轉基因水稻科豐2號品系特異性實時螢光定量pcr檢測引物、檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-04-26 20:23:11

轉基因水稻科豐2號品系特異性實時螢光定量pcr檢測引物、檢測方法和試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了轉基因水稻科豐2號品系特異性實時螢光定量PCR檢測引物、檢測方法和試劑盒。所述PCR檢測引物的核苷酸序列為SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示，所述探針的核苷酸序列為SEQ?ID?No.4所示。本發明還公開了一種轉基因水稻科豐2號品系特異性的實時螢光定量PCR檢測方法，包括：（1）提取待檢測水稻樣品的DNA；（2）以提取的DNA為模板，以所述特異性檢測引物建立PCR反應體系並進行擴增；（3）根據收集的螢光曲線和Ct值判定檢測結果。特異性、靈敏度、可靠性和檢測限實驗結果表明，本發明轉基因水稻科豐2號品系特異性實時螢光定量PCR檢測方法特異性強、靈敏度高、可靠性好。
【專利說明】轉基因水稻科豐2號品系特異性實時螢光定量PCR檢測引物、檢測方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及轉基因水稻品系特異性的PCR檢測引物及檢測試劑盒，尤其涉及轉基因水稻科豐2號品系特異性的實時螢光定量PCR檢測引物、檢測方法及檢測試劑盒，屬於轉基因水稻品系特異性檢測領域。
【背景技術】
[0002]隨著轉基因植物的廣泛種植，轉基因食品的安全性問題也引起人們極大的關注，已有30多個國家相繼實施轉基因產品標識制度，包括中國。轉基因標識制度的實施依賴於對轉基因植物及其加工產品的成分檢測。PCR技術是目前國內外檢測轉基因產品中應用最廣泛的方法。在應用這種技術進行轉基因作物定性檢測時，根據其特異性，將其分為篩選檢測法、基因特異性方法、構建特異性方法和品系特異性方法。品系特異性檢測是通過檢測插入載體與植物基因組的連接區序列實現的，由於每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，和前三種方法比較，品系特異性具有更高的特異性和準確性，最適合做轉基因產品檢測。
[0003]目前，已有部分專利和文獻報導了轉基因植物的品系特異性檢測方法。例如:張大兵等人於2006年建立了轉基因M0N863玉米的品系特異性檢測方法；謝家建等人建立了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優63、科豐6號和科豐8號等一系列品系特異性檢測方法；盧長明等人於2007年建立了一系列轉基因油菜的品系特異性檢測方法。但是，迄今為止，缺乏一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性的實時螢光定量PCR檢測方法。

【發明內容】

[0004]本發明的目的之一是提供用於檢測轉基因水稻科豐2號的品系特異性實時螢光定量PCR檢測引物及探針；
[0005]本發明的目的之二是建立一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性實時螢光定量PCR檢測方法；
[0006]本發明的目的之三是提供一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性實時螢光定量PCR檢測試劑盒。
[0007]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0008]本發明首先提供了一對用於檢測轉基因水稻科豐2號的品系特異性實時螢光定量PCR檢測引物以及探針，所述引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示。
[0009]本發明根據轉基因水稻科豐2號品系中插入的目的基因為SCK基因(SEQ ID N0.5)通過H1-TAIL PCR獲得外源插入基因5』端水稻側翼序列和3』端水稻側翼序列，所獲得的含有SCK基因的外源插入載體及其兩側5』端和3』端側翼水稻序列的連接區核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示；根據科豐2號外源插入載體和3』端水稻側翼序列所形成的連接區核苷酸序列篩選出了一對特異性強、靈敏度高的轉化體特異性引物及探針序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示。
[0010]本發明的目的之二是提供一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性的實時螢光定量PCR檢測方法，該方法包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ; (2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示核苷酸為擴增上下遊引物，以SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列為探針，建立PCR擴增體系並進行PCR擴增；(3)PCR反應結束後，根據收集的螢光曲線和Ct值判定結果；
[0011]其中，在擴增樣品的同時，進行SPS內標準基因擴增，在SPS內標準基因擴增時，空白對照無典型擴增曲線，陰性對照和陽性對照出現典型的擴增曲線；在轉化體特異性序列擴增時，空白對照和陰性對照無典型擴增曲線，陽性對照出現典型的擴增曲線，表明反應體系工作正常；在反應體系正常的情況下，測試樣品出現典型擴增曲線，且Ct值小於等於38，則表明檢測出科豐2號轉化體成分。
[0012]其中，所述的從待檢測水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA的各種常用方法，例如可以是CTAB法、異硫氰酸胍法或鹽酸胍法等各種方法。
[0013]本發明中所述的PCR擴增體系可參考以下方法建立:反應體系的總體積為 20.0 μ L，其 Φ, 2XMixl0.0 μ L, 10.0 μ mol/L SEQ ID N0.2 所示上遊引物 0.8 μ L,
10.0 μ mo I/LSEQ ID N0.3 所示下遊引物 0.8 μ L, 10.0 μ mo I/LSEQ ID N0.4 所示探針 0.4 μ L，25ng/ μ L DNA模板2.0 μ L，餘量為雙蒸水。 [0014]所述的PCR擴增條件優選為:第一階段95°C /1min ;第二階段95°C /15s,95°C /60s，循環數 40 ；
[0015]本發明進一步的目的是提供一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性的實時螢光定量PCR檢測試劑盒，包括:2 XMix緩衝液，擴增引物對，探針和雙蒸水。
[0016]所述的PCR檢測試劑盒中還含有SPS內標準基因擴增體系。
[0017]特異性、靈敏度、可靠性、檢測限測試結果表明，本發明建立的轉基因水稻科豐2號的品系特異性實時螢光光定量PCR檢測方法特異性強、靈敏度高(靈敏度可達到20個拷貝)、可靠性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是H1-TAIL PCR擴增結果；M:1Kb plus Markerl:下遊第二輪PCR產物2:下遊第三輪PCR產物；3:上遊第二輪PCR產物4:上遊第三輪產物。
[0019]圖2是上下遊測序拼接結果(2614bp)。
[0020]圖3是從已知序列的兩端設計H1-TAIL PCR的嵌套引物。
[0021]圖4是H1-TAIL PCR擴增結果；M:1Kb plus Markerl、上遊第二輪PCR產物；2、上遊第三輪產物；注:下遊引物無條帶。
[0022]圖5是上下遊測序拼接結果。
[0023]圖6中，M:1Kb plus Markerl:空白對照；2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0024]圖7是長片段驗證獲得的整合結構、②、③、④、⑤分別代表:從所示意的位置設計長片段引物進行擴增。
[0025]圖8是I號引物擴增結果:M:lKb plus Marker ；1:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0026]圖9是2號引物擴增結果:M:100bp Marker ；1:空白對照2:明恢86陰性對照3:
科豐2號。
[0027]圖10是3號引物擴增結果:M:lKb plus Marker, 1:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0028]圖11是4號引物擴增結果:M:1Kb plus Marker, 1:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0029]圖12是5號引物擴增結果:M:1Kb plus Marker, 1:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0030]圖13是本發明定量方法的特異性測試結果。
[0031]圖14是本發明定量方法的可靠性實驗結果。
[0032]圖15是靈敏度測試結果；拷貝數為5c0pieS和lcopies時，實時螢光擴增曲線及位於標準曲線的位置。
[0033]圖16是檢測極限第1次試驗結果；A:SPS實時螢光圖及標準曲線圖；B:KF2實時螢光圖及標準曲線圖。
[0034]圖17是檢測極限第2次試驗結果；A: SPS實時螢光圖及標準曲線圖；B:KF2實時螢光圖及標準曲線圖。
[0035]圖18是檢測極限第3次試驗結果；A:SPS實時螢光圖及標準曲線圖；B:KF2實時螢光圖及標準曲線圖。
[0036]圖19是檢測極限第4次試驗結果；A: SPS實時螢光圖及標準曲線圖；B:KF2實時螢光圖及標準曲線圖。
[0037]圖20是檢測極限第5次試驗結果；A: SPS實時螢光圖及標準曲線圖；B:KF2實時螢光圖及標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，這些實施例僅是範例性的，本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0039]實驗例I轉基因水稻科豐2號品系中外源插入的SCK基因的側翼序列的獲得
[0040]轉基因水稻科豐2號品系外源插入目的基因為SCK基因，共415bp，其鹼基序列為SEQ ID N0.5所示。通過H1-TAIL PCR獲得整合結構(外源插入基因側翼序列)。
[0041] 1、第一步:在目的基因SCK上設計H1-TAIL PCR的嵌套引物
[0042]①下遊引物:
[0043]Sck-spl CTTTCTCATCATCTTCATCCCTGGACTTG
[0044]Sck-sp2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGATTTGCAAGCCGAGTGACACGAATT
[0045]Sck-sp3 TTGATTTAGTGCAGATGCATGAATCGC
[0046]上遊引物:
[0047]Sck-Apl GCACCATCTTCTTTGCTCTCTTTCTCTGT
[0048]Sck-Ap2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTTTCGTTTTAAAGGTGTGTGTGCTGGTAC[0049]Sck-Ap3 TGATGACTCAAGCGATGAACCTTCTGAG
[0050]隨機引物:
[0051]ADl-1 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA
[0052]AD1-2 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT
[0053]AD1-3 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA
[0054]AD1-4 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNAGGT
[0055]AD-C ACGATGGACTCCAGAG
[0056]②PCR結果見圖1。
[0057]③上下遊測序拼接結果(2614bp)見圖2。
[0058]2、第二步:從已知序列的兩端設H1-TAIL PCR的嵌套引物
[0059]圖3為嵌套引物設計的示意圖。
[0060]①下遊引物:
[0061]OSP-SPI AGATTAAAATAGCTTTCCCCCGTTGTAGC
[0062]0SP-SP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAAAGTGCTATCCACGATCCATAGCAAG
[0063]0SP-SP3 CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
[0064]上遊引物:
[0065]hptl1-APl GCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATC
[0066]hptI1-AP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAG
[0067]hptI1-AP3 CGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCG
[0068]隨機引物:同上。
[0069]②PCR結果見圖4。
[0070]③上下遊測序拼接結果(3840bp)見圖5。
[0071]3.第三步:根據5』端獲得的水稻序列，得到3』端水稻序列。然後，在水稻啟動子上設上遊引物，水稻3』端序列上設下遊引物，通過長片段擴增得到3』端側翼序列。
[0072]①下遊引物:
[0073]0SJ-3』 -AP: CGCTTTGACCTAAGTTTGCACGGAC
[0074]上遊引物:
[0075]OSP-SP: CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
[0076]②PCR結果見圖6。
[0077]③測序拼接結果(5423bp)見圖7。
[0078]4、全部測序結果:全部的連接區序列(外源插入載體(含有SCK基因)和兩側的水稻側翼序列的連接區)為SEQ ID N0.1所示。
[0079]5、長片段驗證獲得的整合結構
[0080]按照圖7中①、②、③、④、⑤分別代表所示意的位置設計長片段引物進行擴增，預期大小分別為:1.4Kb、1176bp、817bp、2.3kb、4443bp ;擴增結果分別見圖8、圖9、圖10、圖
11、圖 12。
[0081]實驗例2轉基因水稻科豐2號品系特異性實時螢光定量PCR檢測方法的建立
[0082]1、定量引物、探針及擴增片段
[0083]I TAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTTTGCTCTAGTTGCGAATCGCGCATATGAAAT[0084]61 CACACCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGC<CGA,\(x(:(;rT((:T(T
[0085]121 Egctaa^aIcGGCCGCAGCGATCGCATCCTTAGGTCAAAGCGGTTTGTTTGCTCTAACAT
[0086]181 CACAACTTGTATAGTCCGTGC
[0087]Kefeng2-F-dl:TAGTGTATTGACCGATTCCTTGC (SEQ ID N0.2)
[0088]Kefeng2-R-dl:GCACGGACTATACAAGTTGTGATGT (SEQ ID N0.3)
[0089]Kefeng2-P:CGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGAT (SEQ ID N0.4)
[0090]預期擴增片段大小:132bp。
[0091]2、DNA 提取
[0092]採用天根植物基因組提取試劑盒提取待檢測植物材料的DNA，並將DNA稀釋至25ng/μ L0
[0093]3、PCR反應體系建立
[0094]表1實時螢光PCR檢測反應體系
[0095]
【權利要求】
1.用於檢測轉基因水稻科豐2號品系特異性的實時螢光定量PCR檢測引物及探針，其特徵在於:所述引物的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示。
2.—種轉基因水稻科豐2號品系特異性的實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.3所示核苷酸為擴增上、下遊引物建立PCR反應體系並進行PCR擴增；(3)根據收集的螢光曲線和Ct值判定結果。
3.按照權利要求2所述的實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，包括:在反應體系正常的情況下，如果待檢測樣品出現典型擴增曲線，且Ct值小於或等於38，則表明待檢測樣品中含有轉基因水稻科豐2號轉化體成分。
4.按照權利要求2所述的實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於:所述的PCR反應體系的總體積為20.0 μ L，其中，2 XMixl0.0 μ L, 10.0 μ mol/L SEQ ID N0.2所示的上遊引物0.8 μ L，10.0 μ mol/L SEQ ID N0.3 所示的下遊引物 0.8 μ L，10.0 μ mol/L SEQ ID N0.3 所示探針0.4 μ L，25ng/ μ L DNA模板2.0 μ L，餘量為雙蒸水。
5.按照權利要求2所述的實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於:所述的PCR擴增條件為:第一階段950C，1min ;第二階段95°C，15s，95。。，60s，循環數40。
6.一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性的實時螢光定量PCR檢測試劑盒，包括:2XMix，擴增引物對，探針和雙蒸水；其特徵在於:所述擴增引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0 .3所示；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示。
7.按照權利要求6所述的實時螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於:含有SPS內標準基因擴增體系。
【文檔編號】C12Q1/68GK104031982SQ201410081751
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】宛煜嵩, 梁利霞, 張秀傑, 朱禎, 金蕪軍, 苗朝華, 李亮, 董美 申請人:中國農業科學院生物技術研究所