個循環；最後72°C延伸lOmin，降溫至16°C，結束。步驟三，凝膠電泳檢測擴增產物，判斷樣品是否含鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為凝膠電泳檢測擴增產物，紫外燈照射下觀察，若在456bp位置存在單一擴增條帶，則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌；若沒有，則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果採用本發明檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測時間短，檢測成本低；避免了採用傳統鑑定方法操作繁瑣、耗時長、檢出率底、假陽性較多等缺點。同時，本發明可用於檢測某些抗血清不能檢測出的菌株，如抗原不表達的菌株，彌補免疫檢測的缺陷，更具實用性；本發明檢測的靶點具有單一特異性，檢測結果特異，結果判定簡單。
圖I為實施例2中鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價實驗凝膠電泳結果圖；圖2為實施例3中鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法靈敏性評價實驗凝膠電泳結果具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Habor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。實施例I鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法的建立步驟一，設計特異性擴增鼠傷寒沙門氏菌的引物對通過生物信息學分析，從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA序列中篩選出保守且特異的STM4493基因，將之作為檢測鼠傷寒沙門氏菌的靶基因，基因序列如SEQ ID NO : I所示；將STM4493基因DNA序列輸入軟體Primer Premier 5. 0中設計擴增引物對，設置GC%範圍為40% 60%，產物大小範圍為100 500bp，從備選引物對中選擇引物對，引物對序列如下(引物由上海基康生物技術有限公司合成)上遊引物5_』AAATGTGCTTGAGGCGTTAG-3』(SEQ ID NO 2)；下遊引物5_』CGTGCGGCGATGTTAGIT-3』 (SEQ ID NO :3)步驟二，DNA模板製備將鼠傷寒沙門氏菌接菌至IOml的LB液體培養基中，在37°C增菌8h後，取Iml菌液，放入I. 5ml離心管中；12，000r/min離心IOmin,棄上清液,加入200 y L無菌雙蒸水重新懸浮菌體，12，000r/min離心5min,棄上清液,收集菌體。用100 U L無菌雙蒸水重新懸浮菌體，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20°C放置30min。在37°C解凍後，12，000r/min離心5min，取上清液放置-20°C備用。
步驟三，鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法的建立PCR檢測的25iiL反應體系具體為，10XPCR反應緩衝液2. 5iiL，25mmol/L的Mg2+2. Ou L, 2. 5mmol/L 的 dNTPl. Ou L,5uM 引物對 I y L，Taq 酶 1U，模板溶液 I y L，最後用雙蒸水補至25ii L ;PCR檢測體系擴增參數具體為95°C預變性5min ;之後開始擴增循環，每個循環的程序為95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s ;共35個循環；最後72°C延伸IOmin,降溫至16°C,結束。步驟四，結果判定所述判斷具體為取PCR擴增產物5 y L，在2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，在紫外燈照射下進行觀察，如果電泳結果在456bp位置出現單一擴增條帶，則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌；如果電泳結果在456bp位置沒有出現456bp單一擴增條帶，則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。結果取PCR擴增產物5 U L，2%的瓊脂糖凝膠電泳後，紫外燈照射下，在456bp位 置可觀察到單一擴增條帶，說明所建立的PCR能成功檢測出鼠傷寒沙門氏菌。實施例2鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價實驗步驟一，DNA模板製備按照實施例I步驟二分別提取鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)、甲型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi A)、乙型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi B)、丙型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi C)、豬霍亂沙門氏菌(S. Choleraesuls)、雞白痢沙門氏菌(S. Pullorosis)、鴨沙門氏菌(S. Anatis)、雞沙門氏菌(S. Gallinarum)、都柏林沙門氏菌(S. Dublin)、腸炎沙門氏菌(S. Enteritidis)、海德爾堡沙門氏菌(S. Heidelberg)、山夫登堡沙門氏菌(S. Senftenberg)基因組 DNA 模板。步驟二，鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價試驗按照實施例I步驟三中PCR反應體系，取步驟一中製備各菌株的DNA模板I ii L作為PCR反應模板分別添加到PCR反應體系中，空白對照以I U L的無菌雙蒸水為模板；然後按照實施例I步驟三中PCR循環參數進行PCR擴增反應。步驟三，結果判定取PCR擴增產物5 y L，在2 %的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，在紫外燈照射下進行觀察，若電泳結果在456bp位置出現單一擴增條帶，則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌；若出現在456bp位置沒有出現456bp單一擴增條帶，則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。結果圖I及表I為鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價實驗凝膠電泳結果。
RsiI-M
Salmonella Typhimurium50115-13I+
Salmonella choleraesulsASI. 1190I一
Salmonella Paratyphi AATCC 9150I-
Salmonella Paratyphi BCMCC 50004I-
Salmonella Paratyphi CCMCC 50118I-
權利要求
1.一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一，根據鼠傷寒沙門氏菌全基因組DNA序列中保守且特異的STM4493基因序列SEQID NO :1設計擴增引物對；所述引物對為正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，反向引物序列如SEQ ID NO 3所示；步驟二，提取樣品DNA，PCR法擴增；PCR檢測體系具體為=IOXPCR反應緩衝液2. 5 μ L，25mmol/L 的 Mg2+2. O μ L，2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0 μ L, 5 μ M 引物對 I μ L, Taq 酶 IU，模板溶液O.5 2μ L，最後用雙蒸水補至25 μ L。PCR檢測體系擴增參數具體為95°C預變性5min ；之後開始擴增循環，每個循環的程序為95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s ;共35個循環；最後72°C延伸lOmin，降溫至16 °C，結束；步驟三，凝膠電泳檢測擴增產物，判斷樣品是否含有鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為凝膠電泳檢測，紫外燈照射下觀察擴增產物在456bp位置是否存在單一擴增條帶，若存在，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；若沒有，則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。
全文摘要
本發明公開了一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法，包括如下步驟根據鼠傷寒沙門氏菌全基因組序列中保守且特異的STM4493基因序列SEQ ID1設計擴增引物對序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3；提取樣品DNA，PCR法擴增；凝膠電泳檢測擴增產物，判斷樣品是否含鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為若電泳結果在456bp出現單一擴增條帶，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；若未出現相應的擴增條帶，則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。採用本發明檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測時間短，成本低，檢測結果特異，結果判定簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102618634SQ20121004235
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者汪銘書, 程安春, 陳孝躍, 黃靜瑋 申請人:四川農業大學