殼聚糖納米粒－pcDNA的製作方法
2023-04-26 07:08:56 1
專利名稱：殼聚糖納米粒－pcDNA的製作方法
技術領域：
本發明屬生物醫學工程領域，具體涉及一種殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體的構建。
背景技術：
殼聚糖是一種從蝦皮、蟹殼提取出來的天然高分子多糖，由氨基葡萄糖和N-乙醯-氨基葡萄糖以β-1.4甙鍵結合而成，其分子量一般為幾萬—幾十萬。殼聚糖高分子鍵上有許多游離氨基，在酸性條件下，這些游離氨基以發生質子化而使殼聚糖高分子帶有正電荷。殼聚糖有生物降解性、與人體有很好的生物相容性。殼聚糖還有生物粘附性、可用作載體，殼聚糖現已被廣泛應用於生物醫學領域，且顯示出良好的應用前景。
納米粒技術是當前材料學和物理學研究的熱點。納米粒製備技術大體上有物理和化學兩種方法。殼聚糖納米粒基因製備技術一般採用化學方法——凝聚法，其原理是用殼聚糖高分子在酸性條件下帶正電荷，而質粒核酸分子在鹼性條件下帶負電荷，兩者在一定條件下發生凝聚反應，成為殼聚糖納米粒基因複合體。但以往的納米粒製備技術所製備的納米粒的粒徑多在200nm以上，且製備程序繁瑣、成本高，因而應用受到限制。
根據殼聚糖的特性，用單凝聚法製備殼聚糖納米粒。殼聚糖是一種天然的陽離子多糖，本身不溶於有機溶劑，在殼聚糖高分子鏈上因有許多游離氨基，在酸性條件下有氨基發生質子化是殼聚糖分子帶正電荷，可用脫水劑硫酸鈉脫去殼聚糖分子表面的水化膜，導致溶解性下降，因而殼聚糖分子相互凝聚成粒子從其體系中析出。
組織工程的發展為組織器官缺損的生理性替代性修復提供了可能，但目前在組織工程產品的研究與開發中面臨著一個共同的問題，即當構建組織的厚度超過4mm時，中間的細胞成分就會因為血供無法到達而壞死，因此急需尋找一種新的方法來提高組織工程化組織的血管化水平。既往曾有研究將具有促進血管生成作用的細胞因子如血管內皮細胞生長因子(VEGF)等與支架材料複合，藉此提高組織工程化組織的血管化水平，但由於蛋白本身容易變性，與材料複合困難，容易失活，而且體內容易降解，應用效果並不理想。本發明對現有的殼聚糖納米粒製備技術進行了改進，並應用改進後的技術製備了殼聚糖納-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體。
發明內容
本發明的目的是提供一種殼聚糖納米粒-pcDNA3、1-hVEGF基因複合體的製造方法。其特徵在於用殼聚糖(Sigma)、硫酸鈉為原料，先用殼聚糖與硫酸鈉化混合製成殼聚糖納米粒，再與重組質粒pcDNA3.1-hVEGF構建成複合體本發明構建的納米粒-基因複合體的平均粒徑較小，在70-160nm之間，呈球形，使其在單位體積內粒數增多，比表面積增大，從而在相同體積內攜帶基因數量增多，適用於心肌等大塊組織的組織工程應用。
具體實施例方式
實施例1重組質粒pcDNA3.1-hVEGF的構建質粒pcDNA3.1是一種真核表達載體，該質粒構建有人巨細胞病毒啟動子，可以對插入的外源基因進行表述調控。該質粒自身載有hVEGF的基因編碼序列，在自身表達調控元件的作用下可以表達產生hVEGF。質粒多克隆位點上有17個酶切位點。用限制性內切酶可將BamHI和KpnI區域切開，然後用T4DNA連接酶與同樣經過BamHI和KpnI雙酶切處理的外源基因連接，使其置於人巨細胞病毒CMV啟動子控制下，這樣就構建成外源基因的真核表達載體(見附圖)。
實施例2殼聚糖納米粒的製備將一定濃度的殼聚糖溶液用1N的HCl調成pH5.5，從中取200ul和一定濃度的Na2SO4溶液200ul，加到殼聚糖溶液中，迅速用旋渦混合器混合30秒，即得殼聚糖納米粒懸液。
形態，粒徑和粒度分布測定目的是考察各因素對製備工藝的影響。取少量納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網上，靜置2分鐘，用濾紙吸乾混懸液，再滴加2％磷鎢酸負染2分鐘，於透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態。並對透射電鏡照片用刻度尺測量並根據放大倍數計算出粒經，每個樣品測量200-400粒子數，按統計學處理求的平均粒徑。粒度分布用跨距表示，其計算公式跨距＝(D90-D10)/D50其中D90、D50、D10分別為有90％、50％、10％的粒子數小於改制的粒徑。
影響殼聚糖的納米粒的因素殼聚糖濃度對平均粒徑的影響——隨殼聚糖濃度增大，平均粒經增大(見表1)。硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響——硫酸鈉濃度增大，平均粒徑線逐漸減小，當硫酸鈉濃度大於一丁時平均粒徑又開始逐漸增大(見表2)。溫度對平均粒徑的影響——溫度增大，平均粒徑也增大，其最適溫度為45℃～65℃(見表3)。pH對平均粒徑的影響——pH增大，平均粒經也增大，最適pH5.5(見表4)。
殼聚糖納米粒的平均粒徑為70～160nm之間，透射電鏡測定形狀比較規則，大多呈球形。
實施例3殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體的構建採用凝聚法製備(所述操作均在無菌條件下進行)先配製0.03％的殼聚糖(Sigma)溶液，用1N HCl調PH值到5.5，0.22μm濾膜過濾除菌。用75mM的Na2SO4(分析純，北京化工廠)溶液(0.22μm濾膜過濾除菌)溶解pcDNA3.1-hVEGF重組質粒，使其終濃度為200μg/ml。取200μl 0.03％殼聚糖溶液和200μl含重組質粒的75mM Na2SO4溶液分別置於55℃水溶液恆溫20分鐘。準確吸取200μl的Na2SO4溶液加到殼聚糖溶液中，迅速在旋渦混合器上混合30秒，製成殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF混懸液，低溫凍幹成納米粒，4℃保存備用。
殼聚糖濃度對平均粒徑的影響殼聚糖濃度對粒徑大小有顯著的影響，隨殼聚糖濃度增大，平均粒徑逐漸減小(見表5)。
質粒基因濃度對平均粒徑的影響質粒基因濃度對粒徑大小有顯著影響，隨著基因濃度增大，平均粒徑逐漸增大(見表6)。
硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響當硫酸鈉濃度大於10mM時，殼聚糖納米粒發生大片凝聚，而硫酸鈉濃度在5～10mM時對平均粒徑沒有影響(見表7)。
取適量重組殼聚糖納米粒懸液，加雙蒸水稀釋後用納米粒度分析儀測定其總平均粒徑、強度平均粒度、體積平均粒徑、數目平均粒徑以及多分散度。
本發明有益效果是利用該方法構建成重組質粒殼聚糖納米粒，其特點是，即製備的殼聚糖納米粒平均粒徑較小約在70～160nm質監，它明顯小於文獻報導的200nm以上的平均粒徑、納米粒數的單位體積增多、比表面積大、基因表達量高、使其所載的重組質粒基因充分發揮作用。它對心肌及大塊組織血管生成有促進作用。
表1殼聚糖濃度對平均粒徑的影響
表2硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響
表3溫度對平均粒徑的影響
表4pH對平均粒徑的影響
表5殼聚糖濃度對平均粒徑的影響
表6質粒基因濃度對平均粒徑的影響
表7硫酸鈉濃度對平均粒徑的影響
附圖pcDNA3.1hVEGF重組質粒
權利要求
1一種殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體的製造方法。其特徵是將人血管內皮細胞生長因子(hVEGF)基因插入到pcDNA3.1真核表達載體中，採用凝聚法製造殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體。
2權利要求1所述的hVEGF基因，其特徵是編碼區基因，含起始密碼子和終止密碼子。
3權利要求1所述的hVEGF基因，其特徵是採用RT-PCR的方法從人血管組織獲得，兩端分別設計不同的酶切位點。產物先克隆入PGEM-T載體，進行測序，以確保序列正確。
4權利要求1所述的hVEGF基因，其功能是能促進血管內皮細胞增生，形成新生血管。
5權利要求1所述的pcDNA3.1-hVEGF重組表達載體，其構建方法是將hVEGF編碼區序列插入到pcDNA3.1載體的多克隆位點。
6權利要求1中所述的凝聚法，其特徵是將0.03％殼聚糖溶液(PH5.5)和濃度200μg/ml的pcDNA3.1-hVEGF重組質粒(含75mM的Na2SO4)分別置於55℃水溶液恆溫20分鐘，然後分別取等量的溶液迅速混合，並劇烈振蕩。
7權利要求1中所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體，其特徵是平均粒徑在70-160nm之間，粒徑較小，比表面積大，單位體積的粒數較多。因而在體內基因表達量也會增多，為本發明的特點。
8權利要求1所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因複合體，其特徵是在體內質粒從複合體中緩慢釋放，轉染周圍細胞，產生hVEGF，促進血管增生，可以應用於心肌等大塊軟組織的組織工程，也可以應用於其他涉及需要改善局部血供的治療，以提高組織的血管化程度。
全文摘要
本發明涉及一種殼聚糖納米粒－pcDNA
文檔編號A61P9/00GK1566343SQ03148550
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月3日 優先權日2003年7月3日
發明者王常勇, 齊子榮, 郭希民, 段翠密, 孫志傑 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所