一種提高產溶劑梭菌發酵性能的方法與流程
2023-04-26 20:26:12
本發明屬於兩種重要產溶劑梭菌發酵領域，具體涉及提高產溶劑梭菌發酵性能的方法。
背景技術：
生物素，又稱維生素H、輔酶R，是一種水溶性含硫B類維生素。生物素是許多微生物生長所必需的重要微量元素，它可以作為菌體內羧化酶的輔酶廣泛參與到菌株的各項生理活動，例如胺基酸代謝，脂肪酸代謝，糖異生以及毒素的合成等。因此，生物素在許多微生物培養基中被添加使用。
產溶劑梭菌，可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、阿拉伯糖以及含碳氣體(一氧化碳和二氧化碳)等多種碳源發酵生產丙酮、乙醇以及丁醇。其中，產溶劑梭菌的模式菌—丙酮丁醇梭菌被用來生產有機溶劑的歷史可以追溯到上個世紀早期。鑑於生物素對於維持微生物正常生長的重要性，目前用於產溶劑梭菌培養的合成培養基以及企業採用的工業培養基中都或多或少地含有生物素或包含生物素成分的天然物質。
然而，在培養基中使用生物素或含生物素成分的天然物質不可避免地增加了發酵成本。是否可以通過在產溶劑梭菌中過表達生物素合成相關基因，強化其自身的生物素合成能力，從而消除產溶劑梭菌在生長和代謝過程中對外源生物素或含生物素成分物質的依賴呢？此外，如果產溶劑梭菌自身的生物素合成能力得到提高，實現了體內生物素的持續、充足供應，是否能夠進一步提升菌株的發酵性能，獲得比外源添加生物素更優的發酵結果呢？這些問題尚未被探究。如果上述猜想得到證實，將有可能全面提升產溶劑梭菌的發酵性能，且可能顯著降低發酵成本，提高發酵效率和經濟性。
技術實現要素：
本發明第一方面提供一種核酸構建物，所述核酸構建物含有：
(1)編碼SEQ ID NO:1所示胺基酸序列或在SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且保留SEQ ID NO:1的生物學活性的由SEQ ID NO:1衍生的胺基酸序列的多核苷酸序列或其互補序列；
(2)編碼SEQ ID NO:2所示胺基酸序列或在SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列中經 過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且保留SEQ ID NO:2的生物學活性的由SEQ ID NO:2衍生的胺基酸序列的多核苷酸序列或其互補序列；
(3)編碼SEQ ID NO:3所示胺基酸序列或在SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且保留SEQ ID NO:3的生物學活性的由SEQ ID NO:3衍生的胺基酸序列的多核苷酸序列或其互補序列；和
(4)編碼SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或在SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且保留SEQ ID NO:4的生物學活性的由SEQ ID NO:4衍生的胺基酸序列的多核苷酸序列或其互補序列。
在一個具體實施例中，所述核酸構建物還含有與編碼SEQ ID NO:1、2、3和4所示胺基酸序列的多核苷酸序列操作性連接的啟動子序列，用於表達SEQ ID NO:1、2、3和4所示胺基酸序列。
在一個具體實施例中，所述核酸構建物中，編碼SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列的多核苷酸序列從5』-3』依次連接，與thl啟動子或其RBS區至少含有該區5』端的AGGAGG的變體或其RBS區3』端截短1－14個核苷酸或延長1－6個核苷酸的變體操作性連接。
在一個具體實施例中，所述thl啟動子或其變體的核苷酸序列如SEQ ID NO:12－16中任一條所示。
在一個具體實施例中，表達SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列的多核苷酸序列與ptb啟動子操作性連接。
在一個具體實施例中，所述核酸構建物用於表達SEQ ID NO:1、2、3和4所示的胺基酸序列。
在一個具體實施例中，所述核酸構建物的骨架載體來自pIMP1載體。
在一個具體實施例中，所述核酸構建物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本發明第二方面提供一種核酸構建物，所述核酸構建物含有丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列或來自其它梭菌屬的與上述各基因相對應的基因序列。
在一個具體實施例中，所述cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列分別如SEQ ID NO:11中第173～712位鹼基、第712～1434位鹼基、第1457～2800位鹼基、和第2933～3919位鹼基所示。
本發明第三方面提供一種產溶劑梭菌，所述產溶劑梭菌為經遺傳工程操作的工程菌，與獲得該工程菌的親本菌株相比，該工程菌的生物素表達水平提高。
在一個具體實施例中，所述產溶劑梭菌為丙酮丁醇梭菌。
在一個具體實施例中，所述產溶劑梭菌中cac1360、cac1361、cac1362和cac0210或其對應基因過表達，或SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白過表達。
在一個具體實施例中，所述產溶劑梭菌中經遺傳工程操作而轉入了本發明的核酸構建物。
本發明第四方面提供一種產溶劑梭菌發酵方法，所述方法包括使用本發明的產溶劑梭菌進行發酵，其中，發酵培養基含有與該產溶劑梭菌的標準發酵培養基相比降低的生物素濃度。
本發明第五方面提供一種提高產溶劑梭菌生長能力和/或產溶劑能力的方法，所述方法包括對所述產溶劑梭菌實施遺傳工程操作，使其過表達SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白。
在一個具體實施例中，所述產溶劑梭菌是丙酮丁醇梭菌。
在一個具體實施例中，所述實施遺傳工程操作包括將本發明的核酸構建物轉入所述產溶劑梭菌中。
附圖說明
圖1顯示向丙酮丁醇梭菌發酵培養基中(P2)添加生物素後可以提升菌株生長以及產溶劑的能力。
圖2顯示在BioYADB菌株中生物素合成量多於EP菌株。
圖3顯示丙酮丁醇梭菌中生物素轉運以及合成相關基因的分析鑑定及其強化過表達。
圖4顯示優化生物素合成途徑後可以進一步提升丙酮丁醇梭菌的發酵性能。
圖5顯示強化生物素合成途徑後可以進一步提升824glcG-TBA菌株的發酵性能。
具體實施方式
本發明通過在產溶劑梭菌中過表達生物素合成相關基因，強化其自身的生物素合成能力而全面提升菌株的發酵性能，且可能消除該梭菌在生長和代謝過程中對外源生物素或含生物素成分物質的依賴，降低發酵培養基的成本，提高發酵過程的效率和經濟性。
生物素合成相關蛋白及其編碼序列
本發明涉及的生物素合成相關蛋白為來自丙酮丁醇梭菌的BioY、BioD、BioA和BioB，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO:1－4所示。
本發明也包括SEQ ID NO:1－4任一序列的突變體。這些突變體包括：與SEQ ID NO:1－4具有至少80％，優選至少85％，優選至少90％，優選至少95％，優選至少97％的序列相同性並保留SEQ ID NO:1－4各自的生物學活性的胺基酸序列。可採用例如NCBI的BLASTp計算兩條比對的序列之間的序列相同性。
突變體還包括：在SEQ ID NO:1－4所示的序列中具有一個或數個突變(插入、缺失或取代)、同時仍保留SEQ ID NO:1－4各自的生物學活性的胺基酸序列，及其編碼序列。所述數個突變通常指1－10個以內，例如1－8個、1－5個或1－3個。取代優選是保守性取代。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行保守性取代時，通常不會改變蛋白質或多肽的功能。「性能相近或相似的胺基酸」包括例如，具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族，這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側鏈的胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在本發明多肽中用來自同一側鏈類的另一胺基酸殘基替換一個或幾個位點，將不會在實質上影響其活性。
應理解，丙酮丁醇梭菌的BioY、BioD、BioA和BioB的突變體也包括來自不同梭菌或不同的丙酮丁醇梭菌菌株、具有不同的胺基酸組成、但生物學活性相同的BioY、BioD、BioA和BioB蛋白。這類蛋白往往由處於相同或相應的基因組位置上的同一種或視為同一種的基因表達。在本文中，這類蛋白被認為是「同源的」。
本發明包括BioY、BioD、BioA和BioB蛋白及其各自的突變體的編碼序列。更具體而言，本發明包括SEQ ID NO:1－4的編碼序列。作為示例性的例子，這些蛋白分別由cac1360、cac1361、cac1362和cac0210編碼。除cac1360、cac1361、cac1362和cac0210外，本發明當然也包括SEQ ID NO:1－4的其它編碼序列，即「簡併序列」。應理解，「簡併序列」在本發明中是指編碼本發明的胺基酸序列，但與如cac1360、cac1361、cac1362和cac0210等所示的序列有差別的核酸序列。
生物素合成相關基因
本發明涉及丙酮丁醇梭菌的如下基因：cac1360、cac1361、cac1362和cac0210〔KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)中的編號〕。本發明也涉及來自梭菌屬其它菌株的分別與cac1360、cac1361、cac1362和cac0210相對應的基因。「相對應的基因」在本文中指在梭菌的基因組中處於或視為處於相同的位置並表達具有相同或視為相同的生物學功能的 蛋白的基因。應理解，所述「視為」應指本領域技術人員根據本領域的公知技術能合理作出的判斷。
基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210的序列分別如SEQ ID NO:11中第173～712位鹼基、第712～1434位鹼基、第1457～2800位鹼基、和第2933～3919位鹼基所示。
本發明也包括與基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210具有至少80％，優選至少85％，優選至少90％，優選至少95％，優選至少97％的序列相同性的核苷酸序列。優選的是，這些核苷酸序列所編碼的蛋白質仍然具有本文所需的生物學活性。可採用例如NCBI中的nucleotide blast比對兩條核苷酸序列，計算其序列相同性。另一方面，本發明也包括與基因cac1360、cac1361、cac1362和cac0210具有至少80％，優選至少85％，優選至少90％，優選至少95％，優選至少97％的同源性、且其編碼的蛋白質仍然具有本文所述生物學活性的核苷酸序列。可採用已知的技術手段進行同源性比對，例如Clustal-W等。
核酸構建物
本發明也涉及核酸構建物，該核酸構建物含有本文所述的生物素合成相關基因或生物素合成相關蛋白的編碼序列，以及與這些序列操作性連接的一個或多個調控序列。本發明所述的生物素合成相關基因或生物素合成相關蛋白的編碼序列可以多種方式被操作以保證所述蛋白的表達。在將核酸構建物插入載體之前可根據表達載體的不同或要求而對核酸構建物進行操作。利用重組DNA方法來改變多核苷酸序列的技術是本領域已知的。
調控序列可以是合適的啟動子序列。啟動子序列通常與待表達蛋白的編碼序列操作性連接。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合啟動子，並且可以從編碼與該宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。
本發明中，啟動子可以是thl啟動子或ptb啟動子。在某些實施例中，啟動子還包括thl啟動子的突變體，具體為thl啟動子RBS區至少含有該區5』端的AGGAGG的變體或其RBS區3』端截短1-14個核苷酸或延長1－6個核苷酸的突變體。Thl啟動子的序列如SEQ ID NO:12所示，其變體的例子可參見SEQ ID NO:13－16中任一條所示。Ptb啟動子的序列可如SEQ ID NO:11第2811～2935位鹼基所示。
在一個具體實施例中，本發明的核酸構建物中，BioY、BioD和BioA的編碼序列從5』到3』順次連接，並與thl啟動子或其變體操作性連接。BioB的編碼序列與ptb啟動子操作性連接，並處於BioY、BioD和BioA的編碼序列的下遊。
調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。終 止子序列與編碼該多肽的核苷酸序列的3』末端操作性連接。在選擇的宿主細胞中有功能的任何終止子都可用於本發明。
例如，用於細菌宿主的優選終止子可以是來自T7噬菌體的終止子。用於絲狀真菌宿主細胞的優選終止子獲得自米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡萄糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡萄糖苷酶的基因。用於酵母宿主細胞的優選終止子獲得自釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細胞色素C、釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶、巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因等。
調控序列也可以是合適的前導序列，對宿主細胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區。籤到序列與編碼該多肽的核苷酸序列的5′末端可操作連接。在選擇的宿主細胞中有功能的任何終止子都可用於本發明。
調控序列也可以是編碼與多肽的胺基酸末端連接的胺基酸序列並且指導該編碼的多肽進入細胞分泌途徑的信號肽編碼區。核苷酸序列編碼序列的5′端可固有地包含天然連接具有編碼分泌多肽的編碼區節段的翻譯閱讀框的信號肽編碼區。備選地，編碼序列的5′端可包含與該編碼區外源的信號肽編碼區。當編碼序列非天然地包含信號肽編碼區時，可能需要外來的信號肽編碼區。備選地，外來的信號肽編碼區可簡單地替換天然的信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入選擇的宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區，即分泌進入培養基，都可用於本發明。
在某些實施例中，本發明的核酸構建物是表達載體，用於在產溶劑梭菌，尤其是丙酮丁醇梭菌中表達生物素合成相關蛋白，尤其是本文所述的BioY、BioD、BioA和BioB及其保留了所需生物學功能的突變體。
表達載體
本發明也涉及包括本發明多核苷酸的重組表達載體。各種核酸和調控序列可被連接在一起，以產生可能包括一個或多個容許在這種位點插入或取代該編碼多肽的核苷酸序列的方便限制性位點的重組表達載體。在製造表達載體時，編碼序列位於載體中以使得該編碼序列可操作地連接用於表達適當調控序列。
重組表達載體可以使能夠方便地經受重組DNA方法並且可導致感興趣的核苷酸序列表達的任何載體(如質粒或病毒)。載體的選擇一般取決於載體與其中被導入該載體的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性或閉合的環形質粒。
載體可以是自主複製的載體，即作為染色體外實體存在，其複製不依賴於染色體複製的載體，例如質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含用於保證自我複製的任何方式。備選地，載體可以是當被導入宿主細胞時，整合到基因組中並且與其 已經被整合進入的染色體一起複製的載體。此外，可使用一起包含將被導入宿主細胞基因組的總DNA的單個載體或質粒或兩個或多個載體或質粒，或轉座子。
本發明的載體優選包含一個或多個容許容易選擇轉化、轉染、轉導等細胞的可選擇標記。可選擇的標記是基因，其產物提供對抗生素或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原養型至營養缺陷型等。
本發明的載體優選包含容許該載體整合進入宿主細胞基因組或該載體在細胞中獨立於基因組自主複製的元件。
一個以上拷貝的本發明的與生物素合成相關的基因或多核苷酸序列可被插入宿主細胞以增加該基因產物的產量。多核苷酸拷貝數的增加可通過將至少一個附加拷貝的序列整合進入宿主細胞基因組或通過包括可擴增的選擇標記基因和該多核苷酸來獲得，其中包含擴增拷貝的選擇標記基因並且由此包含附加拷貝多核苷酸的細胞可通過在存在適當的選擇劑時培養該細胞來篩選。
本發明的載體優選包含人工合成的一段序列，含有多個限制內切酶識別位點，能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。
本發明優選使用能在產溶劑梭菌，尤其是丙酮丁醇梭菌中表達的載體。
產溶劑梭菌
本發明提供一種產溶劑梭菌，該產溶劑梭菌為經遺傳工程操作的工程菌，與獲得該工程菌的親本菌株相比，該工程菌的生物素表達水平提高。
本文中，「遺傳工程操作」通常指將本發明的核酸構建物或表達載體轉入該產溶劑梭菌的操作。具體的操作為本領域常規技術。具體而言，可採用本領域常規的轉染方法將本發明的核酸構建物或表達載體轉入該產溶劑梭菌中。
轉染通常分為瞬時轉染和穩定轉染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天。穩定轉染中，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。轉染的技術手段包括化學轉染和物理轉染，前者如DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質體法，後者如顯微注射、電穿孔和基因槍等。
優選的是，所述產溶劑梭菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridium Saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)。
優選的是，所述產溶劑梭菌中cac1360、cac1361、cac1362和cac0210或其對應基因過表達。
在一個具體實施例中，所述產溶劑梭菌中經遺傳工程操作而轉入了本發明的核酸構建物或表達載體，並穩定表達本文所述的生物素合成相關蛋白。
方法
本發明還提供一種產溶劑梭菌發酵方法，所述方法包括使用本發明的產溶劑梭菌進行發酵，其中，發酵培養基含有與該產溶劑梭菌的標準發酵培養基相比降低的生物素濃度。
用於發酵的培養基通常為本領域常規的用於產溶劑梭菌的發酵的培養基，所不同的是該發酵培養基中生物素的含量或濃度與標準發酵培養基相比降低。
通常的產溶劑梭菌發酵培養基(P2)含有碳源以及K2HPO4(0.3～0.8g/l，如0.5g/l)，KH2PO4(0.3～0.8g/l，如0.5g/l)，CH3COONH4(1.8～2.6g/l，如2.2g/l)，MgSO4·7H20(150～250mg/l，如200mg/l)，MnSO4·H2O(7～13mg/l，如10mg/l)，NaCl(7～13mg/l，如10mg/l)，FeSO4·7H20(7～13mg/l，如10mg/l)，對氨基苯甲酸(0.7～1.3mg/l，如1mg/l)，硫胺(0.7～1.3mg/l，如1mg/l)以及生物素(8～20μg/l，如10μg/l)。
本發明還提供一種提高產溶劑梭菌生長能力和/或產溶劑能力的方法，所述方法包括對所述產溶劑所述實施遺傳工程操作，使其過表達SEQ ID NO:1、2、3和4所示的蛋白或其各自的同源蛋白。
在一個具體實施例中，所述產溶劑梭菌是丙酮丁醇梭菌、揚氏梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌或糖乙酸多丁醇梭菌。在一個具體實施例中，所述實施遺傳工程操作包括將本發明的核酸構建物轉入所述產溶劑梭菌中。
實施例1：添加生物素可以強化丙酮丁醇梭菌的發酵性能
實驗方法：
利用添加有不同濃度生物素的P2培養基對野生型丙酮丁醇梭菌進行發酵測試，確定生物素對丙酮丁醇梭菌發酵的影響。
實驗步驟：
1)向丙酮丁醇梭菌發酵培養基(不含生物素的P2培養基)中添加不同濃度的生物素(生物素濃度：10，15，20，25以及30μg/L)，構建含有不同濃度生物素的發酵培養基；
2)向1)中準備的培養基內按5％(v/v)的比例接種野生型丙酮丁醇梭菌，在厭氧箱中進行37℃靜置發酵；具體發酵條件如下：P2培養基(30ml)，7％葡萄糖(w/v)，5％的接種量(v/v)，生物素添加濃度：10，15，20，25和30μg/L。
3)在發酵的不同階段進行發酵取樣，利用氣相色譜儀(890A，Agilent，Wilmington，DE，US)以及高效液相色譜儀(model 1200，Agilent)測定發酵液中的有機溶劑含量以及糖利用量。
實驗結果：
實驗結果如圖1所示。圖中顯示為2次生物學重複的結果。具體而言，圖A顯示添加生物素後菌株的生長曲線，橫坐標為發酵時間，縱坐標為OD600；圖B顯示添加不同濃度生物素後丙酮丁醇梭菌在48h的發酵產物分析，橫坐標為生物素添加濃度，縱坐標為溶劑產量；圖C顯示添加不同濃度生物素後丙酮丁醇梭菌在72h的發酵產物分析，橫坐標為生物素添加濃度，縱坐標為溶劑產量。
結果顯示，隨著培養基中生物素濃度的增加，菌株的生長以及產溶劑能力提升。當發酵培養基內生物素濃度為25μg/L時菌株的生長及產溶劑能力提升最明顯，其中最高菌體濃度(optical density)提升55％，最終總溶劑提升14％。
實施例2：丙酮丁醇梭菌中生物素合成相關基因分析鑑定及其表達水平的強化
實驗方法：
利用生物信息學、比較基因組學和蛋白質胺基酸序列同源比對的方法來分析鑑定丙酮丁醇梭菌中的生物素合成基因，進一步通過過表達生物素合成相關基因提升丙酮丁醇梭菌的發酵性能。
實驗步驟：
1)根據KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)中基因組注釋，分析丙酮丁醇梭菌中生物素合成相關基因；
2)以枯草芽孢桿菌中生物素合成相關蛋白的胺基酸序列為模板，利用胺基酸序列同源比對的方法(protein blast)，檢索找尋丙酮丁醇梭菌中潛在的生物素合成相關蛋白；
3)在丙酮丁醇梭菌中強化過表達生物素合成相關基因以及發酵驗證；
4)分別利用Pthl以及Pptb過表達來源於丙酮丁醇梭菌的生物素合成相關基因構建獲得生物素過表達質粒pIMP1-Biotin(pIMP1Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB)，具體構建過程如下：
A：生物素基因簇bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)的獲取：
首先以丙酮丁醇梭菌基因組為模板，利用CAC1360-for/CAC1362-rev引物(分別為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)進行PCR擴增，經過瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得目的片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)。
B：Pptb-bioB片段的獲取：
以丙酮丁醇梭菌基因組為模板，利用Pptb-for/Pptb-rev引物(分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)進行PCR擴增，經過瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得啟動子片段Pptb，利用CAC0210-for/CAC0210-rev引物(分別為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)進行PCR擴增，經過瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得片段bioB(cac0210)。最後利用Pptb-for/CAC0210-rev作為引物(分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10)，以片段Pptb與bioB(cac0210)的混合物為模板進行重疊PCR(overlap-PCR)，經瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得目的片段Pptb-bioB。
C：pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA質粒的構建：
在37℃水浴中，利用限制性內切酶SalI/KpnI對空質粒pIMP1-Pthl(美國德拉瓦大學的Eleftherios Terry Papoutsakis教授贈予)及片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)進行雙酶切，酶切3h後利用膠回收試劑盒純化回收酶切過的載體骨架以及bioY-bioD-bioA片段，之後利用solution I連接酶將酶切過的載體骨架以及bioY-bioD-bioA片段進行重組連接。16℃連接4h後，將連接產物轉化Top10感受態，塗布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固體平板。第二天挑取平板上長出的菌落進行菌落PCR驗證，將驗證正確的單菌落轉接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液體培養基中，培養過夜。第二天，利用質粒提取試劑盒抽取質粒，經SalI/KpnI酶切驗證正確後，將該質粒送測序公司測序，測序結果正確即獲得pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA質粒。
D：質粒Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB的獲取
將C中測序正確的pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA質粒以及B中獲得的Pptb-bioB片段經過KpnI單酶切處理，分別回收酶切過的載體骨架以及Pptb-bioB片段，利用solution I連接酶將酶切過的載體骨架以及Pptb-bioB片段進行重組連接。16℃連接4h後，將連接產物轉化Top10感受態，塗布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固體平板。第二天挑取平板上長出的菌落進行菌落PCR驗證，將驗證正確的單菌落轉接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液體培養基中，培養過夜。第二天，利用質粒提取試劑盒抽取質粒，經KpnI酶切驗證正確後，將該質粒送測序公司測序，測序結果正確即獲得Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB質粒。
5)將Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB質粒(pIMP1-Biotin)以及相應的對照質粒pIMP1-thl(只含有Pthl的空質粒)分別電轉至野生型丙酮丁醇梭菌中得到BioYADB(生物素基因簇過表達菌株)以及EP(對照菌株)菌株；
6)將EP以及BioYADB分別接種至P2培養基(添加生物素以及不添加生物素兩種培養基)中，在厭氧箱中進行37℃靜置發酵；
發酵條件：添加生物素的P2培養基：發酵體積30ml，7％葡萄糖(w/v)，5％的 接種量(v/v)，生物素添加濃度10μg/L，紅黴素10μg/ml。
不添加生物素的P2培養基：發酵體積140ml，7％葡萄糖(w/v)，5％的接種量(v/v)，紅黴素10μg/ml。
7)在不同時間點進行發酵取樣，利用氣相色譜儀(890A,Agilent,Wilmington,DE,US)以及高效液相色譜儀(model 1200,Agilent)測定發酵液中的有機溶劑含量以及糖利用量。
實驗結果：
圖3顯示了實驗結果。圖中顯示為3次生物學重複的結果。圖A顯示枯草芽孢桿菌中生物素成途徑，其中BioI：細胞色素P450蛋白；BioW：庚二醯-CoA合成酶；BioF：KAPA合成酶；BioA：DAPA合成酶；BioD：脫硫生物素合成酶；BioB：生物素合成酶。圖B顯示為丙酮丁醇梭菌中的生物素轉運以及合成相關基因在基因組上的分布。丙酮丁醇梭菌中生物素合成相關基因包括：CAC0210/CAC1631/CAC3343(BioB)，CAC1361(BioD)以及CAC1362(BioA)；丙酮丁醇梭菌中生物素轉運相關基因CAC1360/CAC0211/CAC3456(BioY)。圖C顯示為丙酮丁醇梭菌中生物素轉運以及合成相關基因的過表達模式。圖D(i)顯示為在添加有生物素的P2培養基中，丙酮丁醇梭菌中過表達生物素轉運以及合成相關基因後菌株的生長以及糖利用情況。圖D(ii)顯示為在添加有生物素的P2培養基中，丙酮丁醇梭菌中過表達生物素轉運以及合成相關基因後菌株的產溶劑情況。圖D(iii)顯示為在不添加有生物素的P2培養基中，丙酮丁醇梭菌中過表達生物素轉運以及合成相關基因後菌株的生長以及糖利用情況。圖D(iv)顯示為在不添加有生物素的P2培養基中，丙酮丁醇梭菌中過表達生物素轉運以及合成相關基因後菌株的產溶劑情況。
具體而言，根據KEGG中基因功能注釋，在丙酮丁醇梭菌中鑑定得到一系列生物素合成相關蛋白：BioA(CAC1362)蛋白，BioD(CAC1361)蛋白以及BioB(CAC0210，CAC1631以及CAC3343)蛋白；分別以枯草芽孢桿菌中的生物素合成相關蛋白(BioW，BioA，BioF，BioD，BioB以及BioI)的胺基酸序列為模板，利用Clustal W2進行胺基酸序列同源比對的方法在丙酮丁醇梭菌中鑑定得到三個與枯草芽孢桿菌中生物素合成相關蛋白胺基酸序列同源性較高的蛋白：BioA(CAC1362，與枯草芽孢桿菌中BioA的胺基酸序列一致性達到42.12％)，BioD(CAC1361，與枯草芽孢桿菌中BioD的胺基酸序列一致性達到31.88％)以及BioB(CAC0210，與枯草芽孢桿菌中BioB的胺基酸序列一致性達到41.12％)，其中丙酮丁醇梭菌中另外兩個BioB蛋白的胺基酸序列與枯草中BioB的胺基酸序列一致性較低(CAC1631以及CAC3343與枯草芽孢桿菌中BioB蛋白的胺基酸序列一致性分別為21.04％和17.22％)。另外，丙酮丁醇梭菌中存在三個預測的生物素轉運相關的BioY(CAC0211，CAC1360以及CAC3456)蛋白，分別將這三個BioY蛋白的 胺基酸序列與枯草芽孢桿菌基因組中預測的BioY(BSU10370)進行胺基酸序列同源比對，結果發現：CAC1360與枯草中兩個BioY胺基酸序列的同源性最高。
在添加有生物素的P2培養基中，BioYADB菌株與EP菌株相比，其生長速率顯著加快，BioYADB較EP提前19h到達最高菌體濃度(optical density)，底物利用能力增加(BioYADB較EP多利用8.29g葡萄糖)，進而合成了更多的產物(丙酮5.95g/l，丁醇14.72g/l，乙醇2.72g/l，EP菌株的產物濃度為丙酮5.79g/l，丁醇13.22g/l，乙醇1.95g/l)。而在不添加生物素的P2培養基中(7％D-葡萄糖)進行發酵時，BioYADB的發酵性能較EP優勢更明顯，其底物利用能力增加(BioYADB較824-P多利用15.45g葡萄糖)，最終發酵產物產量明顯提升(丙酮5.15g/l，丁醇11.78g/l，乙醇2.67g/l，而EP菌株的產物濃度為丙酮4.06g/l，丁醇8.51g/l，乙醇1.20g/l)。
實施例3：BioYADB以及EP菌株內生物素含量測定
實驗方法：
利用生物素營養缺陷型的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum E4)來檢測丙酮丁醇梭菌合成的生物素含量。
實驗步驟：
1)將EP以及BioYADB在不添加有生物素的P2培養基中進行厭氧發酵，分別在24h，31h，41h，49h以及54h進行取樣(4ml)；
發酵條件：P2培養基(400ml，不添加生物素)，7％葡萄糖(w/v)，5％的接種量(v/v)，紅黴素最終濃度10μg/ml；
2)將1)中獲取的培養液進行離心收菌，收集上清，用於測定胞外生物素含量；
3)將2)中獲得的菌體經過0.9％NaCl(w/v)清洗三次後，利用3M H2SO4懸浮菌體，經過121℃滅菌1h，充分降解菌體，釋放體內生物素，離心後收集上清，用於測定胞內生物素含量；
4)利用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum E4)來進行生物素含量測定：植物乳桿菌為生物素營養缺陷型菌株，在添加不同濃度生物素的條件下其生長與生物素濃度呈線性關係，利用此原理對3)中胞內與胞外的生物素含量進行測定；
5)利用植物乳桿菌構建生物素測定的標準曲線，分別測定胞外和胞內的生物素含量，最終得到總的生物素含量。
實驗結果：
結果顯示在圖2中，圖中顯示為2次生物學重複的結果。圖A顯示為利用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum E4)構建的生物素測定標準曲線。圖B顯示為EP菌株以及 BioYADB菌株在五個時間點(24h，31h，41h，49h以及54h)的生物素含量測定。
結果表明：BioYADB菌株在五個時間點(24h，31h，41h，49h以及54h)的生物素含量均高於EP菌株(生物素總量在24h，31h，41h，49h以及54h分別提升39.6％，43.9％以及60.0％，24.2％以及18.4％)。該結果表明BioYADB較EP合成了更多的生物素。
實施例4：優化生物素合成途徑進一步提升菌株的發酵性能
實驗方法：
利用啟動子優化的方法進一步強化丙酮丁醇梭菌的生物素合成途徑，提升菌株性能。
實驗步驟：
1)改變thl內RBS區與下遊基因起始密碼子ATG間的距離，構建得到一系列thlvar(thl來源的改造啟動子：thl-7，thl-15，thl-23以及thl-27，序列分別見SEQ ID NO:13、14、15和16)；
2)利用1)中得到thlvar分別過表達生物素合成相關基因簇bioY-bioD-bioA，得到不同的生物素基因過表達質粒：pIMP1-thl7-Biotin，pIMP1-thl15-Biotin，pIMP1-thl23-Biotin以及pIMP1-thl27-Biotin；
3)將2)中質粒電轉至野生型丙酮丁醇梭菌中得到一些列生物素基因過表達菌株：Bio7，Bio15，Bio23以及Bio27；
4)將3)中得到的菌株與EP以及BioYADB菌株在不添加有生物素的P2培養基中進行發酵，在不同時間點進行取樣，最終分析樣品中有機溶劑的含量以及殘糖量；
發酵條件：P2培養基(30ml，不添加生物素)，7％葡萄糖(w/v)，5％的接種量(v/v)，紅黴素最終濃度10μg/ml。
實驗結果：
結果顯示在圖4中，圖中顯示為3組生物學重複的結果。圖A顯示為thl啟動子的優化，通過改變thl內RBS區與下遊基因起始密碼子ATG間的距離，構建得到一系列thlvar。圖B顯示利用lacZ報告系統對圖5A中得到的一系列thlvar進行體內酶活測定，鑑定啟動子強度。圖C顯示利用優化的thl啟動子過表達bioY-bioD-bioA後菌株的最高菌體濃度(optical density)分析。圖D顯示利用優化的thl啟動子過表達bioY-bioD-bioA後菌株的總溶劑分析。
結果表明：利用thl-7過表達bioY-bioD-bioA時，菌株的生長及產溶劑性能有明顯提升。發酵至72h，Bio7菌株較BioYADB菌株總溶劑提升1.21g(5.85％)。
實施例5：強化生物素合成途徑進一步提升工程菌824glcG-TBA的發酵性能
實驗方法：
在工程菌株824glcG-TBA菌株中過表達生物素合成途徑(Pthl-7-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB)，驗證能否進一步提升菌株的發酵性能。
實驗步驟：
分別向824glcG菌株中電轉導入生物素合成途徑(pIMP1-thl7-Biotin)以及木糖代謝相關基因(pITC-xylTthl-xylBAthl)，之後在含有葡萄糖、木糖以及阿拉伯糖三種混糖(37.63g/l的D-葡萄糖，14.47g/l的D-木糖以及2.89g/l的L-阿拉伯糖)的模擬水解液培養基中進行發酵，驗證菌株的發酵表型。
發酵條件：P2培養基(30ml，不添加生物素)，混糖(37.63g/l的D-葡萄糖，14.47g/l的D-木糖以及2.89g/l的L-阿拉伯糖，w/v)，5％的接種量(v/v)，紅黴素最終濃度10μg/ml，甲碸氯黴素最終濃度8μg/ml。
實驗結果：
結果顯示在圖5中，圖中顯示為2組生物學重複的結果。圖A顯示為824glcG-TBA菌株與824glcG-TBA-Bio菌株的生長曲線。圖B顯示為824glcG-TBA菌株與824glcG-TBA-Bio菌株的糖利用曲線。圖C顯示為824glcG-TBA菌株與824glcG-TBA-Bio菌株的產溶劑曲線。
具體而言，在824glcG-TBA菌株中通過過表達丙酮丁醇梭菌來源的生物素合成途徑(824glcG-TBA-Bio)可以進一步提升該菌株的發酵性能、菌株的生長和糖利用能力，其中824glcG-TBA-Bio菌株較824glcG-TBA菌株提前13h到達最高菌體濃度(optical density)，底物利用能力增加(824glcG-TBA-Bio較824glcG-TBA利用葡萄糖以及木糖的能力增強，最終多利用4.07g木糖)，最終發酵產物產量明顯提升(824glcG-TBA-Bio產物濃度為丙酮4.48g/l，丁醇10.31g/l，乙醇1.79g/l，824glcG-TBA菌株的產物濃度為丙酮3.97g/l，丁醇9.13g/l，乙醇1.35g/l)。
實施例6：添加生物素可以強化揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的發酵性能
實驗方法：
利用添加有不同濃度生物素的P2培養基對野生型揚氏梭菌進行發酵測試，確定生物素對揚氏梭菌發酵的影響。
實驗步驟：
1)向揚氏梭菌發酵培養基(不含生物素的P2培養基)中添加不同濃度的生物素(生物素濃度：10，15，20，25以及30μg/l)，構建含有不同濃度生物素的發酵培養基；
2)向1)中準備的培養基內按5％(v/v)的比例接種野生型揚氏梭菌，在厭氧箱中進行37℃靜置發酵；具體發酵條件如下：採用美國模式培養物集存庫(American type culture collection)網站(http://www.atcc.org/)提供的ATCC 1754培養基(30ml)，5％的接種量(v/v)，生物素添加濃度：10，15，20，25和30μg/l。
3)在發酵的不同階段進行發酵取樣，利用氣相色譜儀(890A，Agilent，Wilmington，DE，US)以及高效液相色譜儀(model 1200，Agilent)測定發酵液中的有機溶劑含量以及糖利用量。
實施例7：揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)中生物素合成水平的強化
實驗方法：
通過在揚氏梭菌中過表達上述4個來源於丙酮丁醇梭菌的生物素合成相關基因提升揚氏梭菌的發酵性能。
實驗步驟：
1)在揚氏梭菌中強化過表達上述4個來源於丙酮丁醇梭菌的生物素合成相關基因以及發酵驗證；
4)分別利用Pthl以及Pptb過表達來源於丙酮丁醇梭菌的生物素合成相關基因構建獲得生物素過表達質粒pIMP1-Biotin(pIMP1Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB)，具體構建過程如下：
A：生物素基因簇bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)的獲取：
首先以丙酮丁醇梭菌基因組為模板，利用CAC1360-for/CAC1362-rev引物(分別為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)進行PCR擴增，經過瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得目的片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)。
B：Pptb-bioB片段的獲取：
以丙酮丁醇梭菌基因組為模板，利用Pptb-for/Pptb-rev引物(分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)進行PCR擴增，經過瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得啟動子片段Pptb，利用CAC0210-for/CAC0210-rev引物(分別為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)進行PCR擴增，經過瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得片段bioB(cac0210)。最後利用Pptb-for/CAC0210-rev作為引物(分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10)，以片段Pptb與bioB(cac0210)的混合物為模板進行重疊PCR(overlap-PCR)，經瓊脂糖電泳以及膠回收過程獲得目的片段Pptb-bioB。
C：pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA質粒的構建：
在37℃水浴中，利用限制性內切酶SalI/KpnI對空質粒pIMP1-Pthl(美國德拉瓦大學 的Eleftherios Terry Papoutsakis教授贈予)及片段bioY-bioD-bioA(cac1360-cac1362)進行雙酶切，酶切3h後利用膠回收試劑盒純化回收酶切過的載體骨架以及bioY-bioD-bioA片段，之後利用solution I連接酶將酶切過的載體骨架以及bioY-bioD-bioA片段進行重組連接。16℃連接4h後，將連接產物轉化Top10感受態，塗布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固體平板。第二天挑取平板上長出的菌落進行菌落PCR驗證，將驗證正確的單菌落轉接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液體培養基中，培養過夜。第二天，利用質粒提取試劑盒抽取質粒，經SalI/KpnI酶切驗證正確後，將該質粒送測序公司測序，測序結果正確即獲得pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA質粒。
D：質粒Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB的獲取
將C中測序正確的pIMP1-Pthl-bioY-bioD-bioA質粒以及B中獲得的Pptb-bioB片段經過KpnI單酶切處理，分別回收酶切過的載體骨架以及Pptb-bioB片段，利用solution I連接酶將酶切過的載體骨架以及Pptb-bioB片段進行重組連接。16℃連接4h後，將連接產物轉化Top10感受態，塗布含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB固體平板。第二天挑取平板上長出的菌落進行菌落PCR驗證，將驗證正確的單菌落轉接至含有Amp+(100μg/ml)抗性的LB液體培養基中，培養過夜。第二天，利用質粒提取試劑盒抽取質粒，經KpnI酶切驗證正確後，將該質粒送測序公司測序，測序結果正確即獲得Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB質粒。
5)將Pthl-bioY-bioD-bioA-Pptb-bioB質粒(即pIMP1-Biotin)以及相應的對照質粒pIMP1-thl(只含有Pthl的空質粒)分別電轉至野生型揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)中得到Clj-Bio(生物素基因簇過表達菌株)以及EP(對照菌株)菌株；
6)將EP以及Clj-Bio分別接種至ATCC 1754培養基(添加生物素以及不添加生物素兩種培養基)中，在厭氧箱中進行37℃靜置發酵；
發酵條件：添加生物素的ATCC 1754培養基：發酵體積30ml，5％的接種量(v/v)，生物素添加濃度10μg/l，甲碸氯黴素5μg/ml。
不添加生物素的ATCC 1754培養基：發酵體積140ml，5％的接種量(v/v)，紅黴素10μg/ml。
7)在不同時間點進行發酵取樣，利用氣相色譜儀(890A,Agilent,Wilmington,DE,US)以及高效液相色譜儀(model 1200,Agilent)測定發酵液中的有機溶劑含量以及糖利用量。