LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用的製作方法

2023-04-26 13:48:06

LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用，本發明的白血病細胞為人早幼粒細胞白血病細胞HL-60或人單核細胞白血病細胞THP-1。本發明的LukS-PV蛋白可使用基因工程技術大量表達，可特異性與靶細胞結合，但不引起靶細胞溶解，分子量小，易於進行基因改造和化學修飾，並可望通過基因改造增強其誘導活性，減小毒副作用；實驗顯示LukS-PV在體外可以誘導HL-60細胞向髓單核細胞分化，誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化；LukS-PV在體內可以抑制白血病細胞生長，減少白血病細胞對肝臟、脾臟和外周血浸潤，有望成為一種新的白血病治療藥物，為細菌毒素開拓新的應用領域。
【專利說明】LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】，尤其涉及的是一種LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]白血病是一種全身性的疾病，因而不能像其他實體腫瘤一樣採取手術切除或放射治療。化學藥物是治療白血病的主要方法。但由於化療藥物的非特異性細胞毒性及不可避免的耐藥性，最終大部分病人會死於治療相關的凝血障礙、細菌感染或對藥物耐藥導致的疾病復發。探索白血病新的靶向化學治療藥物是臨床醫學研究的熱點。
[0003]白血病發病的分子生物學機制與細胞分化異常密切相關。誘導分化是治療白血病的新策略，該方法與傳統化學藥物治療的不同點在於不殺傷腫瘤細胞，而是誘導其向正常或接近正常的細胞分化，同時逆轉腫瘤細胞增殖、浸潤、轉移等惡性表型。全反式維甲酸(ATRA)為應用較為廣泛的分化誘導劑之一，已成功地應用於白血病的治療，但該藥在應用中可出現維甲酸綜合症、緩解後易復發及藥物耐受等問題，所以亟待尋找新的白血病治療誘導劑。
[0004]細菌毒素能夠與靶細胞特異性結合，一些毒素已被研究證明具有抗腫瘤的活性，如白喉毒素可用於治療T-細胞淋巴瘤，大腸桿菌產生的ST毒素能明顯抑制結腸和直腸腫瘤細胞的生長，產氣莢膜梭菌毒素可用於治療胰腺癌等。細菌毒素的藥物應用已引起人們的關注，這些毒素的抗腫瘤機制主要是誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖，有關細菌毒素誘導腫瘤細胞分化的研究尚未見報導。
[0005]金黃色葡萄球菌分泌的殺白細胞素，首先由Panton-Valetine發現並命名，故稱為 PV-殺白細胞素(Panton-Valetine leukocidin, PVL)，該毒素由 S 組分(LukS-PV)和 F組分(LukF-PV)組成。PVL屬於穿孔毒素，其靶細胞是中性粒細胞和巨噬細胞，作用機制是LukS-PV首先與靶細胞膜上特異的位點結合，LukF-PV再與LukS-PV結合，依次進行，形成一個環狀的八聚體結構，並插入靶細胞膜上，形成一個直徑大約為2nm的穿膜孔，使細胞穿孔溶解。前期有關PVL的大量研究均集中於細胞毒性及致病機制，顯示低濃度PVL可誘導靶細胞凋亡，高濃度可引起靶細胞溶解壞死。有關PVL是否可以誘導白血病細胞分化，並在體內具有抑制白血病細胞生長、浸潤和轉移的作用國內外尚未見報導。
[0006]誘導白血病細胞向正常細胞分化是治療白血病的新策略，但目前可用於臨床治療的分化誘導劑種類較少，主要為一些小分子化合物(維甲酸類，二甲基亞碸)和細胞因子。小分子化合物作用單一，如ATRA主要用於急性早幼粒細胞白血病的治療，對於其它類型的白血病療效較差，且部分患者在使用ATRA治療過程中可出現維甲酸綜合症、緩解後復發及藥物耐受等問題。細胞因子類分化誘導劑價格昂貴，難以用於臨床。
[0007]常文嬌等在Panton-Valentine殺白細胞素原核表達、純化及生物學活性鑑定,安徽醫科大學學報，2011Jan, 46 (I)中，以及高玉錄等在Panton-Valentine殺白細胞毒素(PVL) IukS-PV基因的克隆、原核表達及初步鑑定，安徽醫科大學學報，20080ct，43 (5)中，成功構建了 LukS-PV基因的表達載體BL21-pET28a-LukS-PV，經IPTG誘導表達和親和層析法獲得重組蛋白LukS-PV。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供了一種LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用，從而開拓LukS-PV蛋白應用的新領域。
[0009]本發明是通過以下技術方案實現的，本發明LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用。
[0010]作為本發明的優選方式之一，所述白血病細胞為人早幼粒細胞白血病細胞HL-60。
[0011]作為本發明的優選方式之一，所述白血病細胞為人單核細胞白血病細胞THP-1。
[0012]所述LukS-PV蛋白在體外抑制白血病細胞增殖，誘導白血病細胞定向分化。
[0013]所述LukS-PV蛋白在體內抑制白血病細胞生長，抑制白血病細胞向肝臟、脾臟及外周血浸潤。
[0014]本發明相比現有技術具有以下優點:本發明的LukS-PV蛋白分子量小，易於大量生產，易於進行基因改造和化學修飾，可特異性與靶細胞結合，但不引起靶細胞溶解，並可望通過基因改造增強其誘導活性，減小毒副作用；LukS-PV可以在體外抑制白血病細胞增殖，誘導細胞分化，在體內可以抑制白血病細胞生長，減少白血病細胞對肝臟、脾臟和外周血浸潤，實驗顯示LukS-PV可以誘導HL-60細胞向髓單核細胞分化，誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化；LukS-PV在體內可以抑制白血病細胞生長，減少白血病細胞對肝臟、脾臟和外周血浸潤，有望成為一種新的白血病治療藥物，為細菌毒素開拓新的應用領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是LukS-PV對HL-60細胞生長抑制作用的示意圖；
[0016]圖2是LukS-PV對HL-60細胞形態學影響的示意圖；
[0017]圖3是LukS-PV對THP-1細胞形態學影響的示意圖；
[0018]圖4是LukS-PV刺激後HL-60細胞表面分化抗原檢測結果示意圖；
[0019]圖5是LukS-PV刺激後THP-1細胞表面分化抗原檢測結果示意圖；
[0020]圖6是各組小鼠肝臟HE染色檢測結果示意圖；
[0021]圖7是各組小鼠脾臟HE染色檢測結果示意圖；
[0022]圖8是各組小鼠肝臟免疫組化染色檢測結果示意圖；
[0023]圖9是各組小鼠脾臟免疫組化染色檢測結果示意圖；
[0024]圖10是各組小鼠肝細胞懸液中⑶33+細胞比例示意圖；
[0025]圖11是各組小鼠脾細胞懸液中⑶33+細胞比例示意圖；
[0026]圖12是各組小鼠外周血中⑶33+細胞比例示意圖。
【具體實施方式】
[0027]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。[0028]實施例1
[0029]本實施例取處於對數生長期的HL-60細胞，調節細胞濃度至2X 105/ml，加入六孔板，每孔2 X IO5個細胞。分別用O、0.50、1.00 μ M濃度的LukS-PV處理HL-60細胞3、6、9、12h後，採用MTS法檢測細胞生長情況。
[0030]如圖1所示，結果顯示，正常對照組細胞生長抑制曲線呈水平狀，未見生長抑制現象。LukS-PV能夠顯著抑制HL-60細胞的生長，並呈時間-劑量依賴性，即劑量加大、時間延長，抑制作用更為明顯。
[0031]本實施例的人早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞，購於中科院上海細胞研究所。
[0032]實施例2
[0033]本實施例取處於對數生長期的HL-60細胞調節細胞濃度至2 X 105/ml，加入六孔板，每孔2 X IO5個細胞。分別經0、0.50 μ MU.00 μ M的LukS-PV作用細胞48h後，細胞懸液離心塗片，光鏡下觀察細胞形態學變化。
[0034]如圖2所示,採用Wright-Giemsa染色觀察LukS-PV對HL-60細胞形態學的影響，放大400倍，結果顯示，LukS-PV作用細胞48h後，光鏡下觀察，細胞形態學發生明顯變化。表現為細胞體積縮小，核仁消失，細胞核也明顯縮小，胞漿增多，染色質濃縮增粗，核漿比例縮小，核偏於一側。
[0035]其他實施方式和實 施例1相同。
[0036]實施例3
[0037]本實施例取處於對數生長期的THP-1細胞調節細胞濃度至2 X 105/ml，本實施例的人單核細胞白血病細胞株THP-1細胞，購於中科院上海細胞研究所。其他實施方式和實施例2相同。
[0038]如圖3所示，採用直接鏡檢觀察LukS-PV對THP-1細胞形態學的影響，放大400倍，LukS-PV作用細胞48h後，光鏡下直接觀察細胞形態學發生明顯變化。表現為細胞由圓形、懸浮變為梭形、粘附，呈貼壁生長。
[0039]實施例4
[0040]本實施例取處於對數生長期的HL-60細胞調節細胞濃度至2 X 105/ml，加入六孔板，每孔2 X IO5個細胞。分別經0,0.50 μ MU.00 μ M的LukS-PV作用細胞48h後，收集細胞懸液並用PBS緩衝液洗滌3遍，75%乙醇固定，過夜。固定後的細胞經PBS離心洗滌2次後重懸。之後細胞分別與⑶Ilb-FITC和⑶14-PE在4oC避光孵育25min，孵育後PBS洗滌I次，適量PBS重懸後，上流式細胞儀測定，cellquest軟體分析HL-60表面抗原陽性細胞的比例。
[0041]如圖4所示，用LukS-PV刺激細胞48h後，細胞表面⑶IIb和⑶14的表達率上升。LukS-PV主要誘導HL-60細胞向⑶Ilb+髓單核細胞系分化，LukS-PV具有誘導白血病細胞分化的作用，但是具體誘導分化方向與白血病細胞類型相關。
[0042]其他實施方式和實施例1相同。
[0043]實施例5
[0044]本實施例中，取處於對數生長期的THP-1細胞調節細胞濃度至2 X 105/ml，其他實施方式和實施例4相同。[0045]如圖5所示，LukS-PV主要誘導THP-1向⑶14+巨噬細胞系分化。
[0046]實施例6
[0047]本實施例取SCID小鼠，雄性，18~20g，連續兩天腹腔注射環磷醯胺(CTX，IOOmg/kg)後，將小鼠隨機分成5組(8隻/組)，包括:正常對照組、模型組和3個LukS-PV治療組(5 μ g/day, 10 μ g/day, 20 μ g/day)。第三天，將處於對數生長期的HL-60細胞通過腹腔注射接種於模型組和各個LukS-PV治療組小鼠，每隻小鼠注射100μ I (8X106+細胞/只)。正常對照組小鼠給予等體積的PBS緩衝液。
[0048]在細胞接種後第3天開始，正常對照組與模型組小鼠腹腔注射PBS緩衝液，治療組腹腔注射LukS-PV,劑量分別為5 μ g/day, 10 μ g/day, 20 μ g/day,每天給藥一次,連續3天。在治療後第3周，處死小鼠，觀察HL-60細胞在小鼠體內的生長情況。
[0049]結果顯示，處死小鼠時，模型組小鼠已形成明顯的肉眼可見的腹腔腫瘤。5yg/dayLukS-PV組小鼠形成的腹腔腫瘤體積較小。10 μ g/day>20 μ g/day LukS-PV組小鼠未形成腹腔腫瘤。結果表明LukS-PV在小鼠體內能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。
[0050]實施例7
[0051]本實施例中，在治療後第3周，每組各處死小鼠2隻，取肝、脾及外周血，使用HE染色、免疫組化染色及流式細胞術等方法檢測HL-60在小鼠體內浸潤和轉移情況。其他實施方式和實施例6相同。
[0052]如圖6和圖7所示，放大400倍後，HE染色檢測發現模型組小鼠肝細胞索排列紊舌L肝臟組織內可見散在和灶狀白血病細胞浸潤；脾小結結構不完整，紅髓破壞，可見大量粒系細胞浸潤且侵犯脾小結。LukS-PV治療後，肝、脾組織結構的破壞程度較小，白血病細胞浸潤明顯減少。如圖8~12所示，放大400倍後，免疫組化及流式細胞術檢測顯示小鼠肝、脾組織及外周血中⑶33+細胞比例下降。
[0053]由上述實施例可以看出，LukS-PV可以誘導HL-60細胞表面特異性抗原⑶I Ib表達增加，核漿比例縮小，向髓單核細胞分化；誘導THP-1細胞表面特異性抗原CD14表達增加，細胞呈梭形、貼壁生長，向巨噬細胞分化。LukS-PV可針對不同系白血病細胞誘導其向各自成熟的細胞系分化，顯示出了其誘導分化的細胞特異性，也暗示了其誘導分化的高效性，因此，LukS-PV在誘導白血病細胞分化治療中顯示出了巨大的應用潛力。
[0054]LukS-PV在體內可抑制腫瘤細胞生長、增殖、浸潤和轉移，其作用可能是通過誘導分化、促進凋亡等多種途徑、多個靶點完成。
[0055]LukS-PV可通過基因工程技術重組表達，分子量小，易於進行基因改造和化學修飾，可與特定的靶細胞結合，特異性強，效應穩定。
【權利要求】
1.LukS-PV蛋白在製備誘導白血病細胞分化藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述白血病細胞為人早幼粒細胞白血病細胞HL-60。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述白血病細胞為人單核細胞白血病細胞 THP-1。
4.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述LukS-PV蛋白在體外抑制白血病細胞增殖，誘導白血病細胞定向分化。
5.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述LukS-PV蛋白在體內抑制白血病細胞生長，抑制白血病細胞向肝臟、脾臟及外周血浸潤。
【文檔編號】A61K38/16GK103877563SQ201410134597
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】馬筱玲, 常文嬌, 單武林, 章成芳 申請人:安徽省立醫院